一種角質酶的突變體及其製備方法

2023-10-04 17:06:49 2

專利名稱：一種角質酶的突變體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種酶突變體及其製備方法，尤其涉及角質酶的突變體及其製備方
法，本發明屬於基因工程和酶工程領域，具體地說本發明是利用蛋白質工程的定點突變方法改善耐熱角質酶的底物特異性的技術。
背景技術：
角質酶是能夠水解角質大分子的水解酶。作為一種多功能酶，在紡織工業、食品工業以及化工工業等諸多領域都有著廣泛的應用。尤其在紡織工業中，角質酶可用於棉纖維生物精練，以去除棉纖維表面蠟質和角質，並有助於果膠、蛋白質等雜質的進一步去除，從而達到精練目的。近年來研究表明，角質酶還可用於合成纖維聚對苯二甲酸乙二酯(PET)的改性，增加織物吸水性，改善手感，提高織物品質。上述兩工藝目前均採用傳統鹼處理工藝，存在水耗、能耗大，排放廢水鹼性強、色度深、COD值高以及對纖維損傷大等弊病。酶精練工藝作為一種節能降耗、環境友好的紡織品清潔生產技術，已成為國內外染整行業發展的新趨勢。 國外對角質酶進行了大量的研究，主要集中於Fusarium solani等真菌來源角質酶。但真菌角質酶熱穩定性差，不適合在紡織工業中的應用。而本實驗室開發的嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)產耐熱角質酶可有效水解角質、PET等聚酯，但水解效率較低(陳堅，吳敬，陳晟. 一種耐熱角質酶及其編碼基因和表達.申請號200710026074. 2)。因此通過結構模擬確定突變位點，通過定點突變技術提高耐熱角質酶對角質和PET的催化效率極為重要，具有較強的工業應用價值。

發明內容
本發明所要解決的一個技術問題是提供一種角質酶的突變體，包括一個或兩個相應於嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的角質酶活性中心位點附近的胺基酸殘基的取代，與親代角質酶相比具有更強的角質或PET水解能力。 所述嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)產角質酶的基因與NCBI資料庫中
Thermobif idafusca編碼的蛋白Tfu_0883極其類似，基因全長906個核苷酸，編碼301個
胺基酸，和蛋白Tfu_0883的基因有兩個核苷酸的差異，編碼胺基酸相同(陳堅，吳敬，陳
晟. 一種耐熱角質酶及其編碼基因和表達.申請號200710026074. 2)。 所述角質酶突變體是218位胺基酸異亮氨酸lie突變為丙氨酸Ala，命名為
工218A。 所述角質酶突變體是是第132位胺基酸穀氨醯胺Gin和第101位胺基酸蘇氨酸Thr同時突變為丙氨酸Ala，命名為Q132A/T101A。 所述角質酶突變體是是第195位胺基酸色氨酸Trp和第249位胺基酸苯丙氨酸Phe同時突變為丙氨酸Ala，命名為W195A/F249A。 本發明的所要解決的另一個技術問題是提供上述突變體的製備方法。
為解決上述問題，本發明的技術方案是在嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶模擬結構的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物，以攜帶角質酶基因的載體為模板進行定點突變構建突變質粒I218A-pet20b(+) 、 W195/F249-pet20b (+) 、 Q132A/T101A-pet20b(+);將突變質粒轉化轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，挑選驗證後的陽性單克隆進行發酵培養，25t:恆溫培養至80h，對上清液進行硫酸銨沉澱、離子交換柱純化角質酶突變體I218A、 Q132A/T101A和W195A/F249A。所述攜帶角質酶的載體為pUC系列，pET系列，活pGEX中的任一一種。 本發明的有益效果本發明提供了一組具有纖維高催化效率的角質酶突變體及其
製備方法，1218A、Q132A/T101A和W195A/F249A對棉纖維的催化效率均有所提高，其中突變
體I218A對角質的催化效率比原角質酶提高50% ;Q132A/T101A對合成纖維對苯二甲酸乙
二酯(PET)的催化效率比原角質酶提高3倍。這三種突變體在紡織工業中有重要的應用價值。


圖1嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體純化SDS-PAGE電泳圖。 泳道1 :標準分子量蛋白； 泳道2 :I218A發酵液； 泳道3 :I218A純化製品； 泳道4 :W195A/F249A發酵液； 泳道5 :W195A/F249A純化製品； 泳道6 :Q132A/T101A發酵液； 泳道7 :Q132A/T101A純化製品。 圖2嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體角質水解活力分析。
△:嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶;□ :I218A ;■ :W195A/F249A ;▲:Q132A/T101A 圖3嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體PET水解活力分析。
△:嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶;□ :I218A ;■ :W195A/F249A ;▲:Q132A/T101A
具體實施例方式
實施例1 :嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體突變位點確定的方法。 角質等聚酯是由大量脂肪酸構成的疏水性大分子物質，角質酶活性中心周圍胺基酸的大小對聚酯大分子和活性中心的結合造成影響，此外胺基酸的疏水性影響底物結合位點和底物的結合，因此，以角質酶模擬結構為基礎，從以上兩方面出發，確定突變位點進而對角質酶基因進行定點突變。通過對嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶模擬結構的分析，設計三組突變系列(l)位於絲氨酸活性中心正上方的胺基酸異亮氨酸I218所佔空間較大，對活性中心和大分子底物的結合形成較大的位阻，因此將其突變為位阻較小的丙氨酸，以提高底物和活性中心的親和力；(2)位於絲氨酸活性中心兩側的芳香族胺基酸色氨酸W195和苯丙氨酸F249由於苯環的存在，也佔用大量空間，因此也將其突變為丙氨酸減少位阻效應；(3)位於活性中心附近的親水性胺基酸穀氨醯胺Q132和蘇氨酸T101對疏水性底物的結合力較差，將其突變為疏水性胺基酸丙氨酸以增加對疏水性底物的結合力，提高催化效率。 實施例2 :嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體的製備方法。 利用快速PCR定點突變方法構建I218A-pet20b (+) 、 W195/F249-pet20b (+)、
Q132A/T101A-pet20b(+)突變質粒。 I218A-pet20b(+) 、 W195-pet20b(+) 、 Q132A-pet20b (+)突變質粒的構建以CUT-pet20b(+)質粒為模板(陳堅，吳敬，陳晟. 一種耐熱角質酶及其編碼基因和表達.申請號200710026074. 2)，分別用工218A、 W195A和Q132A的突變引物通過一次PCR得到大小為4500bp左右產物，將PCR產物經Dpn I處理後轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，挑選轉化子測序驗證。 W195/F249-pet20b (+) 、Q132A/T101A-pet20b (+)突變質粒的構建分別以驗證正確的W195-pet20b(+)、Q132A-pet20b(+)質粒為模板，用F249A和T101A為突變引物，PCR擴增得到大小為4500bp左右產物，將PCR產物Dpn I處理後轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，挑選轉化子測序驗證。 測序驗證結果表明除了所需突變位點外，沒有出現隨機突變，因此突變質粒工218A-pet20b (+) 、 W195/F249-pet20b (+) 、 Q132A/T101A-pet20b (+)構建成功。
突變引物如下所示(方框為突變位點)
1、 I218A突變引物對
PI218A1 :5' -GCCGACCTCGACACG |gcc| GCGCCGTCGCCACG-3，
PI218A2 :5' -CGTGGCGACCGGCGC jggc| CGTGTCGAGGTC-3'
2、 W195A突變引物對:
PW195A1 :5' -ATCCCGCTCACCCCG:gcg CACCTCAACAAGAAC-3，
PW195A2
3、 F249APF249A1
PF249A2
4、 Q132APQ132A1
PQ132A2
5、 T101APT101A1
:5' -GTTCTTGTTGAGGTG |cec|' CGGGGTGAGCGGGATGG-3 ，突變引物對
:5' -gACGGCGCAACCCAC LgCC GCCCCGAACATCC-3，:5' -GGATGTTCGGGGC,c
GTGGGTTGCGCCGTC-3，
突變引物對
5， -CATCACCACCCTCGAC'GCG' CCGGACAGCCGGGCAg-3
:5' -CTGCCCGGCTGTCCGG i|cgc| GTCGAGGGTGGTGATG-3'突變引物對
:5' -GATCTCCCCCGGCTAC:ggc GGCACTGAGGCTTC-3， PT101A2 :5' -GAAGCCTCAGTGCC
上述PCR體系均為
GGC
GTAGCCGGGGAGATC-3，
組分體積(PL)2 X PrimeSTARTMGC Buffer (含Mg2+)25d證Mixture (2. 5mM)4PI1P21質粒1PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ii 1) 0. 5ddH2017. 5上述PCR條件均為94t:預變性4min，然後進行以下循環:98"C變性10s，60。C退火5s，72。C延伸4min ;
30個循環；72。C延伸10min，4。C保溫。 實施例3 :嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體的表達純化方法。
將突變質粒I218A-pet20b(+) 、 W195/F249-pet20b (+) 、 Q132A/T101A-pet20b (+)轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，挑選轉化子進行測序驗證。將驗證後的陽性轉化子在TB培養基(甘油5g/L，蛋白腖12g/L，酵母膏24g/L， K2HP04 1 2 . 54g/L， KH2P04 2. 31g/L)中37°C液體培養過夜，後接入TB發酵液體培養基37t:培養3h後用4mg/L IPTG (異丙基硫代P D半乳糖苷)誘導，降溫至25t:恆溫培養80h。 發酵液於4t:，10000rpm離心20min除菌體。上清液通過活性炭柱收集。在通過活性炭柱的清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，41:， lOOOOrpm離心20min，取沉澱物用適量緩衝液A(20mM Tris-HCl，pH 8)溶解，加入20%硫酸銨，0. 22 y m膜過濾後製成上樣樣品。Phenyl HP疏水柱用加入20%硫酸銨的緩衝液A平衡後，將上樣樣品吸入疏水柱，使之完全吸附後，分別用含20%硫酸銨的緩衝液A、20% _0%硫酸銨梯度的緩衝液A、緩衝液A和去離子水洗脫，流速lmL/min，檢測波長為280nm，洗脫液分部收集。酶活力部分用緩衝液A平衡的DEAE S印harose陰離子交換柱進行進一步純化，洗脫流速lmL/min，收集酶活力組分，用10000道爾頓膜離心濃縮，得純化角質酶突變體。純化后角質酶突變體達到電泳純，表觀分子量30KDa。純化結果如圖1所示。 實施例4 :嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶突變體對角質或PET水解的效率。 角質酶對角質的水解效果測定使用如下方法反應體系包括1% (w/v)蘋果角質、25mM磷酸鉀緩衝液(pH 8. 0) 、 lmg酶液，6(TC保溫，不同時間取樣，用0. 02M NaOH溶液滴定生成的脂肪酸。 角質酶對PET的水解效果測定使用如下方法反應體系為10ml，包括0. 3g PET、25mM磷酸鹽緩衝液(pH 8. 0)、0. lmg酶液，150rpm 60。C保溫72h以上，保溫過程中取樣進行RP-HPLC分析。水解活性通過水解產物的總和進行計算。水解產物對苯二甲酸(TPA)、單(對苯二甲酸-2-羥基乙酯)(MHET)、二 (對苯二甲酸-2-羥基乙酯)(BHET)、1，2-乙烯基-單對苯二甲酸-單(對苯二甲酸-2-羥基乙酯)(EMT)通過LC-MS進行定量分析。
如圖2所示，I218A、 W195A/F249A和Q132A/T101A突變體水解角質的能力較未改造嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶有明顯的提高。其中W195A/F249A在水解過程的前期水解角質速度較快，並很快達到平衡；I218A和Q132A/T101A角質水解效率比原酶分別提高50%和20%。 如圖3所示，Q132A/T101A突變體水解PET的能力較未改造嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)角質酶有明顯的提高，水解效率達原酶的3倍。
權利要求
一種角質酶的突變體，其特徵是包括一個或兩個相應於嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)的角質酶活性中心位點附近的胺基酸殘基的取代。
2. 權利要求1所述的突變體，其特徵是第218位胺基酸異亮氨酸lie突變為丙氨酸Ala，命名為I218A。
3. 權利要求1所述的突變體，其特徵是第132位胺基酸穀氨醯胺Gin和第101位胺基酸蘇氨酸Thr同時突變為丙氨酸Ala，命名為Q132A/T101A。
4. 權利要求1所述的突變體，其特徵是第195位胺基酸色氨酸Trp和第249位胺基酸苯丙氨酸Phe同時突變為丙氨酸Ala，命名為W195A/F249A。
5. 權利要求1所述的突變體的製備方法，其特徵是在嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)角質酶模擬結構的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物，以攜帶角質酶基因的載體為模板進行定點突變構建突變質粒；將突變質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，挑選驗證後的陽性單克隆進行發酵培養，25t:恆溫培養至80h，對上清液進行硫酸銨沉澱、離子交換柱純化角質酶突變體I218A、 Q132A/T101A和W195A/F249A。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述攜帶角質酶的載體為pUC系列，pET系列，或pGEX中的任——種。
全文摘要
本發明提供了一種嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)角質酶的突變體及其製備方法，突變體包括一個或兩個相應於嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)的角質酶活性中心位點附近的胺基酸殘基的取代，I218A、Q132A/T101A和W195A/F249A對棉纖維的催化效率均有所提高，其中突變體I218A對角質的催化效率比原角質酶提高50％；Q132A/T101A對合成纖維對苯二甲酸乙二酯(PET)的催化效率比原角質酶提高3倍，這三種突變體在紡織纖維前處理中有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N9/16GK101775382SQ20091026099
公開日2010年7月14日 申請日期2009年12月18日 優先權日2009年12月18日
發明者吳丹, 吳敬, 陳堅, 陳晟 申請人:江南大學