火木層孔菌中環二肽c8在抗禽流感h5n1病毒上的應用的製作方法

2023-10-19 04:49:57 3

火木層孔菌中環二肽c8在抗禽流感h5n1病毒上的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種從火木層孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel（裂蹄木層孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鮑氏層孔菌Phellinusbaumii、哈蒂針層孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）發酵液和子實體中分離的具有抗禽流感活性的一種環二肽C8。本發明首次公開了一種環二肽的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。本方法較一般化合物應用的優點在於：發現了這種環二肽的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【專利說明】火木層孔菌中環二肽C8在抗禽流感H5N1病毒上的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質的提取製備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已於2013年8月26日保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為CGMCC N0.8108，分類名稱為火木層孔菌Phellinusigniarius，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
【背景技術】
[0002]通常生物學中所指的環肽是指以胺基酸肽鍵形成的化合物，在植物化學中這一概念被擴大成以醯胺鍵形成的一類化合物，因此範圍被擴大至包括有機胺類和大環生物鹼類，根據成環與否分為環肽和直鏈肽。已報導的環肽類化合物具有多方面的生物活性，包括抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗瘧、安眠、抑制血小板聚集、降壓、抑制酪氨酸酶、抑制環氧化酶、抑制脂質過氧化酶、雌性激素樣、免疫抑制等生物活性。
[0003]由於環肽的前體-直鏈肽所包含的胺基酸的數目和種類的千差萬別，造成了環肽合成方法的多樣化。對某種直鏈肽表現出高效，快速縮合作用的試劑和方法對另外一種肽鏈就可能變得低效或無效。
[0004]一種環二肽具有抗菌等多種重要的生理活性，如今，未見到有抗情流感病毒活性的報到。

【發明內容】

[0005]本發明公開了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的一種環二肽CS。本發明首次公開了這種一種環二肽的一種新活性，證明其具有抗禽流感作用。
[0006]本方法較一般化合物應用的優點在於:發現了該種一種環二肽CS的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
[0007]本發明的技術方案如下:
首先製備火木層孔菌粗提物，由下述方法製得:
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:
玉米澱粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白腖 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%
(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20~35°C溫度，搖瓶轉速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養7~15天；培養中當pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20~35°C，發酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方釐米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉/分的條件，培養7~15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液製備火木層孔菌粗提物。
[0008](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ；(4)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮後的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90%，乙醇優選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優選為濃縮液體積的3-6倍；
(5)對步驟(4)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規方法進行分離，並通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍乾燥的方法進行乾燥，得火木層孔菌粗提物。
[0009]然後從火木層孔菌粗提物中環二肽CS，步驟如下:火木層孔菌粗提物一正相矽膠層析一甲醇梯度洗脫一正相矽膠層析一甲醇凝膠一常壓反相製備一HPLC檢測—1D-HNMR^ 環二肽 C8。
[0010]具體方法為:
(1)製備火木層孔菌粗提物；
(2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相矽膠混勻攪拌，並乾燥，進行矽膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次；
(3)收集上述步驟(2)得到的最後一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫；
(4)將步驟(3)得到的產物進行正相矽膠層析，用洗脫劑洗脫； (5)收集洗脫液，適當合併，減壓蒸乾，進行甲醇凝膠層析；
(6)將步驟(5)得到的產物進行常壓反相層析，洗脫劑為甲醇與水；
(7)HPLC檢測，減壓乾燥，即為環二肽C8。
[0011]優選的，提取步驟(2)中所述的拌樣矽膠為100-200目正相矽膠，洗脫劑為氯仿和/或甲醇。
[0012]提取步驟(3)中所述的洗脫劑為甲醇。
[0013]提取步驟(4)中所述的正相矽膠為200-300目，洗脫劑為氯仿與甲醇。
[0014]提取步驟(5)中所述的凝膠類型為LH-20。
[0015]提取步驟(6)所述的反相材料為C-18或者C-8使用常壓反相製備；洗脫劑為甲醇:水=40%-85% ;反相層析次數為1-3次。
[0016]提取步驟(7)所述的HPLC條件為Omin:95%水，IOmin:100%甲醇，出鋒時間為
5.85-6.54min。
[0017](四)【具體實施方式】 實例1:
火木層孔菌粗提物，由下述方法製得:
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:
玉米澱粉 1%葡萄糖 1%
蛋白腖 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸鎂 0.1%磷酸二氫鉀0.0 1%
(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以25°C溫度，搖瓶轉速為110r/min，pH 7條件下，震動培養7天；培養中當PH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度25°C，發酵罐壓力0.1公斤/平方釐米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉/分的條件，培養7天，即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液製備火木層孔菌粗提物。
[0018](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/3 ；
(4)用體積百分比為70%的乙醇對上述步驟(3)濃縮後的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到55% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在70°C條件下，加熱I小時；以常規方法進行分離，並通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍乾燥的方法進行乾燥，得火木層孔菌粗提物。
[0019]稱取300g粗提物與等體積的100目正相矽膠混勻，矽膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相矽膠，柱高1.5m,直徑20cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=200:1, 100:1,40:1分別洗脫4，5，5，5個柱體積。將最後一次的洗脫液適當合併，減壓蒸乾，進行甲醇凝膠層析。收集洗脫液，適當合併，與等體積矽膠拌樣，層析固定相使用的矽膠為200—300目正相矽膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。收集洗脫液，進行甲醇凝膠柱層析。然後，進行常壓反相製備，A相為水，B相為甲醇。收集洗脫液，減壓蒸乾，HPLC檢測，條件為Omin:95% 7jC, IOmin:100%甲醇，出鋒時間為5.95min適當合併，進行1D-HNMR核磁共振分析，頻率為 400MHZ，分析結果為 δ 7.30 (s, 1H)，4.06 (dd, J = 15.8, 10.2 Hz, 2H)，3.87(dd, J = 16.5，4.4 Hz, 1H)，3.65 - 3.48 (m, 2H)，2.42 - 2.26 (m, 1H)，2.03(dddd, J = 16.1, 13.3, 8.0, 5.2 Hz`, 3H)，1.95 - 1.81 (m, 1H).證明是((8aS)-六氫吡咯並[l，2-a〕吡嗪-1，4 - 二酮。
[0020](7)採用步驟(6)得到的化合物進行對MDCK細胞毒性的測定，確定其半數中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。
[0021]在96孔板上，100 μ I/孔加入4X IO5Iiir1濃度的MDCK細胞懸液，培養24 h後，在單層細胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重複3孔，並設正常細胞對照。置370C，5%C02培養箱中培養48 h後，棄培養液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的維持液，繼續培養Ih後，棄MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振蕩5_10 min，待結晶完全溶解，酶標儀測492nm處的OD值。計算出樣品的半數中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。當加樣組的OD492值不顯著低於細胞對照組OD492時，此濃度即為樣品的最大安全濃度。
[0022]環二肽C8各質量濃度組(n=12)
序號I密度(Ug.mL-1) I病變率
1_200_0.9598678178
21000.92710166904
3500.71856672229
4250.33731099139
512.50.14985814036
I細胞對照
由表1知:環二肽C8最大安全濃度為12.5ug/mL。
[0023]實例2:火木層孔菌粗提物，由下述方法製得:
(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是:
玉米澱粉 3%葡萄糖 2%
蛋白腖 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸鎂 0.5%磷酸二氫鉀0.05%
(2)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以30°C溫度，搖瓶轉速為180r/min，pH6條件下，震動培養15天；培養中當PH值降到2.5時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度30°C，發酵罐壓力0.2公斤/平方釐米，pH3，通氣量0.5-1.1vvm,攪拌速度180轉/分的條件，培養15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發酵全液製備火木層孔菌粗提物。
[0024](3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5 ；
(4)用體積百分比為90%的乙醇對上述步驟(3)濃縮後的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的4倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到70% ；
(5)對步驟(4)所得提取液在55°C條件下，加熱2.5小時；以常規方法進行分離，並通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/10 ;
(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍乾燥的方法進行乾燥，得火木層孔菌粗提物。
[0025]稱取100g粗提物與等體積的100目正相矽膠混勻，矽膠正相柱層析。層析固定相為200-300目正相矽膠，柱高0.Sm，直徑14cm，洗脫劑為分別為氯仿，氯仿:甲醇=200:1, 100:1, 40:1分別洗脫3，4，4，4個柱體積。將最後一次的洗脫液適當合併，減壓蒸乾，進行甲醇凝膠層析。收集洗脫液，適當合併，與等體積矽膠拌樣，層析固定相使用的矽膠為200—300目正相矽膠。洗脫劑為氯仿與甲醇。收集洗脫液，進行甲醇凝膠柱層析。然後，進行常壓反相製備，A相為水，B相為甲醇。收集洗脫液，減壓蒸乾，HPLC檢測，條件為Omin:95% 7jC, IOmin:100%甲醇，出鋒時間為5.93min適當合併，進行1D-HNMR核磁共振分析，頻率為 400MHZ，分析結果為 δ 7.30 (s, 1H)，4.06 (dd, J = 15.8, 10.2 Hz, 2H)，3.87(dd, J = 16.5，4.4 Hz, 1H)，3.65 - 3.48 (m, 2H)，2.42 - 2.26 (m, 1H)，2.03(dddd, J = 16.1, 13.3, 8.0, 5.2 Hz, 3H)，1.95 - 1.81 (m, 1H).證明是((8aS)-六氫吡咯並[l，2-a〕吡嗪-1，4 - 二酮。
[0026](7)採用步驟(6)得到的最大安全濃度範圍內進行樣品在MDCK細胞水平上對H5N1毒株的作用，計算樣品的半數毒性濃度(CC5tl)和半數有效濃度(EC5tl),得到樣品的選擇指數
(SI)=CC50 / EC5tl，計算抑制率。
[0027]試驗中，設置正常細胞對照組(只加細胞維持液)，病毒對照組(只加病毒液)，質量濃度在無毒範圍內2倍稀釋4個質量濃度，設置3孔重複。棄96孔細胞培養板孔內上清，loo μ I/孔加入1000tcid5q病毒液(ιο_4 43)，設置3個重複。37°c吸附2 h，棄病毒液上清，100 μ I/孔加入不同濃度的樣液。置37°C，5% CO2培養箱中繼續培養48h。採用MTT法測定OD492值，計算半數有效濃度(EC5tlX當加樣組的OD492值顯著大於病毒對照組OD492時，表明此樣液能夠顯著抑制病毒感染MDCK，具有抗病毒的活性。[0028]根據計算出的細胞病變率和病毒抑制率。用統計學軟體SPSS11.5的Probit回歸法，計算樣品的半數毒性濃度(CC5tl)和半數有效濃度(EC5tl),得到樣品的選擇指數(SI)=CC50 / EC500
[0029]根據下公式計算病毒抑制率:
病毒抑制率=(A-B) / (C-B) X 100%
A:樣液處理組OD值，B:病毒對照組OD值，C:細胞對照組OD值 表2化合物對H5N1病毒的抑制作用實驗結果
【權利要求】
1.環二肽CS在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於所述環二肽CS為((8aS)-六氫吡咯並[l，2_a〕吡嗪_1，4 - 二酮。
2.如權利要求1所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於環二肽CS是從火木層孔菌中提取的，提取步驟順序如下: (1)製備火木層孔菌粗提物； (2)將上述步驟(1)所得的粗提物與正相矽膠混勻攪拌，並乾燥，進行矽膠正相柱層析，用洗脫劑洗脫2-5次； (3)收集上述步驟(2)得到的最後一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫； (4)將步驟(3)得到的產物進行正相矽膠層析，用洗脫劑洗脫； (5)收集洗脫液，適當合併，減壓蒸乾，進行甲醇凝膠層析； (6)將步驟(5)得到的產物進行常壓反相層析，洗脫劑為甲醇與水； (7)HPLC檢測，減壓乾燥，即為環二肽C8。
3.如權利要求2所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於所述火木層孔菌粗提物，由下述方法製得: (1)將火木層孔菌菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20~35°C溫度，搖瓶轉速為80~280r/min，pH 3~8條件下，震動培養7~15天；培養中當pH值降到2.5~4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20~35°C，發酵罐壓力0.1~0.2公斤/平方釐米，pH 3~8，通氣量0.5~1.lvvm,攪拌速度100~280轉/分的條件，培養7~15天，即可得到火木層孔菌菌絲體發酵全液； (2)取步驟(1)中所得火木層孔菌菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2~1/5 ； (3)用體積百分比為60~95%的乙醇對上述步驟(2)濃縮後的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2~8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60~90% ； (4)對步驟(3)所得提取液在50~70°C條件下，加熱I~2小時；以常規方法進行分離，並通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5~1/10 ； (5)將將步驟(4)所得的濃縮液以低溫冷凍乾燥的方法進行乾燥，得火木層孔菌粗提物。
4.如權利要求3所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於所述液體培養基配方以克/100毫升計是: 玉米澱粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白腖 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸鎂 0.1-0.5%磷酸二氫鉀0.01-0.05%。
5.如權利要求3所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於火木層孔菌粗提物製備步驟(3)的乙醇為濃度65%-95%食用乙醇，所用體積為3-6倍體積。
6.如權利要求2所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於，步驟⑵中所述的拌樣矽膠為100-200目正相矽膠，洗脫劑為氯仿和/或甲醇；步驟(3)中所述的洗脫劑為甲醇。
7.如權利要求2所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於，步驟(4)中所述的正相矽膠為200-300目，洗脫劑為氯仿與甲醇。
8.如權利要求2所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於，步驟(5)中所述的凝膠類型為LH-20。
9.如權利要求2所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於，步驟(6)所述的反相材料為C-18或者C-8使用常壓反相製備；洗脫劑為甲醇:水=40%-85% ;反相層析次數為1-3次。
10.如權利要求2所述的環二肽C8在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於，步驟⑵所述的HPLC條件為Omin:95%水，IOmin: 100%甲醇，出鋒時間為.5.85-6.54min。
【文檔編號】A61K31/4985GK103800333SQ201310401670
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】趙晨, 宋愛榮, 孔超, 黃芳, 秦丹 申請人:青島農業大學