一種用比色法測定生物組織內草醯乙酸含量的方法

2023-10-19 17:08:32

專利名稱：一種用比色法測定生物組織內草醯乙酸含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種草醯こ酸的測定方法，屬於有機酸代謝物生物化學檢測領域。
背景技術：
草醯こ酸是三羧酸循環中間體之一，也是生物代謝中的ー個重要物質。在體內是以羧酸根離子的形式存在。草醯こ酸在生物體的碳、氮代謝起著重要的作用。草醯こ酸可以發生α轉氨基作用，形成天冬氨酸，並進一歩合成多種胺基酸，從而參與氮代謝；草醯こ酸與こ醯輔酶A縮合，形成檸檬酸，這是三羧酸循環中的關鍵反應之一，也是啟動循環的一步，是碳代謝的主要中間物質；另外，草醯こ酸還參與糖異生作用；參與三羧酸循環的碳回補作用等等。總之，草醯こ酸在生物體的碳氮代謝和能量代謝過程中起著不可缺少的作用。測定草醯こ酸的含量對於理解細胞內的碳氮代謝過程具有重要的意義。
目前，草醯こ酸的測定主要有兩類方法一類是高效液相色譜法(見分析化學，2005，33 :527-530)，該方法測定精度高，檢測限低，但是液相色譜儀比較昂貴，多數實驗室沒有該設備；另ー類就是基於酶偶聯比色測定的方法其中ー種方法是將草醯こ酸在蘋果酸脫氫酶的作用下形成蘋果酸，這ー過程需要NADH作為輔酶，形成MD，而NADH在340nm具有特異的吸收峰，通過測定NADH的量,可以計算草醯こ酸的含量(見Arch BiochemistryBiophysics 1976,175:39-53)。另ー種方法就是將草醯こ酸在草醯こ酸脫羧酶作用下，形成丙酮酸，然後利用丙酮酸的酶聯測定方法測定丙酮酸的含量(見ClinicalBiochemistry 2006, 39 :74-77),從而推算草醯こ酸的含量。即用丙酮酸氧化酶將丙酮酸氧化形成過氧化氫，再利用過氧化物酶將過氧化氫轉化為氧氣和水，在這ー過程中加入ー特異的電子受體，被氧化後形成粉紅色物質，570nm比色法或用螢光(Ex/Em = 535/587)檢測方法可以測定草醯こ酸的含量。利用酶法偶聯就需要購買較昂貴的生化酶和相應的底物，而且測定步驟較多。目前，缺乏快速準確地測定組織、器官中草醯こ酸的含量的方法。

發明內容
本發明的目的是提供ー種寬範圍、成本低、便於普及的測定生物組織和器官中草醯こ酸含量的方法。本發明是通過如下步驟實現的草醯こ酸與固紫B(Fast Violet B)直接反應形成一種穩定的紅色的微溶於水的物質。反應一定時間後，加入有機溶劑，充分溶解紅色的物質。然後利用分光光度計直接測定以上混合物在520nm的吸光值，根據草醯こ酸標準樣品製作的標準曲線即可得到未知樣品草醯こ酸的濃度。用於溶解草醯こ酸和固紫B反應生成的紅色物質的有機溶劑可以是こ醇、丙酮或甲醇中的ー種。
固紫B用去離子水直接溶解，現配現用。濃度範圍為2-50mg/mL，樣品草醯こ酸含量高時使用低濃度固紫B，樣品草醯こ酸含量低時使用高濃度固紫B;製作標準曲線和樣品測定須使用同樣濃度的固紫B。
本發明利用草醯こ酸的直接顯色方法替代常規生化方法中需要其他酶進行偶聯再比色的方法來測定草醯こ酸的含量。測量的步驟更加簡便，測定更加迅速，在25分鐘就可以完成測定，所需的設備也比較簡單，所需的藥品種類少，測定成本低。


圖I本發明提供的方法利用草醯こ酸標準樣品測定的低濃度範圍標準曲線圖2本發明提供的方法利用草醯こ酸標準樣品測定的高濃度範圍標準曲線
具體實施例方式以下結合具體實例進ー步說明本發明。實施例一低濃度草醯こ酸標準曲線的製作稱取O. 132克草醯こ酸，用50mL去離子水溶解，定容至IOOOmL,得到ImM的草醯こ酸母液。按照表I配製標準曲線製作所需的各種濃度的草醯こ酸樣品。表I低濃度草醯こ酸標準曲線製作(IOO-IOOOuM)
權利要求
1.一種用比色法測定生物組織內草醯乙酸含量的方法，其特徵在於草醯乙酸與固紫B反應形成穩定的紅色沉澱，加入有機溶劑，充分溶解沉澱物，測定溶液在520納米的吸光值，根據草醯乙酸標準樣品製作的標準曲線即可得到樣品草醯乙酸的濃度。
2.如權利要求I所述的測定草醯乙酸含量的方法，其特徵在於所述的有機溶劑指乙醇、丙酮或甲醇中的一種。
3.如權利要求I所述的測定草醯乙酸含量的方法，其特徵在於所述標準曲線包含低濃度範圍和高濃度範圍兩種，分別為O-ImM和10-100mM。
4.如權利要求I所述的測定草醯乙酸含量的方法，其特徵在於所述的固紫B的濃度範圍為 2_50mg/mL。
全文摘要
一種用比色法測定生物組織內草醯乙酸含量的方法，利用草醯乙酸與固紫B結合形成紅色沉澱物質，加入有機溶劑溶解沉澱後，520nm比色法測定吸光值，根據標準曲線計算樣品中草醯乙酸的含量。本發明用草醯乙酸的直接顯色反應替換常規方法中的酶聯顯色，使測定過程更加簡便，實用，檢測成本也更加低廉。
文檔編號G01N21/82GK102680415SQ20111006272
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月16日 優先權日2011年3月16日
發明者丁在松, 周寶元, 黃素華 申請人:中國農業科學院作物科學研究所