秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法

2023-10-19 15:08:22 2

秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法
【專利摘要】本發明提出了一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，包括：種子DNA的直接提取；PCR擴增反應；所述PCR反應的體系中1對SSR引物有兩種選擇，一種選擇序列為正向引物5』-CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3』和反向引物5』-GCACAAGGTGAGCAGTCC-3』；另一種選擇序列為正向引物5』-CAAAAACAGAGCAGATGAC-3』和反向引物5』-CTCAAGATGGACGCCAAGA-3』；凝膠電泳檢測；種子純度計算。本發明的鑑定方法具有準確、簡單和快速的特點。
【專利說明】秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及種子檢測【技術領域】，特別是指一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法。
【背景技術】
[0002] 秈粳雜交稻是利用水稻秈粳雜交集聚亞種間有利基因選育綜合性狀優良的強優勢雜交水稻組合，是我國雜交水稻育種研究的戰略重點，將在穩定我省糧食總量，保障口糧安全，促進農民增產增收發揮重要作用。
[0003]秈粳交水稻種子中含有大量澱粉(65%_70%)、蛋白質(7%_9%)及脂肪(2%_3%)，這些物質的存在很大程度上影響了種子內直接提取的DNA的質量。現在傳統的做法是將種子進行標準發芽，等幼苗長到一定大小後在幼苗葉片中提取種子的DNA，這種方法大大延長了DNA提取的周期，從而降低了室內分子標記鑑定種子純度快速高效性。
[0004]種子真實性和純度是雜交水稻種子質量的核心指標，是種子質量分級的主要標準，是企業購銷種子的關鍵依據，優良品種種子混雜，純度降低將阻礙品種優良遺傳性能的充分發揮，導致作物產量和質量的明顯降低，不僅對生產、銷售產生巨大影響，還將給國家、政府、農民造成重大損失。隨著作物選育品種數目的增多及育種材料遺傳基礎的日益狹窄，使得品種間的遺傳差異越來越小，導致品種真實性和純度鑑定的難度不斷加大。因此，建立一套簡便、快捷、經濟、準確的品種真實性和純度鑑定技術體系是保護育種者的智慧財產權、打擊假冒偽劣種子、規範種子市場和促進我國種子產業參與國際競爭的迫切需要。DNA分子標記反映了 DNA水平上生物個體間的遺傳差異，具有數量豐富、多態性高、不受環境影響、檢測快速等優點而逐漸得到應用(李召華等，2006)。其中，SSR(simple sequence repeat)標記因為多態性好、重複性高、操作簡便，被認為是一種發展前景看好的DNA指紋技術。SSR分子標記是由Moore等於1989年創建的一種基於特異引物PCR技術的分子標記(Moore等，1991)，屬於共顯性標記，具有多態性豐富，操作簡單，重複性好等優點，檢測結果準確可靠，重複性好，操作簡便、快速，且對DNA數量及質量要求不高，廣泛應用於遺傳圖譜構建、比較基因組研究、遺傳多樣性分析和種質鑑定等方面，是目前最受歡迎的DNA指紋圖譜技術之一。SSR分子標記技術在雜交水稻種子純度鑑定中的應用，已小範圍應用於種子純度檢測實踐(李召華等，2006)。彭鎖堂等(2003)用引物RM17對雜交稻組合汕優63和兩優培九進行了 SSR鑑定；Nandakumar等(2004)利用SSR分子標記成功構建4個水稻品種及其親本的指紋圖譜，並成功用於品種的純度鑑定。肖小餘等(2006)從208對引物中篩選出具有多態性的引物123對，建立了四川省主要雜交水稻親本的DNA指紋資料庫。本研究從DNA提取、PCR反應體系和程序及凝膠電泳等方面進行了技術體系的優化，建立了準確、簡單、快速、成本低廉的快速鑑定秈粳交水稻種子純度的技術體系。

【發明內容】

[0005]本發明提出一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，解決了現有技術中種子真實性和純度的問題。
[0006]本發明的技術方案是這樣實現的:
[0007]一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，包括:
[0008]( I)種子DNA的直接提取(無需發芽)；
[0009](2) PCR 擴增反應；
[0010]所述PCR反應的體系中I對SSR引物有兩種選擇，一種選擇序列為正向引物5，-CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3 』和反向引物
[0011]5，-GCACAAGGTGAGCAGTCC-3，；
[0012]另一種選擇序列為正向引物5』 -CAAAAACAGAGCAGATGAC-3』和反向引物5， -CTCAAGATGGACGCCAAGA-3，；
[0013](3)凝膠電泳檢測；
[0014](4)種子純度計算；
[0015]兼有父母特徵主帶的種子為目標種子，計數；
[0016]計算公式如下:受檢種子批種子純度(％)=受檢種子中兼有父母本特徵帶型種子數/受檢種子總數X100。
[0017]作為優選的技術方案，所述`步驟(1)種子DNA的直接提取的步驟如下:將秈粳交雜交水稻種子剝去稃殼後放入離心管內；在組織磨樣機上打磨30s ;先後加入400 μ I提取液和120μ 15mol/L醋酸鉀；混勻後在4°C環境下靜置10_15min ;25°C下12000rpm離心10min-15min ;取上清，先後加入無水乙醇400 μ I和3mol/L醋酸鈉15μ I ;25°C下12000rpm離心10min_15min後去上清；加入400 μ 170%無水乙醇洗漆；4°C下12000rpm離心4min-6min ;倒去上清，晾乾後加入100 μ I雙蒸水溶解，_20°C保存。
[0018]作為優選的技術方案，所述提取液由lmol/LTris-HCl，5mol/LNaCl，10%十二烷基硫酸鈉，0.5mol/L乙二胺四乙二鈉鹽和雙蒸水構成。
[0019]作為優選的技術方案，所述步驟(2)PCR擴增反應的具體步驟如下:在96孔PCR板中分別放入 DNA 模板、Mixed 混合液(DNApolymerasemixture,含 Taq 酶、dNTP 和 Mg2+ 等)、I對SSR引物和雙蒸水;先941:變性3min ;再94°C變性30s，55°C退火45s，72。。延伸lmin,30個循環；72°C延伸5min，4°C保存。
[0020]作為優選的技術方案，所述步驟(3)凝膠電泳檢測的具體步驟如下:安裝玻璃板於電泳槽上；將配置好的膠液搖勻，灌膠，插梳子，等膠凝結後點樣；電泳槽中加入緩衝液，110V,電泳大約2h ;下膠後將凝膠浸在染色液中浸染IOmin ;用雙蒸水衝洗凝膠兩遍，在顯影液中顯影5min ;用自來水衝洗凝膠兩遍後在凝膠電泳成像系統儀中拍照記錄。
[0021]作為優選的技術方案，所述電泳槽中緩衝液為1XTBE，由三羥甲基氨基甲烷、硼酸和0.5mol/L乙二胺四乙二鈉鹽混合而成。
[0022]作為優選的技術方案，所述膠液由5XTBE、40%丙烯醯胺、10%過硫酸銨、四甲基乙二胺、雙蒸水混合而成，它們的混合體積比為8: 6: 0.3: 0.024: 26。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]為了更清楚地說明本發明實施方案或現有技術中的技術方案，下面將對實施方案或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施方案，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0024]圖1為秈粳雜交水稻春優84及其親本的特徵譜帶。其中，編號1-4為母本特徵譜帶(80bp)，編號5-28為Fl種子特徵譜帶(兼有父母本條帶80bp和120bp)，編號29-32為父本特徵譜帶(120bp )。
【具體實施方式】
[0025]下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0026]實施例1
[0027]一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，包括:
[0028]步驟S1:種子中DNA提取
[0029]1、將離心管編號，從送檢樣品中隨機選取淨種子，分別放入離心管內，切勿一管多粒或空管；
[0030]2、力口 入 400ylSDS 提取液，提取液由 lMTris_Hcl60 μ 1，5MNacl40 μ 1，10%SDS80 μ 1,0.5MEDTA80 μ I 和雙蒸水 140 μ I 混合而成；
[0031]3、在組織磨樣機上打磨30s，加入120 μ 15MKac，搖勻，在冰浴上或者4°C環境下靜提 10_15min ；
[0032]4、25°C下 12000 轉 /min 離心 15min,取上清；
[0033]5、加入無水乙醇 400μ l，3MNaAcl5y 1，25°C下 12000 轉/min 離心 8min ;
[0034]6、輕輕倒掉液體，加入400 μ 170%無水乙醇搖晃洗滌粘附在離心管上的DNA和雜質混合物；
[0035]7、4°C下12000轉/min離心5min，倒掉上清，將離心管倒置於紙巾上晾乾；
[0036]8、晾乾後加入100 μ I雙蒸水溶解DNA，置於_20°C保存。
[0037]步驟S2 =PCR擴增反應
[0038]1、反應體系(10 μ I):在96孔PCR板中分別放入I μ IDNA模板、5 μ IMixed混合液(DNApolymerasemixture，含 Taq 酶、dNTP 和 Mg2+等)、0.25 μ ISSR 正向引物、0.25 μ ISSR 反向引物和3.5μ I雙蒸水。
[0039]2、引物序列:正向引物5』 -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3，和反向引物5』 -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3』;另一種選擇序列為正向引物 5』 -CAAAAACAGAGCAGATGAC-3』 和反向引物 5』 -CTCAAGATGGACGCCAAGA-3』。
[0040]3、擴增程序:先 94°C變性 3min ;再 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30個循環；72°C延伸5min，4°C保存。
[0041]步驟S3:凝膠電泳
[0042]1、用酒精用力擦洗玻璃板，乾燥後進行組裝並安裝於電泳槽上；
[0043]2、制膠灌膠:聚丙烯醯胺凝膠的製備時每一塊膠膠液由4ml5XTBE、3ml40%丙烯醯胺、150 μ 110%APS、12 μ ITEMED、13ml蒸餾水混合而成。將液體混合後搖勻，立即灌膠，聚合時間40min至Ih ；
[0044]3、電泳槽中加入I XTBE緩衝液，點樣1.5-2.5 μ 1，IlOV電泳，大約2h ；
[0045]4、銀染:將凝膠浸在置有0.2%AgN03的搖床中lOmin，用雙蒸水衝洗凝膠兩遍，然後將凝膠浸在顯影液(1.5% NaOH, 0.1%甲醛)中浸5min，用自來水衝洗凝膠兩遍，拍照記錄。
[0046]步驟S4:種子批純度計算
[0047]按上述方法獲得秈粳型雜交水稻及其親本的特徵電泳圖譜，兼有父母本特徵主帶的種子為目標種子，計數，並按以下公式計算純度:受檢種子批種子純度(％) =受檢種子中兼有父母本特徵帶型種子數/受檢種子總數X 100。
[0048]其技術效果是:本發明利用SDS快速提取法直接從秈粳交雜交稻種子中提取DNA，然後利用一對SSR引物對秈粳交父母本及其雜交一代種子DNA進行擴增，並用聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離得到兼有父母本特徵條帶的雜交一代互補特徵譜帶。對具有此類特徵譜帶的種子數計數，並計算種子批純度。經過連續三年的田間純度鑑定對比，此方法鑑定結果與田間檢驗結果無顯著差異，詳見表1。
[0049]表1
[0050]
【權利要求】
1.一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，包括: (1)種子DNA的直接提取；其中種子無需發芽； (2)PCR擴增反應； 所述PCR反應的體系中I對SSR引物有兩種選擇，一種選擇序列為正向引物5』 -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3』 和反向引物
5， -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3，； 另一種選擇序列為正向引物5』 -CAAAAACAGAGCAGATGAC-3』和反向引物5， -CTCAAGATGGACGCCAAGA-3，； (3)凝膠電泳檢測； (4)種子純度計算； 兼有父母特徵主帶的種子為目標種子，計數； 計算公式如下:受檢種子批種子純度(％)=受檢種子中兼有父母本特徵帶型種子數/受檢種子總數X 100。
2.根據權利要求1所述的一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(1)種子DNA的直接提取的步驟如下:將秈粳交雜交水稻種子剝去稃殼後放入離心管內；在組織磨樣機上打磨30s ;先後加入400 μ I提取液和120 μ 15mol/L醋酸鉀；混勻後在4°C環境下靜置10_15min ;25°C下12000rpm離心10min-15min ;取上清,先後加入無水乙醇400 μ I和3mol/L醋酸鈉15 μ I ;25°C下12000rpm離心10min-15min後去上清；加入400 μ 170%無水乙 醇洗漆；4°C下12000rpm離心4min_6min ;倒去上清，晾乾後加入100 μ I雙蒸水溶解，_20°C保存。
3.根據權利要求2所述的一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，其特徵在於，所述提取液由lmol/LTris-HCl，5mol/LNaCl，10%十二烷基硫酸鈉，0.5mol/L乙二胺四乙二鈉鹽和雙蒸水構成。
4.根據權利要求1所述的一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(2)PCR擴增反應的具體步驟如下:在96孔PCR板中分別放入DNA模板、Mixed混合液、I對SSR引物和雙蒸水；先94°C變性3min ;再94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin, 30個循環；72°C延伸5min，4°C保存。
5.根據權利要求1所述的一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，其特徵在於，所述步驟(3)凝膠電泳檢測的具體步驟如下:安裝玻璃板於電泳槽上；將配置好的膠液搖勻，灌膠，插梳子，等膠凝結後點樣；電泳槽中加入緩衝液，110V，電泳2h ;下膠後將凝膠浸在染色液中浸染IOmin ;用雙蒸水衝洗凝膠兩遍，在顯影液中顯影5min ;用自來水衝洗凝膠兩遍後在凝膠電泳成像系統儀中拍照記錄。
6.根據權利要求1所述的一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，其特徵在於，所述電泳槽中緩衝液為1XTBE，由三羥甲基氨基甲烷、硼酸和0.5mol/L乙二胺四乙二鈉鹽混合而成。
7.根據權利要求6所述的一種秈粳交型雜交水稻種子快速純度鑑定方法，其特徵在於，所述膠液由5 X TBE、40%丙烯醯胺、10%過硫酸銨、四甲基乙二胺、雙蒸水混合而成，它們的混合體積比為8: 6: 0.3: 0.024: 26ο
【文檔編號】C12Q1/68GK103740838SQ201410023390
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月18日 優先權日:2014年1月18日
【發明者】曹棟棟, 阮關海, 阮曉麗, 詹豔, 陳合雲 申請人:浙江農科種業有限公司