一種原人參二醇的液質聯用檢測方法與流程
2023-10-22 06:15:12
本發明屬於藥物分析學領域，涉及一種液質聯用檢測方法，特別涉及一種血漿樣品中原人參二醇的液質聯用檢測方法。
背景技術：
據研究報導，原人參二醇是原人參二醇型人參皂苷的體外水解產物，也是體內活性代謝產物。從結構上看，它屬於達瑪烷型四環三萜類人參皂苷元化合物，分子式為C30H52O3，分子量為460.70，熔點197.5-198.5攝氏度。原人參二醇具有廣泛的藥理學活性，包括抗腫瘤作用、抑制癲癇發作、抗抑鬱作用等。目前，原人參二醇作為一種抗抑鬱的一類新藥已經進入臨床試驗階段，因此，測定其在人體內的血藥濃度對於評價新藥療效、保證用藥安全性顯得尤為重要。
基於高效液相的原人參二醇紫外檢測方法已有報導，然而，由於其靈敏度較低，且通常人體用藥劑量較小，血漿內內源性幹擾物質多，故現有技術中尚無法對人體內的原人參二醇血藥濃度進行測定。液質聯用技術是以高效液相色譜為分離手段，以二級質譜為檢測器的一種分離分析定量技術，其既具有高效液相色譜的分離能力，又具備質譜的高靈敏度和高專屬性的檢測特點；因此，本申請的發明人擬建立一種基於液質聯用的原人參二醇檢測方法，該方法可以用於監測人體內的原人參二醇血藥濃度，為臨床研究提供可靠分析手段。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種快速、準確、高靈敏度的原人參二醇的液質聯用檢測方法。
本發明公開了一種原人參二醇的液質聯用檢測方法，其中，高效液相色譜採用C18色譜柱，甲酸水溶液、甲醇、乙腈為流動相梯度洗脫；質譜條件為離子源溫度121℃，源噴射電壓5500V，461.6→425.4作為定量離子對；根據樣品的保留時間、質譜信息進行原人參二醇的定性分析，根據其峰面積與內標峰面積比 值進行定量分析。本方法具有高速、靈敏、重現性好、回收率高等優點。
具體的，本發明的一種原人參二醇的液質聯用檢測方法，其包括：
1)含原人參二醇的血漿樣品預處理；
2)設定色譜分離條件；
3)設定質譜檢測條件；
4)建立標準曲線，
其中，血漿標準曲線方程為：Y＝0.117C+0.133，R2＝0.9923，線性範圍0.10-10ng/ml；測定血漿中原人參二醇的最低定量限為0.100ng/ml；
5)日內精密度和回收率考察，
6)日間精密度和回收率考察，以及，
7)分析樣品的穩定性。
更優選的，本發明的一種原人參二醇的液質聯用檢測方法，使用色譜柱為C18填料，5μm粒徑，2.1×150mm規格；流動相為0.2％甲酸水溶液(A)、甲醇(B)、乙腈(C)，梯度洗脫，流速為0.3ml/min，柱溫30℃；色譜梯度洗脫條件為0-2min 15％A+80％B+5％C，2.01-6min 5％B+95％C，6.01-15min 95％B+5％C，15-20min由95％B+5％C線性變換為15％A+80％B+5％C；質譜條件為離子源溫度為121℃，源噴射電壓為5500V，GAS 1為25L/min，GAS 2為20L/min；選擇離子對461.6→425.4和461.6→443.4對原人參二醇進行定性，其中461.6→425.4作為定量離子對。
本發明中，梯度洗脫可以使所述方法具有極高的靈敏度和分離度。
進一步地，所述質譜儀為二級質譜儀。二級質譜可選擇母離子進一步電離破碎後檢測，相比一級質譜而言，二級質譜具有更高的專屬性。
進一步地，所述方法為內標法，內標物為地塞米松。內標法可以減少樣品預處理過程中造成的操作誤差，測定結果更加準確。地塞米松與原人參二醇結構類似，具有相似的理化性質，保證內標法的準確性。
進一步地，所述內標物選擇離子對393.2→355.2進行定量。選擇該離子對進行定量，具有高專屬性和高靈敏度。
進一步地，待測物為血漿。血漿是臨床試驗最常用的臨床樣品，易獲得，且能準確地反映藥物在體內的情況。
進一步地，所述待測物前處理方法為液液萃取法。液液萃取法可以快捷有效地從血漿樣品中萃取出原人參二醇。
本方法進行了日內精密度和回收率考察實驗，通過測得量與加入量的比值求得相對回收率；本發明進行了日間精密度和回收率考察實驗，以15份測定值計算日間精密度和相對回收率，結果分別顯示，相對回收率和RSD值均在規定範圍內，說明本檢測方法準確、可靠；本方法進行了分析樣品的穩定性實驗，結果表明，本方法具有較好穩定性。
本發明的方法的有益效果在於：
液質聯用兼具色譜的高分力度和質譜的高專屬性、高靈敏度的特點，進而實現快速、準確地對樣品中原人參二醇定量測試研究；內標物地塞米松的應用能減少操作誤差對測定結果的影響，進一步提高檢測方法的準確度和精密度；液液萃取能快速、高效、低成本地對血漿樣品中的原人參二醇進行提取濃縮，提高檢測靈敏度。
以下結合附圖和實施例對本發明做進一步的詳細描述。以下實施例僅為說明本發明的技術思想，不能以此限定本發明的保護範圍，凡是按照本發明提出的技術思想，在技術方案基礎上所做的任何改動，均落入本發明保護範圍之內。
附圖說明
圖1是血漿中原人參二醇液質聯用測定色譜圖，
圖中：A-1.空白血漿中離子對461.6→425.4色譜圖；A-2.空白血漿中離子對393.2→355.2色譜圖；B-1.血漿添加標準品中離子對461.6→425.4色譜圖；B-2.血漿添加標準品中離子對393.2→355.2色譜圖；C-1.實測血漿樣品中離子對461.6→425.4色譜圖；C-2實測血漿樣品中離子對393.2→355.2色譜圖。
圖2是原人參二醇標準曲線。
具體實施方式
實施例1
1.儀器和試藥
1)分析儀器
API 4000Q型三重四級杆串聯質譜儀，配ESI電噴霧離子源，分析軟體為Analyst 1.6數據處理系統，均購自美國Applied Biosystem公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，搭載Agilent 1200自動進樣器，購自美國Agilent公司；色譜柱為Ultimate XB-C18,5μm，2.1x 150mm，購自上海Welch公司。
2)試驗藥品
原人參二醇標準品(CAS：30636-90-9，含量99.00％)，由大連美侖生物技術有限公司提供。
甲醇、乙腈為美國Merck公司生產的色譜純試劑，乙醚、二氯甲烷為中國醫藥(集團)上海化學試劑公司生產的分析純試劑，純水為Millipore去離子水。
2.試驗方法與結果
1)含原人參二醇的血漿樣品預處理
靜脈血樣置於10ml玻璃離心管中(加肝素抗凝)，3500r/min離心5min分離血漿，取血漿500μl分裝於凍存管中，-80℃超低溫保存。檢測時復融500μl血漿，加入50μl內標，渦旋混勻後加入0.5ml緩衝液，並轉移至10ml玻璃具塞尖底離心管中；隨後加入4ml乙醚-二氯甲烷(3:1，V/V)，渦旋90s混勻，繼續振搖10min，再於3000r/min離心10min；分取有機層4.0ml，在40℃加熱塊上加熱，通氮氣揮幹，加60μl甲醇溶解，15000r/min高速離心10min，取上清液50μl進樣，峰面積內標法定量分析；
2)色譜分離條件
色譜柱：WelchTM(月旭)C185μm 2.1×150mm；流動相：0.2％甲酸水溶液(A)、甲醇(B)、乙腈(C)梯度洗脫，流速0.3ml/min，柱溫30℃。色譜梯度洗脫條件如下：0–2min 15％A+80％B+5％C；2.01-6min 5％B+95％C；6.01-15min 95％B+5％C；15-20min由95％B+5％C變為15％A+80％B+5％；
3)質譜檢測條件
離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子掃描模式檢測，乾燥氣流流速為20L/min，離子源溫度為121℃，源噴射電壓為5500V，GAS 1為25L/min，GAS 2為20L/min。選擇離子對461.6→425.4和461.6→443.4對原人參二醇進行定性，其中461.6→425.4作為定量離子對。內標物地塞米松選擇離子對393.2→355.2進行定量；
4)標準曲線的建立
精密稱取原人參二醇標準對照品10.00mg，置於10.00ml容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得1.000mg/ml的標準貯備液。精密吸取標準貯備液一定量，分別稀釋定容至4個10.0ml量瓶中，配成濃度為100.0μg/ml、10.00μg/ml、1.000μg/ml和100.0ng/ml的標準溶液；
從原人參二醇標準溶液中精密吸取相當於1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00和100.0ng的原人參二醇溶液置於7個10.0ml量瓶中，其中液體在40℃水浴中通氮氣揮幹，加入空白血漿稀釋定容，配製成含原人參二醇0.100，0.200，0.500，1.000，2.000，5.000和10.00ng/ml的標準血漿樣品；按上述血漿樣品預處理步驟操作，並進行液質聯用分析。以原人參二醇標準對照品的峰面積(A，Y)對相應的濃度(C，ng/ml)進行加權(1/X2)線性回歸，得血漿標準曲線方程為：Y＝0.117C+0.133，R2＝0.9923，線性範圍0.10-10ng/ml；原人參二醇的血漿標準曲線如圖2所示；
本方法測定血漿中原人參二醇的最低定量限為0.100ng/ml；
5)日內精密度和回收率考察
配製0.200ng/ml、1.000ng/ml、5.000ng/ml低、中、高三種不同濃度的原人參二醇標準血漿樣品，按上述血漿樣品預處理步驟操作，血漿樣品中原人參二醇色譜峰面積代入血漿標準曲線，通過測得量與加入量的比值求得相對回收率，結果低、中、高濃度樣品測得量分別為0.22±0.02ng/mL、1.08±0.16ng/mL、5.23±0.74ng/mL，相對回收率為109.67％±8.81％、108.03％±15.56％、104.67％±14.72％，RSD值為8.03％、14.41％、14.06％；相對回收率和RSD值均在規定範圍內，說明所述檢測方法準確、可靠；
6)日間精密度和回收率考察
按血漿樣品標準曲線測定方法配製0.200ng/ml、1.000ng/ml、5.000ng/ml低、中、高三種不同濃度的原人參二醇血漿樣品各5份，按上述生物樣品預處理步驟同法操作，連續測定3天，以15份值計算日間精密度和相對回收率。結果低、中、高濃度樣品測得量分別為0.23±0.03ng/mL、0.90±0.13ng/mL、5.41±0.62ng/mL，相對回收率為113.18％±1.34％、89.50％±13.13％、108.15％±12.34％，RSD值為11.79％、14.67％、11.42％。相對回收率和RSD值均在規定範圍 內，說明所述檢測方法準確、可靠。
7)分析樣品的穩定性
靜脈取血後立即離心分取血漿，置於-20℃冰箱保存待測。本試驗考察了原人參二醇標準貯備液和血漿標準樣品的穩定性。1000.00μg/ml原人參二醇標準貯備液在避光、密封和低溫保存(－20℃)實驗條件下，90天內原人參二醇含量未見明顯下降。
對於1.000ng/ml原人參二醇血漿標準樣品預處理後進樣溶液(封口)室溫放置的穩定性，結果8h內進樣溶液中的原人參二醇穩定性良好；1.000ng/ml原人參二醇血漿標準樣品室溫下放置後(2h內)，再進行生物樣品預處理與液質連用分析，分析樣品中的原人參二醇重現性良好；1.000ng/ml原人參二醇血漿標準樣品進行3次冷凍－解凍循環試驗，結果經3次冷凍－解凍試驗後分析樣品中的原人參二醇穩定性良好；1.000ng/ml原人參二醇血漿標準樣品在低溫保存(－20℃)實驗條件下，分析樣品中的原人參二醇穩定性良好，40天內含量未見明顯下降，說明所述方法具有較好穩定性。