一種利用枯草芽孢桿菌表達系統快速、高效篩選抗菌基因的方法與流程

2023-10-22 03:03:07 1

本發明屬於分子生物學領域，涉及一種利用枯草芽孢桿菌表達系統快速、高效篩選抗性基因的方法，它主要用於快速找到抗性基因，並能驗證基因功能。
背景技術：
：枯草芽孢桿菌是經美國fda認證的一種對環境無害的(gras)革蘭氏陽性細菌，全基因組測序已經完成，其作為工程菌具有很大的優勢，原因在於：芽孢桿菌的胞外蛋白可以直接分泌到培養基中；芽孢桿菌分泌的蛋白無內毒素，較為安全；被認為非常適合遺傳操作，並已成為被廣泛應用於實驗室研究的模式生物，本研究中所用芽孢桿菌wb800，已經突變掉了8個主要的胞外蛋白酶，大大降低了抗菌肽降解的可能性。cdna文庫是以特定的組織或細胞的mrna為模板，逆轉錄形成的cdna，再利用體外的dna重組技術，轉入合適的受體進行擴增或表達，形成一個重組的克隆群體，cdna文庫是目前研究基因功能最常用的手段之一。抗菌肽(antimicrobialpeptide，amp)是由生物合成的具有廣譜抗性的小分子多肽，到目前為止已有1200多種來自動植物的抗菌肽被陸續發現，其中70多種抗菌多肽的結構已經被揭示，抗菌肽對多種真菌、細菌、寄生蟲和病毒都有一定的殺傷作用引起了廣泛的重視。目前抗菌肽的相關研究大多集中在活性物質的提取分離和純化方面以及抗性機理的研究上，分離抗菌肽的方法主要有三種：1、生物體直接提取純化，但是抗菌肽天然合成量非常少，分離純化過程中損失大，且容易失活；2、人工合成已知的抗菌肽，此方法成本高、耗時長，無法保證抗菌肽的天然構象和生物活性，而且難以篩選到新的抗菌肽；3、構建工程菌融合表達抗菌基因，這種方法利用差異顯示技術，通過pcr的手段將有差異的片段分開，篩選出目的基因，經pcr擴增後，片段的重複率顯著增加，且分離的片段可能為無效片段，此外，另一種方法是基於蛋白或多肽的逐級分離檢測，從活性蛋白入手推斷出的基因序列再合成抗菌肽，此方法工作周期長，工作量大，且再合成的抗菌肽往往沒有預期的活性。本發明採用芽孢桿菌wb800分泌系統，首先抗菌肽在菌體內部表達，使得篩選系統變得更靈敏，其次，採用文庫篩選的方法可以在是篩選出很多個潛在的抗菌肽的同時，對應上相應基因片段，最後，芽孢桿菌本身就是一個生防菌，發現的新的抗菌肽具有很大的應用潛力。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種利用枯草芽孢桿菌表達系統快速、高效篩選抗菌基因的方法，本方法首先誘導植物中抗性基因的表達，再選擇合適的載體構建一個完整的cdna文庫，導入到枯草芽孢桿菌後，利用其分泌表達系統表達重組質粒，點樣法篩選抗性表型，實驗步驟簡單、易行，適合工作量大的文庫篩選，能夠在有限的時間內快速高效的得到具有抗性表型的克隆，為篩選抗性基因提了新的途徑。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施：一種利用枯草芽孢桿菌表達系統快速、高效篩選抗菌基因的方法，其步驟為：1)含目標基因的cdna文庫的製備：a.在健康植株上接種病原菌(該病原菌必須可以在寄主植物上致病，對病原菌種類無要求)誘導抗性基因的表達後，提取目標植物總rna；b.分離純化mrna；c.設計含xbaⅰ酶切位點的oligodt，其序列為5′-acaggctctagagcttttttttttttttttttttttt-3′，合成cdna第一條鏈，以第一條鏈為模板合成第二條cdna鏈；cdna合成完成後，加上含ndeⅰ酶切位點的的接頭，所述的含ndeⅰ酶切位點的的接頭有3對，以減少移碼突變的概率，由下述方法製得：將ndeⅰ1和ndeⅰ2，ndeⅰ3和ndeⅰ4，ndeⅰ5和ndeⅰ6等量混合，並加入1/10體積的10×pcrbuffer，在pcr儀中95℃加熱5分鐘，然後自然冷卻至室溫，形成接頭ndeⅰ1/ndeⅰ2，ndeⅰ3/ndeⅰ4，ndeⅰ5/ndeⅰ6；將接頭ndeⅰ1/ndeⅰ2，ndeⅰ3/ndeⅰ4和ndeⅰ5/ndeⅰ6等量混合，保存於-20℃，備用。d.cdna連接載體：將步驟c中的加完接頭的cdna用限制性核酸內切酶xbaⅰ和ndeⅰ雙酶切後，連接到質粒pbe-s上；e.將連接體系轉化到大腸桿菌高效感受態細胞中，擴增質粒；群體提質粒後轉化枯草芽孢桿菌wb800，挑取不少於2000個轉化子，保存備用；2)致死菌株的篩選a.將轉化子在標記卡那黴素抗性的lb培養基中搖培過夜後，於相同抗性的平板上點樣，篩選出原本長勢正常但後期變成透明或半透明狀的菌株，初步確認，該基因具有致死作用；b.將上述初步確認的含致死基因菌液搖培後提取質粒，經大腸桿菌擴增後重新轉化枯草芽孢桿菌wb800和枯草芽孢桿菌野生菌株168，均出現了致死表型，表明致死表型由插入的基因引起，該基因作為下一步的候選基因；3)抗線蟲基因的篩選採用濾紙片法測定含候選基因的轉化子對秀麗隱杆線蟲的抗性，以枯草芽孢桿菌wb800作為對照，測定選擇指數，選擇指數公式如下：選擇指數＝(測試菌中線蟲數量-對照菌中線蟲數量)/線蟲總數，選擇指數小於-30％的轉化子具有抗線蟲作用，用於下一步的篩選；4)抗菌基因的篩選硫酸銨沉澱法提取步驟3)中含抗線蟲基因的菌株的胞外粗蛋白，以空載體菌株為對照，濾紙片法測定粗蛋白的抑菌效果，抽提質粒和基因測序，由此得到相應的抗菌基因。優選地，步驟1)中將連接體系轉化到大腸桿菌高效感受態細胞中，所述的感受態細胞為大腸桿菌感受態hst08，提高轉化效率，減少基因的丟失。與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：本發明中致死篩選過程首先讓抗菌肽在菌體內部表達，最後分泌到胞外，體內抗菌肽積累並起作用，使得篩選系統變得更加靈敏，且可以篩選出很多個潛在的抗菌肽的同時，對應上相應基因片段，抗線蟲基因篩選和粗蛋白抑菌篩選，可以在眾多的潛在抗菌肽中，篩選出具有抗線蟲或抗菌作用的基因。最後，芽孢桿菌本身就是一個生防菌，發現的新的抗菌肽在直接應用方面具有很大的潛力。發現抗菌肽後，可以先通過基因測序確定基因序列，再通過各大資料庫的比對來初步確定是否為新的抗菌基因，如果比對無結果，則可以進一步比對抗菌肽序列，最終確定是否為新的抗菌肽。附圖說明圖1為提取的總rna凝膠電泳檢測圖。共有3條泳道，1泳道為dl2000dnamaker，2、3泳道為總rna凝膠檢測結果。18srrna、28srrna條帶清晰。圖2為純化後的mrna凝膠電泳檢測圖。共有2條泳道，1泳道為dl2000dnamaker，2泳道為mrna凝膠檢測結果。mrna為彌散狀條帶。圖3為雙鏈cdna凝膠電泳檢測圖。共有2條泳道，1泳道為100bpdnaladder，2泳道為cdna凝膠檢測結果。cdna為彌散狀條帶。圖4、圖5分別為板藍根cdna文庫和半夏cdna文庫插入片段隨機pcr檢測圖。共50條泳道，13泳道為100bpdnaladder，其他泳道為隨機挑選的文庫中的菌株。圖6為含抗性基因致死模式圖。圖a為點樣12h後菌落形態圖，圖b為點樣24h後菌落形態圖。培養皿中左側菌落為空載體菌落，即對照菌落，右側菌落為致死菌株菌落，即測試菌菌落。圖7為致死菌掃描電鏡圖片。圖a為野生型枯草芽孢桿菌wb800菌株掃描電鏡圖，圖b為轉入pbe-s載體的空載體菌株掃描電鏡圖，圖c為致死菌菌株掃描電鏡圖。圖8為測試菌粗蛋白抑菌效果圖。圖中指示菌為野生型枯草芽孢桿菌wb800，白色圓圈為濾紙片，濾紙片周圍出現抑菌圈的粗蛋白為測試菌粗蛋白，濾紙片周圍沒有出現抑菌圈的粗蛋白為空載體菌株粗蛋白。圖9為濾紙片法篩選抗線蟲基因效果圖。圖a為對照野生型枯草芽孢桿菌wb800濾紙片下線蟲和蟲道分布圖，圖b為測試菌濾紙片下線蟲和蟲道分布圖。具體實施方式實施例1：板藍根中抗菌基因的篩選1.板藍根cdna文庫的製備：(1)將板藍根培育至4周後，接種玉米紋枯病病原菌agi-ia，封口膜密封保溼。誘導板藍根抗性基因的大量表達，每隔6h取樣一次，取完後立即於-70℃超低溫保存備用，直至板藍根葉片發病，不再取樣。用細胞總rna提取試劑trizol，大量提取板藍根葉片總rna，富集後濃度為2600ng/μl。取5μlrna凝膠電泳，檢測rna質量(見圖1)，剩下的於-70℃超低溫保存備用，直到總體積達到500μl，進行純化。(2)磁珠法分離純化mrna(isolationsystems)，按照實驗手冊進行實驗，如果純化濃度低，可用多個磁珠富集，純化出mrna後所測濃度為260ng/μl，取5μlmrna凝膠電泳，檢測mrna質量(見圖2)，剩下mrna立即反轉錄。(3)設計含xbaⅰ酶切位點的oligodt合成cdna第一條鏈，以第一條鏈為模板合成cdna第二條鏈。cdna第一條鏈合成體系：mrna(5μg)11μl5×1ststrandsynthesisbuffer4μldntpmixture1μlrnaseinhibitor1μloligodtprimer(含xbaⅰ酶切位點)2μlrtnase1μl總體積20μl含xbaⅰ酶切位點的oligodt的序列為5』-acaggctctagagcttttttttttttttttttttttt-3』，用於mrna純化過程中結合mrna。mrna65℃加熱5min後，立即取出冰中放置5min(冷卻)。加入上述反應液室溫放置10min，轉移到42℃恆溫水浴槽內(可以在pcr儀中做)反應1h。反應結束後放置冰中冷卻2min。cdna第二條鏈合成體系：在第一條鏈合成後的微量離心管中再加入下面反應液，全量142μl：5×2ststrandsynthesisbuffer30μldntpmixture3μlrnase-freeh2o89μl加入2μle.colidnapolymerasel和2μle.colirnaseh/e.colidnaligasemixture，輕輕混勻，16℃反應2h；70℃加熱10min，取出室溫放置5min；加入4μl的t4dnapolymerase，輕輕混勻，37℃反應10min；向第二條鏈cdna合成反應液(150μl)中加入rnase-freeh2o至終體積500μl，再加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)溶液，vortex震蕩5-10s；室溫下15000rpm離心5min，小心取出上層水相至另一個新的微量離心管中；加入1/10體積(50μl)的3m醋酸鈉(ph5.2)，2.5倍量的100％乙醇，均勻混合後，立即在15000rpm下離心30min；棄上清，用70％乙醇清洗，可重複一次；乾燥沉澱後，用20μl的rnase-freeh2o溶解沉澱(檢測結果見圖3)，濃度為1300ng/μl，於-20℃保存，便於後面加接頭用。製備含ndeⅰ酶切位點的接頭的方法：按照合成單上的說明將合成的寡核苷酸溶於相應體積的雙蒸水或tebuffer中，使濃度為100pm/μl。在pcr管中分別將ndeⅰ1和ndeⅰ2，ndeⅰ3和ndeⅰ4，ndeⅰ5和ndeⅰ6等量混合，並加入1/10體積的10×pcrbuffer。在pcr儀中95℃加熱5分鐘，然後自然冷卻至室溫(20-25℃，以下相同)。形成的接頭如下：再將接頭ndeⅰ1/ndeⅰ2，ndeⅰ3/ndeⅰ4和ndeⅰ5/ndeⅰ6等量混合，保存於-20℃，以備後用。加上含ndeⅰ酶切位點的接頭(primescripttmdoublestrandcdnasynthesiskit)，加ndeⅰ接頭體系：cdna3μl10×t4dnaligasebuffer2μlndeⅰadaptor0.5μlt4dnaligase1μlddh2o13.5μl總體積20μl輕輕混勻後，16℃反應10h左右。70℃保溫30min，室溫放置5min後，立即雙酶切處理。雙酶切載體體系：輕輕混勻後，37℃反應3-4h。利用pcr切膠回收試劑盒回收雙酶切產物中的大片段，用15μl-20μl的ddh2o洗脫，用分光光度計檢測濃度為1000ng/μl，回收產物轉化大腸桿菌檢測是否酶切完全。雙酶切cdna體系：10×mbuffer4μlndeⅰ2μlxbaⅰ2μlcdna20μlddh2o12μl總體積20μl輕輕混勻後，37℃反應3-4h。利用pcr清潔回收試劑盒去除雙酶切產物，用15μl-20μl的ddh2o洗脫，用分光光度計檢測濃度為1000ng/μl，以備後面連接載體。(4)cdna連接載體：將加完接頭的cdna雙酶切後連到含173種信號肽的信號肽庫質粒pbe-s(購自寶生物工程有限公司)上，重組蛋白的表達分泌和信號肽的種類密切相關，在載體上連接一個信號肽庫，有利於篩選不同的分泌蛋白。連接體系：cdna12μlpbe-s1μl10xt4dnaligasebuffer2μlt4dnaligase1μlddh2o4μl總體積20μlpcr儀中16℃保溫3-5h，此20μl連接溶液可以做後面轉化用。(5)將連接體系先轉化到大腸桿菌高效感受態hst08(購自武漢友名生物工程有限公司)中，塗平板大量擴增重組質粒，群體提質粒後再轉化枯草芽孢桿菌wb800菌株(購自上海北諾生物科技有限公司)，挑取挑取不少於2000個轉化子，保存備用，以便進行後續重組蛋白的分泌表達。2.致死菌株的篩選(1)將轉化子在標記抗性卡那黴素終濃度為10μg/ml的lb培養基中搖培過夜後，於相同抗性的平板上點樣，定期觀察菌落形態，發現原本長勢很好的菌株，在生長到一定時間後開始慢慢死去，菌落從厚實緻密的形態慢慢消解，變成透明或半透明狀(見圖6)，掃描電鏡觀察致死菌株菌落形態，發現該菌株菌體扭曲形變或中間變空(見圖7)。初步確認，該基因具有致死作用。我們用這個方法共篩選到60個致死菌株，選取編號為915的菌株進行後續驗證。(2)將915的菌株搖培8-12h後提取質粒，重新轉化枯草芽孢桿菌wb800，仍出現致死表型，將該質粒轉化枯草芽孢桿菌野生菌株168(由本實驗室保存)中，也出現了致死表型，而空載體菌株不出現致死現象。進一步表明致死表型由插入的基因引起，即插入的基因起致死作用，該基因作為下一步的候選基因。3.抗線蟲基因的篩選濾紙片法：於ngm平板兩側放上0.22μm的有機濾膜，將搖培72h後的915菌株與枯草芽孢桿菌wb800菌株分別置於濾膜上，生長12h後，揭開濾膜點上大腸桿菌op50，培養12h後，在中間點上l4stage秀麗隱杆線蟲70-80隻，10h後統計兩側菌落內的線蟲數量(見圖9)，經多次、大量篩選後，得出的數據如下：915分泌物處共有線蟲263隻，另一側wb800菌株分泌物處共有682隻，以選擇指數為指標(選擇指數＝(測試菌中線蟲數量-對照菌中線蟲數量)/線蟲總數)，915選擇指數為-44.34％(選擇指數小於-30％的轉化子具有抗線蟲作用)，可以確定915菌株分泌物具有一定的抗線蟲作用，用於下一步的篩選。4.抗菌基因的篩選將915菌株在含卡那黴素終濃度為10μg/ml的抗性lb平板上活化2代之後轉入50ml相同抗性lb中搖培12h，再按2％接種量接種至200ml相同抗性lb中於37℃中搖培發酵72h，取30ml上清用硫酸銨沉澱的方法提取粗蛋白，用pbs溶解蛋白，透析除去鹽離子。以空載體菌株為對照，濾紙片法測定該基因的抑菌效果，發現915菌株對枯草芽孢桿菌wb800(見圖8)、空載體菌株、青枯病原菌、白葉枯病原菌等多種細菌具有一定的抑菌效果。對915菌株進行質粒提取，並測序拿到基因序列後，在各大資料庫中並未比對到任何結果，將對應的蛋白序列進行比對，也沒有比對到結果，可以確定，該基因為新的抗菌基因。實施例2：半夏中抗菌基因的篩選1.半夏cdna文庫的製備：將健康的半夏從培養缽中取出，塊莖用無菌水衝洗乾淨後，用無菌的注射器針頭在每個健康的塊莖上扎7-10個孔，放入搖培好的半夏軟腐病菌菌液中浸泡15-20min後取出，重新栽種到培養缽中，培養箱內培養，誘導半夏抗性基因的大量表達，每隔6h取樣一次，取完後立即於-70℃超低溫保存備用，直至半夏根基發病，不再取樣。用細胞總rna提取試劑trizol，大量提取半夏葉片總rna，富集後濃度為9675ng/μl。取5μlrna進行凝膠電泳，檢測rna質量，剩下的於-70℃超低溫保存備用，直到總體積達到500μl，進行純化。(2)磁珠法分離純化mrna(isolationsystems)，按照實驗手冊進行實驗，如果純化濃度低，可用多個磁珠富集，純化出mrna後所測濃度為188ng/μl，取5μlmrna凝膠電泳，檢測mrna質量，剩下mrna立即反轉錄。(3)設計含xbaⅰ酶切位點的oligodt合成cdna第一條鏈，以第一條鏈為模板合成cdna第二條鏈。cdna第一條鏈合成體系：含xbaⅰ酶切位點的oligodt的序列為5′-acaggctctagagcttttttttttttttttttttttt-3′，用於mrna純化過程中結合mrna。mrna65℃加熱5min後，立即取出冰中放置5min(冷卻)。加入上述反應液室溫放置10min，轉移到42℃恆溫水浴槽內(可以在pcr儀中做)反應1h。反應結束後放置冰中冷卻2min。cdna第二條鏈合成體系：在第一條鏈合成後的微量離心管中再加入下面反應液，全量142μl：加入2μle.colidnapolymerasel和2μle.colirnaseh/e.colidnaligasemixture，輕輕混勻，16℃反應2h；70℃加熱10min，取出室溫放置5min；加入4μl的t4dnapolymerase，輕輕混勻，37℃反應10min；向第二條鏈cdna合成反應液(150μl)中加入rnase-freeh2o至終體積500μl，再加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)溶液，vortex震蕩5-10s；室溫下15000rpm離心5min，小心取出上層水相至另一個新的微量離心管中；加入1/10體積(50μl)的3m醋酸鈉(ph5.2)，2.5倍量的100％乙醇，均勻混合後，立即在15000rpm下離心30min；棄上清，用70％乙醇清洗，可重複一次；乾燥沉澱後，用20μl的rnase-freeh2o溶解沉澱，濃度為567ng/μl，於-20℃保存，便於後面加接頭用。含ndeⅰ酶切位點的接頭的製備方法參見實施例1。加含ndeⅰ酶切位點的接頭體系：cdna2μl10×t4dnaligasebuffer2μlndeⅰadaptor1μlt4dnaligase1μlddh2o14μl總體積20μl輕輕混勻後，16℃反應10h左右。65℃保溫30min，室溫放置5min後，立即雙酶切處理。雙酶切cdna體系：10×mbuffer4μlndeⅰ2μlxbaⅰ2μl加過接頭cdna20μlddh2o12μl總體積20μl輕輕混勻後，37℃反應3-4h。利用pcr清潔回收試劑盒去除雙酶切產物，用40μl的ddh2o洗脫，用分光光度計檢測濃度為23.5ng/μl，以備後面連接載體。搖培活化含空載體的大腸桿菌菌株，按照試劑盒方法提取質粒，濃度為550ng/μl。雙酶切載體體系：10×greenbuffer6μlndeⅰ3μlxbaⅰ3μlpbe-s7μlddh2o41μl總體積60μl輕輕混勻後，37℃反應3-4h。利用pcr切膠回收試劑盒回收雙酶切產物中的大片段，用25μl的ddh2o洗脫，用分光光度計檢測濃度為58ng/μl，回收產物轉化大腸桿菌檢測是否酶切完全。(4)cdna連接載體：將加完接頭的cdna雙酶切後連到含173種信號肽的信號肽庫質粒pbe-s(購自大連寶生物科技有限公司)上，重組蛋白的表達分泌和信號肽的種類密切相關，在載體上連接一個信號肽庫，有利於篩選不同的分泌蛋白。連接體系：cdna6.5μlpbe-s6μl10×t4dnaligasebuffer2μlt4dnaligase1μlddh2o4.5μl總體積20μlpcr儀中16℃保溫3-5h，此20μl連接溶液可以-20℃保存，以便後面轉化使用。(5)將連接體系先轉化到大腸桿菌高效感受態hst08中，塗平板大量擴增重組質粒，群體提質粒，濃度為1958ng/μl。再轉化枯草芽孢桿菌wb800菌株，挑取2039個轉化子，保存備用，以便進行後續重組蛋白的分泌表達。2.致死菌株的篩選(1)將轉化子在標記抗性kanamycin終濃度為10μg/ml的lb培養基中搖培過夜後，於相同抗性的平板上點樣，定期觀察菌落形態，發現原本長勢很好的菌株，在生長到一定時間後開始慢慢死去，菌落從厚實緻密的形態慢慢消解，變成透明或半透明狀，掃描電鏡觀察致死菌株菌落形態，發現該菌株，菌體扭曲形變或中間變空。初步確認，該基因具有致死作用。我們用這個方法共篩選到95個致死菌株，選取編號為1366的菌株進行後續驗證。(2)將1366菌株搖培8-12h後提取質粒，重新轉化枯草芽孢桿菌wb800，仍出現致死表型，將該質粒轉化枯草芽孢桿菌野生菌株168中，也出現了致死表型，而空載體菌株不出現致死現象。進一步表明致死表型由插入的基因引起，即插入的基因起致死作用，該基因作為下一步的候選基因。3.抗線蟲基因的篩選濾紙片法：於ngm平板兩側放上0.22μm的有機濾膜，將搖培72h後的1366菌株與枯草芽孢桿菌wb800菌株分別置於濾膜上，生長12h後，揭開濾膜點上大腸桿菌op50，培養12h後，在中間點上l4stage秀麗隱杆線蟲70-80隻，10h後統計兩側菌落內的線蟲數量，經多次、大量篩選後，得出的數據如下：1366分泌物處共有線蟲644隻，另一側wb800菌株分泌物處共有1369隻，以選擇指數為指標(選擇指數＝(測試菌中線蟲數量-對照菌中線蟲數量)/線蟲總數)，1366選擇指數為-36.02％(選擇指數小於-30％的轉化子具有抗線蟲作用)，可以確定1366菌株分泌物具有一定的抗線蟲作用，用於下一步篩選。4.抗菌基因的篩選將1366菌株在含卡那黴素終濃度為10μg/ml的抗性lb平板上活化2代之後轉入50ml相同抗性lb中搖培12h，在按2％接種量接種至200ml相同抗性lb中於37℃中搖培發酵72h，取30ml上清用硫酸銨沉澱的方法提取粗蛋白，用pbs溶解蛋白，透析除去鹽離子。以空載體菌株為對照，濾紙片法測定該基因的抑菌效果，發現1366菌株對wb800、空載體菌株、青枯病原菌，白葉枯病原菌等多種細菌具有一定的抑菌效果。對1366菌株進行質粒提取，並測序拿到基因序列後，在各大資料庫中並未比對到任何結果，將對應的蛋白序列進行比對，也沒有比對到結果，可以確定，該基因為新的抗菌基因。以上列舉的僅是本發明的2個具體實施例，本發明的實驗材料可以是其他植物，例如大蒜、玉米等可食用作物，金銀花、魚腥草等藥用植物，還可以是哈茨木黴等生防菌。抗菌基因篩選中選用的指示菌還可以是果斑病原菌、潰瘍病原菌、水稻細菌性條斑病病原菌等各種死體營養性病原細菌。當前第1頁12