一種甘草苷的分離製備方法
2023-10-24 06:34:37 2
專利名稱：：一種甘草苷的分離製備方法
技術領域：
：本發明涉及天然藥物的分離，具體地說是一種甘草苷的分離製備方法，通過工業色譜技術從傳統中藥甘草中分離甘草苷的製備方法。背景技f甘草為豆科(丄egww'"arafe)甘草屬(G/;^pr/H:za丄/"".)植物烏拉爾甘草、光果甘草、脹果甘草的根及根狀莖，分布遍全球各大洲，以歐亞大陸為多。我國主要分布於黃河流域以北各省區，個別種見於雲南西北部。甘草根性平、味甘，具補脾、潤肺、解毒、調和諸藥的功能。近年通過研究發現了許多新的藥理作用,甘草具有抗氧化、抗潰瘍、對機體雙向調節、抗病毒、抗腫瘤、以及保肝、抗心律失常等生物醫學作用(HanLanoT，etal..ChemPharmBull.1988，36(6):2090;ShibataS.PlanlaMed.1991，57(3):221;馬靖.癌症，2001，20(8):806-811。)近年來國內外競相研製、開發甘草藥品禾口食品。甘草苷，英文名liquiritin，系統命名為4'，7-二羥基雙氫黃酮-4'-0-卩-D-吡喃葡萄糖苷。文獻報導甘草苷為甘草的主要成分(閻永紅等.中國中藥雜誌，2006，31(12):1019—1021)。甘草苷是甘草中主要活性成分，具有抗氧化、抗心律失常、抗潰瘍、抗病毒、等作用，是一種很有開發前景的環境適應元藥物(邢國秀等.中國中藥雜誌，2003，26(7):593-597;傅乃武等.中藥藥理與臨床，1994(5):26-29)。文獻有關甘草苷的提取分離製備的報導，基本上都是採取傳統的溶劑萃取、矽膠層析等方法(朱緒民等.中草藥,2003，34(3):199-201;劉勤等.藥學學報.1989，24(7):525-531;NakanishiTetal.Phytochemistry，1985，24(2):339)，這些方法存在產品純度低、重現性差、耗時長、有機殘留嚴重、無法大規模生產等缺點。
發明內容本發明的目的是提供一種產品純度高、重現性好，可以大規模生產的甘草苷分離製備方法。以滿足甘草苷化合物標準品製備和大規模工業生產的需要。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為1)提取稱取甘草原藥材，加入其重量8-12倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小時，得到提取液，將提取液濃縮濃縮至相對密度為1.10-1.15的浸膏，得到甘草提取組分；2)醇沉將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達到50-70%，0-4。C冷藏靜置12-24小時，過濾，濾渣棄去，取濾液濃縮至相對密度1.05-1.10;再加入乙醇使乙醇體積濃度達到75-80%，0-4。C冷藏靜置12-24小時過濾，取濾液濃縮揮發除去乙醇，樣品溶液經過10000-25000轉/分鐘的高速離心機離心，得到甘草醇沉組分；3)過膜將離心液經過截留分子量3000-6000Da中空纖維膜分離儀分離，操作壓力0.05-0.3MPa，截留液棄去，透過液即為膜分離組分；4)X-5大孔吸附樹脂分離將膜分離組分上樣於X-5大孔吸附樹脂柱上，上樣量與分離材料體積比為1:100-500，分別採用水和體積濃度30-50%乙醇作流動相洗脫，每次洗脫的體積為3-6個柱體積，流速為l-3個柱體積/小時；循環洗脫，洗脫液濃縮，濃縮至濃度為0.15-0.6克/毫升，過0.2-0.4微米濾膜，即為甘草苷大孔樹脂分離組分；5)工業色譜分離以粒徑5-40微米的C18矽膠鍵合固定相為色譜填料，以甲醇和水為流動相，梯度洗脫，甲醇的體積濃度從0-100%變化，最好從0-70%變化，收集目標組分，冷凍乾燥即為甘草苷，將樣品進行高效液相分析確定產品純度。所述色譜柱效為5000-20000塔板/米，色譜柱長為200毫米-600毫米，色譜柱內徑為20毫米-300毫米；所述樹脂柱長為40釐米-100釐米，樹脂柱內徑為10釐米-20釐米，樹脂填料為0.3-1.25毫米的X-5型大孔吸附樹脂。本發明具有以下優點1.樣品純度高。由於本發明採用了最先進的工業色譜分離製備技術，色譜填料為高分離能力的ODS(C18健合固定相)分離材料，利用工業色譜的高分離能力，可以保證產品的純度達到98%以上。2.重現性好。本發明利用工業色譜系統和ODS穩定的性能，可以保證甘草苷分離製備的重現性和穩定性。3.周期短。本發明從原藥材的粉碎提取到製備得到甘草苷產品，只需要7天的時間。4.有機殘留低。由於本發明摒棄了傳統工藝中溶劑萃取、矽膠柱層析等工藝，採用了有機溶劑使用量較少的工業色譜方法，而且最終產品採用冷凍乾燥處理，所以最終產品的有機溶劑殘留特別小。5.能夠實現大規模工業生產。本發明所採用工藝非常容易實現標準化，自動化，適於進行產業化大規模生產。圖1為本發明實施例1工業色譜製備甘草苷的製備色譜圖；圖2為本發明實施例1甘草苷的高效液相分析色譜圖。具體實施方式實施例l將甘草原藥材粉碎，定量稱取1千克，置於50升提取罐中，加入10升水煎煮2小時，過濾，濾液保存備用，濾渣中再加入10升水煎煮2小時，過濾，濾液與第一次合併，濾渣棄去。將提取液旋轉蒸發濃縮，得到240毫升至相對密度為1.12的浸膏。在浸膏中加入412毫升95%乙醇，充分攪拌，0X:冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至160毫升，相對密度1.05，在濃縮液中加入854毫升95%乙醇，充分攪拌，0。C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經過高速離心機(20000轉/分鐘)離心，得到甘草醇沉組分250毫升。將甘草醇沉組分加入到截留分子量3000Da中空纖維膜分離儀的進料罐中，調整操作壓力為O.lMPa，收集透過液，截留液棄去。使透過液濃度為30克/升。大孔吸附樹脂柱長80釐米，柱內徑10釐米，樹脂填料為0.3-1.25毫米的X-5型大孔吸附樹脂，上樣速度為lBV/h，分別用水和40%乙醇洗脫，收集40%乙醇洗脫部位，40%乙醇洗脫部位旋轉蒸發濃縮至密度為0.4克/毫升，過0.22微米濾膜，得到甘草樹脂分離組分30毫升。工業色譜製備工業色譜系統依次由高壓二元梯度泵、高壓進樣閥、色譜柱、紫外檢測器、色譜工作站組成。工業色譜柱柱長400毫米，內徑80毫米，色譜填料為10-20微米的C18鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設定紫外檢測波長為254nm，設定洗脫梯度(見表1)，初始流動相(20%甲醇-水)平衡色譜柱20分鐘，取甘草樹脂分離樣品10ml，進樣，按設定梯度洗脫，收集24分至27分5秒組分。洗脫結束，再次平衡柱子，進樣，收集洗脫組分。共進樣三次(見圖1)，將三次收集得到的洗脫組分，合併，旋轉蒸發濃縮至10毫升，再通過冷凍乾燥得到甘草苷產品2.0克，將樣品進行高效液相分析確定產品純度大於98%(見圖2)，取20毫克樣品進行核磁分析，對結構進行鑑定。核磁數據1HNMR400MHz(DMSO-d6)《ppm):10.599(1H,s,OH),7.65(lH,d,H-5)，7.45(2H,d,H-2',6')，7.06(2H,d,H-3'，5')，6.51(1H,dd，H-6)，6.35(1H,d,H-8)，5.53(1H,dd,H-2)，4.89(1H,d,Glc-H-l)，3.13.7(m,糖上質子及transH-3)，2.67(1H,dd，cisH-3)。13CNMR400MHz(DMSO-d6)S(ppm):78.64(C-2),43.16(C-3),189.99(C-4),128.39(C-5),110.55(C隱6)，164.62(C-7)，102.58(C-8),163.03(C-9),113.55(C-10),132.35(C-r)，127.97(C-2',C-6'),116.17(C-3',C-5')，157.44(C誦4'),100.30(Glc畫C-l)，73.20(Glc-C-2),77.03(Glc-C-3),69.71(Glc-C-4),76.61(Glc-C-5),60.69(Glc-C-6)。formulaseeoriginaldocumentpage5表1為工業色譜製備甘草苷的流動相梯度序號tableseeoriginaldocumentpage6實施例2將甘草原藥材粉碎，定量稱取0.5千克，置於20升提取罐中，加入6升水煎煮1小時，過濾，濾液保存備用，濾渣中再加入5升水煎煮3小時，過濾，濾液與第一次合併，濾渣棄去。將提取液旋轉蒸發濃縮，得到140毫升至相對密度為1.10的浸膏。在浸膏中加入240毫升95%乙醇，充分攪拌，0。C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至40毫升，相對密度1.07，在濃縮液中加入428毫升95%乙醇，充分攪拌，0。C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經過高速離心機(20000轉/分鐘)離心，得到甘草醇沉組分140毫升。將甘草醇沉組分加入到截留分子量6000Da中空纖維膜分離儀的進料罐中，調整操作壓力為O.lMPa，收集透過液，截留液棄去。使透過液濃度為25克/升。大孔吸附樹脂柱長40釐米，柱內徑10釐米，樹脂填料為0.3-1.25毫米的X-5型大孔吸附樹脂，上樣速度為0.5BV/h，分別用水和50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫部位，50%乙醇洗脫部位旋轉蒸發濃縮至密度為0.2克/毫升，過0.22微米濾膜，得到甘草樹脂分離組分18毫升。工業色譜柱柱長300毫米，內徑80毫米，色譜填料為10-20微米的C18鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設定紫外檢測波長為254nm，設定洗脫梯度，初始流動相平衡色譜柱20分鐘，取甘草樹脂分離樣品9ml，進樣，按設定梯度洗脫，收集目標組分。洗脫結束，再次平衡柱子，進樣，收集洗脫組分。共進樣兩次，將兩次收集得到的洗脫組分，合併，旋轉蒸發濃縮至6毫升，再通過冷凍乾燥得到甘草苷產品0.6克。實施例3將甘草原藥材粉碎，定量稱取5千克，置於250升提取罐中，加入60升水煎煮2小時，過濾，濾液保存備用，濾渣中再加入60升水煎煮2小時，過濾，濾液與第一次合併，濾渣棄去。將提取液旋轉蒸發濃縮，得到1.2升至相對密度為1.13的浸膏。在浸膏中加入2.1升95%乙醇，充分攪拌，0°C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至0.7升，相對密度1.08，在濃縮液中加入3.8升95%乙醇，充分攪拌，0"C冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經過高速離心機(20000轉/分鐘)離心，得到甘草醇沉組分1.5升。將甘草醇沉組分加入到截留分子量6000Da中空纖維膜分離儀的進料罐中，調整操作壓力為O.lMPa，收集透過液，截留液棄去。使透過液濃度為30克/升。大孔吸附樹脂柱長50釐米，柱內徑20釐米，樹脂填料為0.3-1.25毫米的X-5型大孔吸附樹脂，上樣速度為2BV/h，分別用水和45%乙醇洗脫，收集45%乙醇洗脫部位，45%乙醇洗脫部位旋轉蒸發濃縮至密度為0.5克/毫升，過0.22微米濾膜，得到甘草樹脂分離組分160毫升。工業色譜柱柱長600毫米，內徑100毫米，色譜填料為10-20微米的C18鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設定紫外檢測波長為254nm，設定洗脫梯度，初始流動相平衡色譜柱20分鐘，流速400毫升/分鐘，取甘草樹脂分離樣品30ml，進樣，按設定梯度洗脫，收集32分30秒至36分鐘組分。洗脫結束，再次平衡柱子，進樣，收集洗脫組分。共進樣6次(見圖1)，將6次收集得到的洗脫組分，合併，旋轉蒸發濃縮至100毫升，再通過冷凍乾燥得到甘草苷產品12.5克。實施例4將甘草原藥材粉碎，定量稱取10千克，置於250升提取罐中，加入100升水煎煮2小時，過濾，濾液保存備用，濾渣中再加入100升水煎煮2小時，過濾，濾液與第一次合併，濾渣棄去。將提取液旋轉蒸發濃縮，得到2.2升至相對密度為1.15的浸膏。在浸膏中加入3.8升95%乙醇，充分攪拌，(TC冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1.5升，相對密度1.09，在濃縮液中加入8升95%乙醇，充分攪拌，0t:冷藏靜置24小時，過濾，濾渣棄去，濾液濃縮至無醇味，濃縮液經過高速離心機(20000轉/分鐘)離心，得到甘草醇沉組分2.7升。將甘草醇沉組分加入到截留分子量3000Da中空纖維膜分離儀的進料罐中，調整操作壓力為O.lMPa，收集透過液，截留液棄去。使透過液濃度為85克/升。大孔吸附樹脂柱長100釐米，柱內徑20釐米，樹脂填料為0.3-1.25毫米的X-5型大孔吸附樹脂，上樣速度為0.5BV/h，分別用水和40%乙醇洗脫，收集40%乙醇洗脫部位，40%乙醇洗脫部位旋轉蒸發濃縮至密度為0.6克/毫升，過0.22微米濾膜，得到甘草樹脂分離組分270毫升。工業色譜柱柱長500毫米，內徑200毫米，色譜填料為10-20微米的C18鍵合固定相，柱效為15000塔板/米，設定紫外檢測波長為254nm,設定洗脫梯度，初始流動相平衡色譜柱20分鐘，流速800毫升/分鐘，取甘草樹脂分離樣品60ml，進樣，按設定梯度洗脫，收集32分30秒至36分鐘組分。洗脫結束，再次平衡柱子，進樣，收集洗脫組分。共進樣5次(見圖1)，將5次收集得到的洗脫組分，合併，旋轉蒸發濃縮至200毫升，再通過冷凍乾燥得到甘草苷產品28克。權利要求1.一種甘草苷的分離製備方法，其特徵在於1)提取稱取甘草原藥材，加入其重量8-12倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小時，得到提取液，將提取液濃縮濃縮至相對密度為1.10-1.15，得浸膏；2)醇沉將浸膏中加入乙醇使乙醇體積濃度達到50-70％，0-4℃冷藏靜置12-24小時，過濾，取濾液濃縮至相對密度1.05-1.10；再加入乙醇使乙醇體積濃度達到75-80％，0-4℃冷藏靜置12-24小時過濾，取濾液濃縮揮發除去乙醇，樣品溶液經過10000-25000轉/分鐘的高速離心機離心；3)過膜將離心液經過截留分子量3000-6000Da中空纖維膜分離儀分離，操作壓力0.05-0.3MPa，截留液棄去，透過液即為膜分離組分；4)X-5大孔吸附樹脂分離將膜分離組分上樣於X-5大孔吸附樹脂柱上，上樣量與分離材料體積比為1∶100-500，分別採用水和體積濃度30-50％乙醇作流動相洗脫，每次洗脫的體積為3-6個柱體積，流速為1-3個柱體積/小時；循環洗脫，洗脫液濃縮，濃縮至濃度為0.15-0.6克/毫升，過0.2-0.4微米濾膜，即為甘草苷大孔樹脂分離組分；5)工業色譜分離以粒徑5-40微米的C18矽膠鍵合固定相為色譜填料，以甲醇和水為流動相，梯度洗脫，甲醇的體積濃度從0-100％變化，收集目標組分，冷凍乾燥即為甘草苷。2.根據權利要求1所述甘草苷的分離製備方法，其特徵在於所述樹脂柱長為40釐米-100釐米，樹脂柱內徑為10釐米-20釐米，樹脂填料為0.3-1.25毫米的X-5型大孔吸附樹脂。3.根據權利要求1所述甘草苷的分離製備方法，其特徵在於所述色譜柱效為5000-20000塔板/米。4.根據權利要求1所述甘草苷的分離製備方法，其特徵在於所述色譜柱長為200毫米一600毫米，色譜柱內徑為20毫米-300毫米。5.根據權利要求1所述甘草苷的分離製備方法，其特徵在於所述梯度洗脫時，甲醇的體積濃度從0-70%變化，收集目標組分。全文摘要本發明涉及天然藥物的分離，具體地說是一種甘草苷的分離製備方法，將甘草植物粉碎後，用10倍量水煎煮得到提取液，再濃縮得到浸膏，加入乙醇醇沉兩次，然後通過6000Da分子量膜分離儀分離，膜分離透過液經X-5大孔吸附樹脂分離，乙醇水洗脫，得到的大孔樹脂分離組分經高效工業色譜柱分離，甲醇水梯度洗脫，收集洗脫液濃縮冷凍乾燥即得甘草苷。本發明產品純度高、製備量大，工藝穩定可靠；其特別適用於自中藥甘草中分離製備大量的高純度的甘草苷化合物。文檔編號C07H15/26GK101289480SQ20071001104公開日2008年10月22日申請日期2007年4月20日優先權日2007年4月20日發明者豐加濤,慧張,青徐,偉李,梁鑫淼申請人:中國科學院大連化學物理研究所