一種從單環刺螠腎管中提取血栓纖溶酶的方法與流程
2023-10-24 02:35:42
本發明涉及提取血栓纖溶酶的方法，具體是一種從單環刺螠腎管中提取血栓纖溶酶的方法。
背景技術：
近年來，生物體逐漸成為溶栓藥物的主要來源,例如來源於蚯蚓的蚓激酶。最近科學研究發現，單環刺螠體內含有的血栓纖溶酶具有顯著的溶栓活性,且較蚓激酶具備更多的優越性。單環刺蛻個體肥大，成體單環刺螠一般劃分為三部分，溼重比例分別為體壁(32％)、體腔液(12％)、內臟(56％)，廣泛分布於我國沿海,可以人工養殖,為血栓纖溶酶的研究提供了豐富的原料資源。最新研究證實，血栓纖溶酶主要由腎管分泌並貯存，且部分分布於體腔液中。國內針對單環刺螠中血栓纖溶酶的提取研究，現有報導的專利是：1、中國海洋大學申請的「一種血栓溶解酶的製備方法及其應用」(專利號ZL200610043371.3，以下簡稱為專利1)，其以單環刺螠整體為提取材料，包含了過多的雜質，且步驟繁多、工藝複雜、提取效率低。2、福建太平洋製藥公司申請的「一種介入溶血栓生物製品單環刺螠纖溶酶的製備工藝」(專利號ZL201410628153.0，以下簡稱專利2)，其僅以單環刺螠體腔液作為提取材料，固然有部分血栓纖溶酶存在於體腔液中，但內臟器官(如腎管)中的血栓纖溶酶卻被完全遺棄，未能將生物體內的血栓纖溶酶充分利用，導致生產效率低下，浪費資源。
鑑於此本申請人選取單環刺螠血栓纖溶酶的主要存在器官--腎管作為提取材料，有針對性地設計出一套高效的提取純化工藝，既簡化了工藝步驟，又利於產業化實施。
發明目的
本發明的目的在於提供一種從單環刺螠腎管中提取血栓纖溶酶的方法，其可高效地提取單環刺螠中的血栓纖溶酶，提高單環刺螠的利用率。
為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
一種從單環刺螠腎管中提取血栓纖溶酶的方法，通過如下步驟實現：
一、原材料分離：
取新鮮單環刺螠，洗淨再吸乾表面水分，解剖去除體壁，收集腎管於-20℃凍存；12h後，取出凍存腎管，勻漿機攪碎，室溫下自然融化，以3倍體積0.01mol/L，pH為7.4的磷酸鹽緩衝液在4℃條件下300目尼龍網過濾；10h後，以6000rpm/min離心40min，收集中層液，-80℃冷凍乾燥，凍品即為粗提物；
二、粗品純化：
取出步驟一所得的粗提物，4℃融化，在4℃下13000rpm/min離心30min，取中層清液用0.45μm微孔濾膜過濾，收集濾液於葡聚糖凝膠G-50柱體積的3％上樣分離，三蒸水洗脫，洗脫速度0.4ml/min，10min/管收集洗脫液，逐管測定蛋白濃度及酶活力，依次出現兩蛋白峰，收集酶活力較高的第一個峰組分，冷凍乾燥後於-20℃凍存，即為純化後的血栓纖溶酶。
採用上述方案後，本發明一種從單環刺螠腎管中提取血栓纖溶酶的方法，以單環刺螠血栓纖溶酶的主要存在部位--腎管為提取部位，可高效地提取單環刺螠中的血栓纖溶酶，提高單環刺螠的利用率。
附圖說明
圖1為本發明中Sephadex G-50凝膠層析圖譜；
圖2為本發明中血栓纖溶酶總纖溶酶活力測定圖(標準平板)；
圖3為本發明中尿激酶標準曲線血栓纖溶酶的總纖溶活力圖；
圖4為本發明中血栓纖溶酶的Native-PAGE分析圖；
圖5為本發明中血栓纖溶酶的HPLC分析圖；
圖6為本發明中血栓纖溶酶的SDS-PAGE分析圖；
圖7為本發明中蛋白分子量標準曲線圖；
圖8為本發明中單環刺螠血栓纖溶酶提取流程圖。
具體實施方式
本發明的一種從單環刺螠腎管中提取血栓纖溶酶的方法，通過如下步驟實現：
一、原材料分離：
取新鮮單環刺螠先用蒸餾水洗淨，再用濾紙吸乾表面水分，準確稱取4kg，解剖去除體壁，收集腎管於-20℃凍存。12h後，取出凍存樣品，勻漿機攪碎，室溫下自然融化，以3倍體積0.01mol/L，PH 7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)在4℃條件下300目尼龍網過濾。10h後，以6000rpm/min離心40min，收集中層液，-80℃冷凍乾燥，凍品即為粗提物。
二、粗品純化：
從-80℃冰箱中取出經步驟一處理後所得的粗提物，4℃融化，在4℃下13000rpm/min離心30min，取中層清液用0.45μm微孔濾膜過濾，收集濾液於葡聚糖凝膠(Sephadex)G-50柱體積(1cm×60cm)的3％上樣分離，三蒸水洗脫，洗脫速度0.4ml/min，10min/管收集洗脫液，逐管測定蛋白濃度及酶活力(見圖1)，從圖1中可以看出，經過Sephadex G-50凝膠層析後酶活力有兩個峰，第二個峰纖溶酶活力較低可直接排除。收集第一個峰組分即為血栓纖溶酶，冷凍乾燥後於-20℃凍存，即為純化後的血栓纖溶酶，質量為0.07g。
血栓纖溶酶的鑑定:
1.活力鑑定
使用富含纖溶酶原的纖維蛋白標準平板測定血栓纖溶酶的總纖溶活力，為了將純化產物的纖溶活力定量，實驗中使用不同活力單位的尿激酶標準品在標準平板上製成標準曲線y＝5.765x-2.2077(R2＝0.9926)(見圖3)，將圖2中7號透明圈的面積求對數帶入圖3的標準曲線中， 求得血栓纖溶酶的總纖溶酶活力為1461.5U/mg。圖2中的7號透明圈即為100μg血栓纖溶酶在36.5℃下，平板上孵育24h後產生的，在標準平板上的水解圈直徑為2.35cm。圖2中1-6號透明圈依次由含不同活力單位的尿激酶標準溶液產生：0U,20U,40U,80U,120U,160U。7號透明圈由100μg(1μg/μl)血栓纖溶酶溶液產生，透明圈直徑為2.35cm。查標準曲線可得血栓纖溶酶的總纖溶活力為每mg含個1461.5尿激酶活力單位。
2.純度及分子量鑑定
純度鑑定分別採用了Native-PAGE和HPLC的方法。在Native-PAGE中呈現單一電泳條帶(見圖4)，從圖4中可以看出，血栓纖溶酶呈單一電泳條帶。在HPLC檢測中，經示差檢測器測定，在14.3min處呈單一峰，純度在97％以上(見圖5)，分別調節2種不同的分光光度值測定，分析報告顯示血栓纖溶酶呈單一峰且平均峰面積百分比為97.2％。SDS-PAGE顯示，它在25kD附近呈現單一條帶(見圖6)，泳道1為0.5mg/ml，泳道2為1mg/ml，從圖中可以看出兩泳道條帶平行，血栓纖溶酶在25kD附近呈單一條帶，這表明所得血栓纖溶酶是一條單鏈蛋白質，不是由多個亞基組成的蛋白質。以標準蛋白各電泳條帶相對遷移率為縱坐標，標準蛋白分子量的對數為橫坐標，繪成蛋白質分子量標準曲線y＝-0.9176x+1.9623(見圖7)將遷移率0.611代入方程計算，得血栓纖溶酶分子量為25.2kD。
大鼠體內溶血試驗
取體重為250土20g的Wistar大鼠10隻，雌雄各半，用1％(重量百分數)的戊巴比妥水溶液，按0.1mol/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉。麻醉後，頸部正中切口，分離出右側頸總動脈長約10mm，先用動脈夾先後夾閉動脈遠心端和近心端，使兩端相距5mm，並有血液在動脈中充盈。兩端通直流電5mA，20min，電凝結束鬆開動脈夾，製作大鼠頸動脈血栓模型。取實施例中純化的單環刺螠血栓纖溶酶，用注射用生理鹽水配製濃度為10mg/ml的單環刺螠血栓纖溶酶10ml，無菌過濾。取頸動脈血栓模型大鼠5 只，每隻動物靜脈注射單環刺螠血栓纖溶酶2ml作為實驗組，再取頸動脈血栓模型大鼠5隻，靜脈注射同樣體積的生理鹽水，作為對照組。實驗結果表明：72h後，實驗組動物肢體行動恢復正常，而對照組動物肢體活動無明顯改善。說明經本工藝從單環刺螠中提取得到的血栓纖溶酶具有很好的溶解血栓的作用。
工藝路線特點總結
根據本工藝路線設計出了從單環刺螠腎管中提取血栓纖溶酶提取流程圖如圖8所示。
通過本提取工藝所得到的血栓纖溶酶與背景技術中的專利1和專利2對比(見表1)，可發現，專利1提得的血栓纖溶酶分子量較高，但本方案所得的血栓纖溶酶分子量檢測為25.2kD，更接近於以往報導的血栓纖溶酶的分子量，且專利1所得產物的纖溶酶活力和酶純度都不及本血栓纖溶酶。專利2提得的血栓纖溶酶與本方案所得血栓纖溶酶接近，但專利2以體腔液為提取材料通過三步純化，而本方案選取腎管為材料，只需Sephadex G-50一步純化即可得到血栓纖溶酶，這極大節約了純化的時間和成本，更便於應用在實際生產中。此外，平均每1000g單環刺螠，本提取工藝可提得血栓纖溶酶的質量為17.5mg，高於專利1的15.8mg和專利2的16.6mg。
表1不同提取部位和方法得到的血栓纖溶酶對比(每1000g)