抗鼠神經生長因子(ngf)的多克隆抗體的製備方法及其應用的製作方法

2023-10-12 00:22:59 2

專利名稱：：抗鼠神經生長因子(ngf)的多克隆抗體的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的製備方法，和檢測神經生長因子(NGF)的ELISA試劑盒。技術背景神經生長因子(nervegrowthfactor,NGF)是義大利科學家Levi-Montalcini1953年發現的神經營養因子，是目前研究最為透徹的，具有神經元營養和促突觸生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，它對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。1960年，美國科學家Cohen提取純化NGF，並證明其生物活性。1986年，Montalcini和Cohen因對NGF的傑出研究而榮獲諾貝爾生理醫學獎。90年代至今，國內外多家製藥公司和藥物研究機構相繼開始進行NGF開發研究。目前已開發出多種NGF試劑。NGF包括ci、e、Y三個亞單位，其中a亞單位功能尚不清楚，Y亞單位具有蛋白酶活性，e亞單位是NGF的活性亞單位。活性區P亞單位由兩個118個胺基酸組成的單鏈通過非共價鍵結合而成的二聚體。NGF在人體內主要分布於腦、神經節、虹膜、心臟、脾、胎盤等組織及成纖維細胞、平滑肌、骨骼肌、膠質細胞、雪旺氏細胞等。目前NGF主要來源於雄性小鼠頜下腺(與人類NGF有90X同源性)、牛精漿、蛇毒、和豚鼠前列腺。分子量為140kD(7sNGF,由a、p、Y三個亞單位和鋅離子構成)和13kD14kD(2.5sNGF，結構與e亞基基本相同。故又稱為P-NGF)。NGF與受體結合，通過受體介導的內吞機制產生內在化，形成由軸膜包繞、含有NGF、並保持其生物活性的小泡，經軸突沿微管逆行轉運至胞體，經酪氨酸蛋白激酶、酯醯肌醇f!、內源性環腺苷酸等第二信使體系的轉導，啟動一系列級聯反應，對靶細胞的某些結構或功能蛋白基因表達進行調控而發揮其生物效應。定性和定量地測定神經生長因子(NGF)的活性，對醫藥領域具有重大的作用。現有的NGF質量控制標準是採用雞胚背根神經節法，測定NGF的生物學活性，由於該法實驗誤差大，結果判定易受主觀因素影響。所以建立快速、準確、客觀的NGF含量的測定方法，不僅有利於NGF質量控制，也可用於NGF的藥代動力學研究，但這都需要NGF抗體的製備的獲得和檢測方法的建立。由於NGF的免疫原性較弱，很難獲得抗體，在國內NGF高效價抗體獲得還是一個空白。本發明通過特殊處理的NGF免疫兔子獲得了高效價的NGF抗體,並將其製成檢測試劑盒。
發明內容本發明的目的在於提供一種製備抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的方法；本發明的另一目的在於利用上述方法製備的多克隆抗體,製備一種可以定量檢測神經生長因子(NGF)的ELISA試劑盒，來檢測不同細胞、組織中神經生長因子(NGF)的定位及表達；該試劑盒可檢測血、培養上清、細胞、組織等不同樣品中神經生長因子(NGF)。為了解決上述問題，本發明採用的技術方案是一種抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的製備方法採用純化的鼠頜下腺神經生長因子(NGF)作免疫原，採用戊二醛聚合NGF後，免疫正常家兔，收集血清，從中分離純化出抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體。前述的一種抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體製備方法，包括以下步驟a、純化的NGF經0.1%-0.5%戊二醛聚合後按照10"g~500ug/只，與等體積完全弗氏佐劑充分混合、乳化，皮下多點注射正常家兔；b、2周4周後，純化的並經0.1%-0.5%戊二醛聚合的NGF與等體積不完全弗氏佐劑充分混合、乳化，再次皮下多點注射；c、2周4周後，重複步驟b;d、末次免疫一周後採耳血，間接ELISA方法測效價，大於l:1000即可；e、耳緣靜脈採血，收集血清，一20'C保存。前述的製備的抗鼠神經生長因子(NGF)多克隆抗體的製備，還包括以下純化步驟(1)、製備抗原親合柱(2)、結合緩衝液(PBS)充分平衡抗原偶聯的親和層析柱；血清與PBS混合後，反覆上樣3次；(4)、PBS充分洗滌，去除未結合蛋白；(5)、洗脫緩衝液洗滌特異結合的抗免疫抗原的多克隆抗體，收集至加有適量10XPBSpH7.6的燒杯中；(6)、透析至1XPBS中，蛋白定量，分裝，一20'C保存。上述純化步驟中，抗原親合柱的製備，包括純化的抗原(小鼠頜下腺神經生長因子NGF)透析於偶聯緩衝液中，預冷的0.5mM50mMHC1洗滌CNBr—活化的s印harose4fastflow膠數次，負壓超濾，並置換於偶聯緩衝液中；將抗原與活化的膠粒混合，4'C攪拌過夜；用偶聯緩衝液洗滌未完全結合的抗原；封閉緩衝液室溫作用0.5小時以上，封閉未被抗原飽和的活化位點；洗滌緩衝液交替洗滌2次以上，偶聯抗原的膠粒保存於20%的酒精中。上述純化步驟中，兔多克隆免疫血清與PBS的混合比為1:21:5;上述純化步驟中，上樣的流速為O.1ml/min1ml/min;上述純化步驟中，洗脫緩衝液為0.1M鹽酸一甘氨酸緩衝液，pH2.8;上述純化步驟中，偶聯緩衝液為O.lmol/LNaHCO3，0.5mol/LNaCl，pH8.3;上述純化步驟中，封閉緩衝液為封閉緩衝液為0.2mol/L甘氨酸；上述純化步驟中，洗滌緩衝液為醋酸鹽緩衝液0.1mol/LCH3COONa和0.5mol/LNaCl,pH4.0)。上述方法製備的抗鼠神經生長因子(NGF)多克隆抗體，可以用來中和NGF的生物學活性。可以作各種標記，用以組建檢測血液、尿樣、培養上清和各種細胞、組織中鼠神經生長因子(NGF)含量的試劑盒。純化也可採用硫酸氨一正辛酸法取一定體積的血清，用0.06mol/LpH4.8的HAc-NaAc緩衝液稀釋2倍或4倍；逐滴加入正辛酸，使終濃度為75w1/ml(正辛酸/兔血清)，並攪拌30min,室溫下12000r/min離心20min後取上清液；加入體積為上清1/10的0.1mol/LpH7.4的PBS溶液，靜置2小時或4'C過夜；4'C12000r/min離心30min，棄上清；將沉澱溶於一定體積的0.01mol/LpH7.4的PBS中，用50100倍體積的0.01mol/LpH7.4的PBS於4'C透析過夜。本發明的另一技術方案是一種檢測NGF的ELISA試劑盒，採用抗鼠神經生長因子(NGF)多克隆抗體為捕獲抗體，識別並結合待測標本中的NGF，採用a、以生物素標記的抗鼠頜下腺神經生長因子(NGF)多克隆抗體為檢測抗體，通過親和素/鏈黴親和素一一辣根過氧化物或親和素/鏈黴親和素一一鹼性磷酸酶催化底物顯色;或b、以酶標記的抗鼠頜下腺神經生長因子(NGF)多克隆抗體為檢測抗體，直接加底物顯色；或c、以抗鼠頜下腺神經生長因子(NGF)多克隆抗體為二級抗體，以酶標記的山羊的抗兔抗體為三級抗體，催化底物顯色。然後根據標準品0D值繪製標準曲線，在標準曲線上査出待測標本中神經生長因子(NGF)的含量，試劑盒包括包被抗體1支、檢測抗體1支、神經生長因子(NGF)標準品1支、底物液1支、96孔ELISA板1塊。所述的檢測神經生長因子(NGF)的ELISA試劑盒，包被抗體濃度為範圍為0.2ug/ml-20ug/ml，檢測抗體濃度範圍為0.2ug/ml-20ug/ml;NGF標準品濃度範圍為5pg/ml_5iig/ml。一種檢測神經生長因子(NGF)的方法，包括以下步驟(1)、將稀釋好的包被抗體加入ELISA板，50200ul/孔，4'C放置18h以上；(2)、封閉倒掉包被液，洗板3次，200400ul/孔，30s/次；加入封閉液50200u1/孔;(3)、倒掉封閉液，不洗，加待檢標本、陰性對照及倍比稀釋的標準品，50200iil/孔，室溫於搖床上孵育13h。(4)、倒掉待檢標本，洗3次。加生物素標記多克隆抗體50200ul/孔，於室溫搖床上作用13h。(5)、倒掉一抗，洗3次，加入l:2001:IOOO稀釋的鏈黴親和素一辣根過氧化物酶結合物，50~200"l/孔，於室溫搖床上作用10min1h。(6)、洗5次，加入底物Turbo-TMB50200u1/孔，避光作用15min30min,至標準曲線出現明顯梯度。(7)、加入2MH2S0410100ixl/孔，終止反應。(8)、ELISA讀數儀測450nm處OD值，繪製標準曲線。本發明的有益效果是:本發明克服了由於NGF的免疫原性較弱，很難獲得抗體的缺陷，通過特殊處理的NGF免疫家兔獲得了高效價的NGF抗體，並將其製成檢測試劑盒。本發明使神經生長因子(NGF)的有無及含量改變的檢測成為可能；使體外實驗中不同培養體系、不同純化階段中神經生長因子(NGF)的有無及含量改變的檢測成為可能；使神經生長因子(NGF)在不同細胞、組織的表達、定位等檢測成為可能；為神經生長因子(NGF)的受體研究等提供幫助。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明並不受限於下述實施例。實施例1多克隆抗體的製備製備1、純化的NGF經戊二醛聚合後按照150ug/只，與等體積完全弗氏佐劑充分混合、乳化，皮下多點注射正常家兔；2、一個月後，相同量抗原與不完全弗氏佐劑充分混合、乳化，再次皮下多點注射；3、一個月後，重複步驟2;4、末次免疫一周後採耳血，間接ELISA方法測效價，大於l:1000即可；5、耳緣靜脈採血，50ml/次，採2次，收集血清，一20'C保存。實施例2多克隆抗體的純化1、抗原親合柱的製備純化的抗原(小鼠頜下腺神經生長因子NGF)透析於偶聯緩衝液(0.1mol/LNaHCO3，0.5mol/LNaCl，pH8.3)中，預冷的0.5mM50mMHC1洗滌CNBr一活化的s印harose4fastflow膠數次，負壓超濾，並置換於偶聯緩衝液中；將抗原與活化的膠粒混合，4X:攪拌過夜；用偶聯緩衝液洗滌未完全結合的抗原；封閉緩衝液(0.2mol/L甘氨酸)室溫作用0.5小時以上，封閉未被抗原飽和的活化位點；偶聯緩衝液和醋酸鹽緩衝液0.1mol/LCH3COONa和0.5mol/LNaCl，pH4.0)交替洗滌2次以上，偶聯抗原的膠粒保存於20%的酒精中。2、結合緩衝液(PBS)充分平衡抗原偶聯的親和層析柱；3、兔多克隆免疫血清lml與3mlPBS混合後，反覆上樣3次，流速0.5ml/min;4、PBS充分洗滌，去除未結合蛋白；5、洗脫緩衝液(0.1M鹽酸一甘氨酸緩衝液，pH2.8)洗滌特異結合的抗免疫抗原的多克隆抗體，收集至加有適量10XPBSpH7.6的燒杯中；6、透析至1XPBS中，蛋白定量，分裝，一20'C保存。實施例3硫酸氨一正辛酸法純化法取一定體積的血清，用0.06mol/LpH4.8的HAc-NaAc緩衝液稀釋2倍或4倍；逐滴加入正辛酸，使終濃度為75ul/ml(正辛酸/兔血清)，並攪拌30min，室溫下12000r/min離心20min後取上清液；加入體積為上清1/10的0.1mol/LPH7.4的PBS溶液，靜置2小時或4'C過夜；4'C12000r/min離心30min，棄上清；將沉澱溶於一定體積的0.01mol/LpH7.4的PBS中,用50100倍體積的0.01mol/LpH7.4的PBS於4'C透析過夜。實施例4ELISA試劑盒採用兔抗神經生長因子(NGF)多克隆抗體為捕獲抗體，識別並結合待測標本中的神經生長因子(NGF)，以生物素標記的高親和力抗神經生長因子(NGF)單克隆抗體為檢測抗體，通過鏈黴親和素一辣根過氧化物酶催化底物顯色。根據標準品OD值在雙對數坐標紙上繪製標準曲線，在標準曲線上查出待測標本中NGF的含量。試劑盒提供(1)、包被抗體l支(120使用時用包被緩衝液作100倍稀釋；(2)、檢測抗體l支(120使用時用稀釋緩衝液作100倍稀釋；(3)神經生長因子(NGF)標準品1支(20u1):0.5mg/ml，使用時用稀釋液稀釋。(4)Turbo-TMB底物1支；(5)96孔ELISA板1塊。自備試劑和材料(1)0.1Mphosphatebuffer,0.15MNaCl,pH7.4(PBS);(2)包被緩衝液0.05MNa2C03-NaHC03，PH9.6;(3)封閉液1%BSA/PBS,0.02%硫柳汞;(4)洗滌液0.1MPBS,pH7.4,0.05%TWeen20;(5)稀釋液PBS,0.5%BSA，0.02%硫柳汞。(6)酶標儀等。操作步驟(1)、包被將稀釋好的包被抗體加入ELISA板，100ul/孔，4'C放置18h以上；(2)、封閉倒掉包被液，洗板3次，300ul/孔，30s、次；加入封閉液100u1/孔；(3)、倒掉封閉液，不洗，加待檢標本、陰性對照及倍比稀釋的標準品，100ul/孔，室溫於搖床上孵育2小時。標準品稀釋方法取標準品lul，加入lml稀釋緩衝液中，充分混勻，作l:10，1:102，(1:10"/3，1:103，1:10、1:10%1:106系列稀釋，成為500ng/ml，50ng/ml.16.67ng/ml，5ng/ml，500pg/ml，50pg/ml，5pg/ml。(4)、倒掉待檢標本，洗3次。加生物素標記多克隆抗體100"1/孔，於室溫搖床上作用2小時。(5)、倒掉一抗，洗3次，加入l:500稀釋的鏈黴親和素一辣根過氧化物酶結合物，100u1/孔，於室溫搖床上作用30分鐘。(6)、洗5次，加入底物Turbo-TMB100u1/孔，避光作用15min30min,至標準曲線出現明顯梯度。(7)、加入2MH2S0450ul/孔，終止反應。(8)、ELISA讀數儀測450nm處OD值，繪製標準曲線。質量控制(1)、靈敏度本測定盒靈敏度〈10pg/ml。(2)平行測定三份不同濃度的樣品，計算測定結果的平均值與標準差，並計算其變異係數。結果見表l。表l批內變異係數測定結果tableseeoriginaldocumentpage12通過對三份不同濃度樣品的測定，計算出本試劑盒批內變異係數最大為5.5%,而一般規定試劑盒的批內精密度(CVX)不超過10%,結果表明試劑盒的精密度良好。權利要求1、一種抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的製備方法，採用純化的鼠頜下腺神經生長因子(NGF)作免疫原，採用戊二醛聚合NGF後，分批次免疫正常家兔，加強免疫後一周收集血清，從中分離純化出抗鼠頜下腺神經生長因子(NGF)的多克隆抗體。2、根據權利1的一種抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的製備方法，其特徵在於，其具體步驟是a、純化的NGF經0.1呢"a5呢戊二醛聚合後與等體積完全弗氏佐劑充分混合、乳化，皮下多點注射正常家兔，注射劑量為10ug500ug/只；b、2周4周後，純化的並經0.1%-0.5X戊二醛聚合的NGF與等體積不完全弗氏佐劑充分混合、乳化，再次皮下多點注射，注射劑量為10wg500iig/只；c、2周4周後，重複步驟b;d、末次免疫一周後採血，收集血清，一20'C保存。3、如權利要求1或2所述的抗鼠神經生長因子(NGF)多克隆抗體的製備方法，還包括以下的純化步驟(1)、製備抗原親合柱(2)、結合緩衝液(PBS)充分平衡抗原偶聯的親和層析柱；(3)、兔多克隆免疫血清與PBS混合後，反覆上樣2-4次；(4)、PBS充分洗滌，去除未結合蛋白；(5)、洗脫緩衝液洗滌特異結合的抗免疫抗原的多克隆抗體，收集至加有適量10XPBSpH7.6的燒杯中；透析至1XPBS中，蛋白定量，分裝，一20'C保存。4、如權利要求1或2所述的抗鼠神經生長因子(NGF)多克隆抗體的製備方法，其抗體純化採用硫酸氨一正辛酸法。5、如權力要求3所述的製備的抗鼠神經生長因子(NGF)多克隆抗體的製備方法，其特徵在於所述的兔多克隆免疫血清與PBS的混合比為1:21:5;所述的上樣流速為0.1ml/min1ml/min;所述的洗脫緩衝液為0.1M鹽酸一甘氨酸緩衝液，pH2.8。6、一種檢測神經生長因子(NGF)的試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有權利要求1或2所述方法製備的多克隆抗體。7、如權力要求6所述的一種檢測神經生長因子(NGF)的試劑盒，其中所述的試劑盒還包括檢測抗體、神經生長因子(NGF)標準品、Turbo-TMB底物、ELISA板。8、一種檢測神經生長因子(NGF)的方法，採用抗鼠神經生長因子(NGF)多克隆抗體為捕獲抗體，識別並結合待測標本中的NGF，採用a、以生物素標記的抗鼠頜下腺神經生長因子(NGF)多克隆抗體為檢測抗體，通過親和素/鏈黴親和素一一辣根過氧化物或親和素/鏈黴親和素一一鹼性磷酸酶催化底物顯色；或b、以酶標記的抗鼠頜下腺神經生長因子(NGF)多克隆抗體為檢測抗體，直接加底物顯色；或c、以抗鼠頜下腺神經生長因子(NGF)多克隆抗體為二級抗體，以酶標記的山羊的抗兔抗體為三級抗體，催化底物顯色；然後根據標準品0D值繪製標準曲線，在標準曲線上査出待測標本中神經生長因子(NGF)的含量。9、根據權利8所述的一種檢測神經生長因子(NGF)的方法，其特徵在於由此建立的檢測神經生長因子(NGF)的ELISA試劑盒，包被抗體濃度為範圍為0.g/ml-20ug/ml，檢測抗體濃度範圍為0.2"g/ml-20ug/ml;NGF標準品濃度範圍為5pg/ml-5ug/ml。10、根據權利8所述的一種檢測神經生長因子(NGF)的方法，其具體步驟如下(1)、將稀釋好的包被抗體加入ELISA板，50200ixl/孔，4'C放置18h以上；(2)、封閉倒掉包被液，洗板3次，200400u1/孔，30s/次；加入封閉液50200u1/孔；(3)、倒掉封閉液，不洗，加待檢標本、陰性對照及倍比稀釋的標準品，50200!il/孔，室溫於搖床上孵育13h。(4)、倒掉待檢標本，洗3次。加生物素標記多克隆抗體50200ul/孔，於室溫搖床上作用13h。(5)、倒掉一抗，洗3次，加入l:200~1:1000稀釋的鏈黴親和素一辣根過氧化物酶結合物，50200!i1/孔，於室溫搖床上作用10min1h。(6)、洗5次，加入底物Turbo-TMB50200"1/孔，避光作用15min30min,至標準曲線出現明顯梯度。(7)、加入2MH2S0410~100u1/孔，終止反應。(8)、ELISA讀數儀測450nm處OD值，繪製標準曲線。全文摘要本發明公開了抗鼠神經生長因子(NGF)的多克隆抗體的製備方法及其在酶聯免疫測定方法中的應用。用於鼠頜下腺NGF為免疫原製備的多克隆抗體可以用來定量檢測小鼠生長因子。由此組裝的試劑盒可以測定不同組織細胞神經生長因子的定位、表達以及檢測血液、細胞、組織、培養基上清等不同樣品中NGF含量。文檔編號C07K16/22GK101633694SQ20081007147公開日2010年1月27日申請日期2008年7月24日優先權日2008年7月24日發明者付永超,任宏偉,吳敏華,朗孫,楊幼瑤,熊玲媛,鄒宇飛,馬凌燕,馬彬雲申請人:任宏偉;鄒宇飛