富馬酸二甲酯在製備治療蛛網膜下腔出血後早期腦損傷藥物的應用的製作方法

2023-10-08 00:16:24

富馬酸二甲酯在製備治療蛛網膜下腔出血後早期腦損傷藥物的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了富馬酸二甲酯在製備治療蛛網膜下腔出血後早期腦損傷藥物的應用。富馬酸二甲酯能夠激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路，降低了SAH後的EBI腦損傷，減弱EBI發展，同時改善皮質細胞凋亡、神經壞死、腦水腫、血腦屏障損傷，為臨床治療SAH後的EBI提供新的方法。
【專利說明】富馬酸二甲酯在製備治療蛛網膜下腔出血後早期腦損傷藥物的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫藥【技術領域】，具體涉及一種醫藥新用途，特別涉及DMF治療蛛網膜下腔出血後早期腦損傷的應用。
【背景技術】
[0002]蛛網膜下腔出血(experimentalsubarachnoid hemorrhage, SAH)是一種高死亡率和高致殘率的腦血管疾病，指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網膜下腔引起的一種臨床症候群，又稱為原發性蛛網膜下腔出血，約佔急性腦卒中的10%。蛛網膜下腔出血(SAH)常伴隨許多相互關聯的併發症，如急性/遲發性腦血管痙攣、腦水腫、阻塞性/交通性腦積水、瀰漫性/局灶性腦缺血或梗死，和持久的認知缺陷。在中國，大約每年有137，200人由於顱內動脈瘤破裂發生了蛛網膜下腔出血，儘管經過顯微外科和血管內手術技術的新發展，但是其死亡率和致殘率卻沒有明顯的改善。近年來研究發現早期腦損傷(early brain injury, EBI)可能是導致SAH患者死亡的主要原因。EBI的發病機制是一系列複雜的病理、生理變化，主要包括全腦缺血、血腦屏障的破壞、腦水腫、氧化應激反應、免疫炎症途徑和細胞死亡途徑等。
[0003]富馬酸二甲酯DMF(Dimethylfumarate)，CH300CCH=CHC00CH3,它最初被確認為一種非常有效的缺氧細胞的放射增敏劑。後來結合三個其它富馬酸酯基(FAE)的DMF在德國被授權口服治療牛皮癬(Fumaderm)。偶見報導治療其它疾病，如類脂質漸進性壞死，環狀肉芽腫，結節病也被發現用DMF治療。近日，III期臨床試驗發現，DMF (BG-12)成功地降低了多發性硬化症的殘疾進程的復發率和復發時間。DMF被認為具有無重大免疫抑制的免疫調節特性。歐盟EMA在2013年3月21日批准DMF以名稱「Tecfidera」推薦作為多發性硬化症MS的口服治療劑；2013年3月27日美國FDA批准Tecf idera膠囊治療成人復髮型多發性硬化症。
[0004]目前，對於SAH後的早期``腦損傷EBI，還缺乏有效藥物的治療，也沒有DMF對EBI進行治療的報導。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是富馬酸二甲酯在製備治療蛛網膜下腔出血後早期腦損傷藥物的應用。
[0006]本發明的一個優選技術方案中，所述藥物組合物包含藥學上有效量的富馬酸二甲酯和藥學上可接受的載體。
[0007]本發明的一個優選技術方案中，所述藥物組合物為片劑或膠囊或緩釋劑。
[0008]本發明的一個優選技術方案中，所述藥物組合物用於靜脈滴注。
[0009]本發明中，可以採用本領域常規的方法，可將富馬酸二甲酯製備成適於胃腸道給藥或者非胃腸道給藥的藥物製劑。製劑形式可以為片劑、膠囊劑或者緩釋劑等。本發明中富馬酸二甲酯的在不同規格製劑中，其質量含量可以為1%_99%，優選為10-95%。且所述藥學上可接收的載體為本領域常規輔料。藥物組合物的藥劑量根據給藥對象、給藥途徑或藥物的製劑形式不同，可以進行適當的變化，但應當保證藥物組合物在動物體內能夠達到有效的血藥濃度。
[0010]本發明建立了隨機4個實驗組:對照組，SAH組，SAH+賦形劑組；SAH+DMF組，通過注射自體血到視交叉池建立大鼠蛛網膜下腔出血模型，研究富馬酸二甲酯對SAH後的早期腦損傷的作用。本發明顯示，在SAH後，用DMF進一步激活Keapl-Nrf2-ARE信號通路(Kelch-like ECH-associated protein1-NucIear factor erythroid2~relatedfactor2-Antioxidant responsive element),下調炎症反應和氧化應激，能夠對EBI進行有效防治，而且對皮質細胞凋亡、神經壞死、腦水腫、血腦屏障損傷也顯示一定療效。
[0011]所有數據以平均值土標準差表示。採用SPSS12.0軟體對數據進行統計分析。所有數據進行單因素方差分析。不同實驗組之間的差異由費舍爾的LSD後期測定確定。以P〈0.05為有統計學意義。
[0012]本發明的有益效果:本發明通過實驗證明了 DMF能夠激活Keap 1-Nrf 2-ARE信號通路，降低了 SAH後的EBI腦損傷，減弱EBI發展，同時改善皮質細胞凋亡、神經壞死、腦水腫、血腦屏障損傷，為臨床治療SAH後的EBI提供新的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:
[0014]圖1為TUNEL染色和Fluoro-jade B染色(FJB)，比例尺=50微米。
[0015]圖2為各組定量分析的細胞壞死率和細胞凋亡率。**P〈0.01和*P〈0.05vs對照組；# # Ρ〈0.01, # Ρ〈0.0`5vs SAH+ 賦形劑組。
[0016]圖3為各組的腦組織含水量值。柱形代表平均值土標準差(SEM)，組(n=10，每組)。**P〈0.01 和 *P〈0.05vs 對照組，# # Ρ〈0.01，# Ρ〈0.05vsSAH+ 賦形劑組。
[0017]圖4 為 SAH 後的大腦中 Keapl，Nrf2, H0-1, GAPDH 表達的 Western blot 分析；其中，I為對照組，2為SAH組，3為SAH+賦形劑組，4為SAH+DMF組。
[0018]圖5為Western blot定量分析的印跡結果表明，對於Keapl,Nrf2,H0_l,GAPDH這些蛋白，SAH組中的GAPDH蛋白含量顯著高於對照組的GAPDH蛋白含量，並且被DMF抑制。**P〈0.01 和 *P〈0.05vs 對照組;# # Ρ〈0.01, # Ρ〈0.05，vs SAH+ 賦形劑組。
[0019]圖6為SAH後Nrf2的DNA結合情況的放射自顯影EMSA，其中，I為對照組，2為SAH組，3為SAH+賦形劑組，4為SAH+DMF組。
[0020]圖7為通過計算機輔助的光密度掃描定量Nrf2的DNA結合活性的含量，並以一個任意密度測量單元(ADU)來表示。柱形代表平均值土標準差(S.E.M.)，每組10。林P〈0.01和 *Ρ〈0.05vs 對照組;，## P<0.01, # P<0.05vs SAH+ 賦形劑組。
[0021]圖8為賦形劑組和DMF組的腦組織樣本中的Keapl，Nrf2和H0_1的免疫組化研究。(比例尺=50微米)。
[0022]圖9A為各組腦組織H0-1，NQOl和GSTal的mRNA表達(每組10隻)；圖9B為各組腦組織H0-1, NQOl和GSTal的mRNA表達(每組10隻);**P〈0.01和*P〈0.05vs對照組；# # Ρ〈0.01，# Ρ〈0.05vs SAH+ 賦形劑組。[0023]圖10 為免疫定量分析。**P〈0.01 和 *P〈0.05vs 對照組；## Ρ〈0.01，# Ρ〈0.05vsSAH+賦形劑組。
[0024]圖11為DMF對大腦中的抗氧化劑和解毒酶表達的影響。條帶代表平均值土標準差(N=10，每組)。**P〈0.01 和 *P〈0.05vs 對照組；# # P〈0.01，# P〈0.05vs SAH+賦形劑組。
[0025]圖12為SAH後分析不同組的MDA的濃度含量評估其氧化應激水平；**P〈0.01和*P〈0.05vs 對照組；# P<0.05vs SAH+ 賦形劑組。
[0026]圖13為SAH後分析不同組的SOD的濃度含量評估其氧化應激水平；**P〈0.01和*P〈0.05vs 對照組；# P<0.05vs SAH+ 賦形劑組。
[0027]圖14為SAH後分析不同組的GSH-Px的濃度含量評估其氧化應激水平；**P〈0.01和*P〈0.05vs對照組；# P<0.05vs SAH+賦形劑組。
[0028]圖15為ELISA法測定SAH後在受傷大腦的炎症介質的變化。條帶代表平均值土標準差 S.E.M.(N=IO,每組)。**P〈0.01 和 *P〈0.05vs 對照組；# Ρ〈0.05vs SAH+ 賦形劑組。
[0029]圖16為四組大鼠MWM試驗的路徑示意圖。
[0030]圖17A-17D為四組大鼠在MWM試驗中的空間學習和記憶指標。逃跑潛伏期和遊泳距離超過16項試驗(17A，17C)和第2-5天平均每天的逃跑潛伏期和遊泳距離指標(17B，17D)。
【具體實施方式】
[0031]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0032]一.材料、儀器
[0033]血紅素加氧酶-1購自Santa Cruz公司(稀釋1:200);—抗購自Santa Cruz生物技術公司，IgG抗體購自Santa Cruz生物技術公司，Fluoro-jade B染色試劑盒購自美國Histo-Chem公司；EMSA凝膠移位檢測試劑盒購自美國Promega公司；DeadEnd Flurometric試劑盒，購自美國Promega公司；GAPDH購自Sigma公司；RANS0D SOD檢測試劑盒購自英國朗道公司，組織穀胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒購自美國西北生命科學公司；TNF-a購自法國DIACL0NE研究所；IL-1 β，IL-6購自比利時BiosourceSA公司；GAPDH購自Sigma公司(1:8000 用 PBST 稀釋);Nrf2 的寡核苷酸探針(5』 -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 的 3』 )末端標記[ν-32Ρ]ΑΤΡ由中國北京Free生物技術公司製備。
[0034]動物:SD大鼠(Sprague-Dawley rats)( 300 — 350克)均購自中國蘇州蘇州大學動物中心。所有的程序是根據動物護理委員會和美國國立衛生研究院的關懷和使用動物的指南進行。
[0035]常規試劑及設備:10%中性甲醛、50%三氯乙酸(TCA)溶液、無水乙醇、生理鹽水、蒸餾水、安爾碘消毒液、10%水合氯醛、勻漿玻璃皿、精密電子稱、烘乾器、紫外分光光度儀、離心機、手術器械一套。
[0036]二.方法
[0037]1.隨機建立4個實驗組，共40隻大鼠，每組10隻:對照組，SAH組，SAH+賦形劑組；SAH+DMF組。SAH+DMF組大鼠手術之後，接受2天的每天兩次口服的DMF15毫克/公斤。大鼠SAH+賦形劑組接收相同給藥方式的等量的賦形劑(生理鹽水)。SAH後48小時，動物被斷頭處死以進行組織分析。
[0038]2.大鼠SAH蛛網膜下腔出血模型建立
[0039]將大鼠用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉成功後，俯臥固定於操作臺上，頭頂部備皮，安爾碘常規消毒。採用立體定向注射技術，構建視交叉前池一次注血SAH模型。大鼠盧頁骨頂部前囟前方7.5mm開骨窗,骨窗直徑約2mm,出血較多時可用骨臘壓迫止血，翻轉大鼠，使其仰臥位，消毒後解剖大鼠腹側部尾動脈，Iml注射器不抗凝下抽取動脈血0.35ml，採用立體定向注射技術，矢狀面進針，方向與冠狀面呈45度角，進針約10_12mm至視交叉前池，300ul的非肝素化動脈血經立體定向方式20s內注射入視交叉前池，注血後穿刺點壓迫2min，縫合切口。大鼠背部皮下注射IOml生理鹽水防止術後脫水。大鼠保溫復甦至清醒後自由飲食飲水。對照組開顱骨頂部開骨窗但不注入動脈血。
[0040]3.TUNEL檢測腦組織細胞凋亡
[0041]使用末端脫氧核苷酸轉移酶缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡。取福馬林溶液中固定一周以上腦組織，常規脫水、透明、浸蠟、包埋後，切片4μπι，貼於多聚賴氨酸處理的玻片上。石錯切片脫臘至水。TUNEL (terminaldeoxynucleotidyl transferasemediated dUTP2biotin nick2end labeling)法檢測細胞調亡。每張切片在200倍視野下隨機選取不重疊的10個視野，計數TUNEL陽性細胞數(胞核呈棕黃色顆粒)和細胞總數。腦組織損傷程度用調亡指數表示。
[0042]4.Fluoro-jade B染色法檢測腦組織細胞凋亡
[0043]Fluoro-jade B (Histo-Chem公司，傑斐遜,美國阿肯色州)用來作為神經元損傷的標誌物。具體步驟方法:①取4-6μπι的石蠟切片，經過二甲苯、無水乙醇及各梯度酒精脫蠟水化。②預處理:於暗室室溫中，置入0.06%的ΚΜη04溶液孵育15min。③PBS衝洗3次，每次5min。④滴加Fluoro-Jade B工作溶液(0.1%乙酸溶劑)孵育60min。⑤PBS溶液衝洗3次,每次5min。⑥暗室中常溫風乾,滴加抗突光淬滅封片劑，加蓋玻片，雷射顯微鏡拍照觀察。
[0044]在整個大腦的相同區域的每個分區統計正染色細胞的數目，觀察10個顯微視野中(在X 200倍率)進行計數，並計算每個視野的平均百分比。
[0045]5.腦組織含水量的測定
[0046]各組大鼠於SAH後47h水合氯醛麻醉，開顏取全腦，切取穎底腦皮質迅速放入預先稱好重量的玻片上稱重，此重量減去玻片重量即為溼重，隨後放入烤箱中在100°C條件下烘72h後再次稱重，此重量減去玻片重量即為乾重，腦水腫指數即可用下述公式求得。腦水腫指數=[(溼重-乾重)/溼重]X 100%。
[0047]6.Western blot 檢測 Keapl，Nrf2, HO-1, GAPDH
[0048]針對Keapl，Nrf2的第一抗體和血紅素加氧酶-1進行印跡(在PBS+吐溫20(PBST)以1:200全部稀釋，GAPDH (1:8000用PBST稀釋)用作上樣對照。具體步驟:①蛋白樣品獲得:將液氮中腦組織滴加勻漿緩衝液20mM Tris, pH7.6,通過電泳上樣裂解細胞；4°C，12，OOOg離心15min。取上清液為樣品。②電泳、轉移:樣品通過8%SDS_PAGE分離，電泳轉移至PVDF膜。③免疫反應:轉移通過滴加5%脫脂乳阻斷，室溫2h;滴加抗Nrf2,抗H0-1，(一抗)，4°C溼盒鮮育，24h。工作效價1:200，1:150。GAPDH做對比。採用PBS+Tween20 (PBST)分別洗膜，IOminX6次；滴加HRP標記二抗，工作效價1:400，室溫孵育2h。④顯色拍照。
[0049]7.核蛋白的提取及電泳遷移率變動分析(EMSA)
[0050]使用凝膠移位檢測試劑盒，進行EMSA。Nrf2的寡核苷酸探針(5』 -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 的 3』 )末端標記[Y _32P]ATP (購自 Free 生物技術)。具體方法步驟:通過ELISA方法分析大鼠腦皮層中細胞活素因子IL-1 β，TNF-α和IL-6表達情況比較。取冰凍腦組織於玻璃攪拌器中，加入ImlPBS緩衝液中(lmmol/L of PMSF, lmg/L胃酶抑素A, lmg/L抑酶肽和lmg/L亮肽酶素),攪勻；4°C, 12，OOOg離心20min ;定量計算,結果以 ng/g 表示。(TNF-α:法國 Diaclone 研究所；IL-1 β，IL-6:比利時 Biosource 公司)。
[0051]8.實時定量聚合酶鏈反應測定HO-UNQOl和穀胱甘肽-S-轉移酶-Al (GST-a I)的mRNA含量
[0052]具體方法步驟:H0-1，NQOl和GST- a I的mRNA表達水平採用定量實時聚合酶鏈反應的方法測定。所有標本的的 RNA採用 Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)提供的試劑盒並按照說明書的方法提取。紫外分光光度計鑑定，根據260nm吸光度值計算RNA濃度。將RNA用MMLV逆轉錄酶(Promega, Madison, Wl, USA)及引物作逆轉錄，步驟參照產品說明書進行。引物由上海康成生物技術公司合成。RT-PCR採用RotoHSene3000實時分析系統(Corbett Research, Sydney, Australia),採用實時綠色突光PCR技術進行。每一份反應混合物包含，稀釋的cDNA, SYBR Green I核酸染色劑(InvitrogenLifeTechnologies)。HO-1, NQ01, GST- α I 內參照 β-actin 同等條件擴增。
[0053]9.免疫組化研究檢測Keapl，Nrf2和H0-1的免疫反應性。
[0054]福馬林固定、石蠟包埋切片進行免疫組化實驗，切片與一抗孵育(全部稀釋1:200)，室溫下I小時，然後在PBS中洗滌15分鐘。然後，切片與HRP標記的IgG抗體(1:500稀釋)，在室溫下孵育60分鐘。DAB作為發色體，並用蘇木精復染。沒有一抗孵育的切片用來作為陰性對照。具體方法步驟①取4μπι的石錯切片，經二甲苯、乙醇脫蠟水化。②3%Η202封閉內源性過氧化物酶，常溫5min，雙蒸水漂洗5min後，磷酸鹽緩衝液漂洗15min。③抗原修復:切片置於10mmol/L檸檬酸鹽緩衝液(pH6.0)中，微波爐加熱.(溫度95°C),30min,自然冷卻至室溫，磷酸鹽緩衝液漂洗20min。④封閉非特異性結合位點:滴加5%小牛血清，常溫溼盒內孵育40min。⑤滴加抗Keapl、抗Nrf2，抗H0-1親和純化兔抗體(一抗)，工作效價1:200，，37°C溼盒內孵育lh，磷酸鹽緩衝液漂洗15min;滴加HRP標記IG抗體(二抗)，工作效價1:500，，室溫溼盒內孵育60min。⑥二氨基聯苯胺(DAB)顯色。⑦襯染:切片經乙醇、二甲苯脫水、透明，滴加中性樹脂封片，加蓋玻片。評價方法:在200倍顯微鏡下隨機選擇10個高倍視野，細胞核呈棕色的細胞為陽性，根據陽性細胞的比率進行評估(陽性細胞數佔總細胞數〈10%為I分，陽性細胞數佔總細胞數10%~25%為2分，陽性細胞數佔總細胞數26%-50%為3分，陽性細胞數佔總細胞數>50%為4分)。
[0055]10.對 NQOl 和 GST- α I 酶活分析
[0056]NQOl和GST- α I的活性檢測分別釆用2，6_ 二氯靛酚法和⑶NB法測定，實驗步驟按照購買的試劑盒進行，結果以nmol/min/mg表示。
[0057]11.測定氧化應激的丙二醛MDA、SOD、GSH-Px酶活
[0058]丙二醛MDA檢測原理依賴於脂質過氧化物與硫代巴比妥酸(TBA)的反應，反應產物為硫代巴比妥酸反應物質，其在532nm波長具有最大吸收峰。使用梯度稀釋的1，I, 3，3四乙氧基以獲得標準的吸光度與濃度曲線，丙二醛(MDA)的濃度可以從該曲線確定。丙二醛(MDA)含量分別為nmol/g組織溼重。
[0059]用RANSOD SOD檢測試劑盒(購自英國朗道公司)測定組織超氧化物歧化酶SOD的酶活性。該測定方法，採用黃嘌呤和XOD產生超氧自由基，超氧自由基和INT反應形成一個紅甲臢染料。超氧化物歧化酶活，通過測定反應抑制程度可以得知。一單位S0D，將導致測定條件下的INT反應速率減少50%。超氧化物歧化酶活表示為U/mg蛋白.[0060]用組織穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(購自西北生命科學公司)試劑盒用於組織GSH-Px活性檢測。主要方法如下: [0061]GSH-Px催化還原H2O2,穀胱甘肽氧化還原生成GSSG，接著被GR和β -煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸還原生成NADP+ (導致在340nm處吸光度的減少)和回收的GSH。由於GSH-Px限制，在340nm的吸光度的減少是和GSH-Px濃度成正比。GSH-Px活性定義為IU的GSH-Px酶活等於和H2O2每分鐘催化氧化1.0 μ mo I的GSH生成GSSG的酶量，條件25°C，pH值7.0。GSH-Px活性單位根據報導定義:GSH-Px的IU=的酶量。需要用催化氧化(過氧化氫)在GSH GSSGper的分鐘。組織樣品的GSH-Px活性表示為:單位/每毫克蛋白質。
[0062]12.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
[0063]使用特定的ELISA試劑盒大鼠炎症因子含量進行量化，數值以ng/L蛋白表達。具體方法步驟:通過ELISA方法分析大鼠腦皮層中細胞活素因子IL-1 β，TNF-α和IL-6表達情況比較。取冰凍腦組織於玻璃攪拌器中，加入ImlPBS緩衝液中(lmmol/L of PMSF, lmg/L胃酶抑素A，lmg/L抑酶肽和lmg/L亮肽酶素)，攪勻；4°C，12，OOOg離心20min ;定量計算，結果以 ng/L表不。(TNF-a:Diaclone Research, France ;IL_1 β，IL-6:Biosource EuropeSA, Belgium)。
[0064]13.採用修改後的Morris水迷宮(MWM)版本包括線索學習過程，空間習得任務，參考記憶任務和工作記憶任務，對大鼠的空間學習和記憶能力進行了評估。實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗。①定位航行試驗:在SAH後第二天開始，連續進行4天，每個大鼠每天進行4次，每次60秒。第一天，大鼠第一次意外發現隱藏的平臺被排除在數據分析外，所以出現上述情況的大鼠，需多次參與實驗。平臺隱藏在西北象限的正中部，為了排除老鼠下水後與平臺會產生的最短路程，大鼠在其他7個點(即除了西北點之外的東、南、西、北、東北、西南及東南)面朝池壁隨機放入池中。記錄大鼠在60秒內找到平臺所需的時間(逃避潛伏期)及活動總路程。實驗間隔時間為10-20秒(間隔時間是為了讓大鼠儘快恢復體力，並且減輕實驗帶來的外在刺激)。②空間探索實驗:在最後一次定位航行試驗結束後的24小時(即SAH術後第6天)，移走水池中的平臺，將大鼠在原平臺的對側象限面朝池壁放入水中，記錄其在60秒內每個象限花費的時間百分比及大鼠遊過原平臺位置的次數。所有行為測試在當天的8點到18點之間進行，所有老鼠完成當天實驗後返回籠子休息，保持體毛乾爽，並獲得充足的水和食物。
[0065]統計分析:所有數據以平均值土標準差表示。採用SPSS12.0軟體對數據進行統計分析。所有數據進行單因素方差分析。不同驗組之間的差異由費舍爾的LSD後期測定確定。以P〈0.05為有統計學意義。
[0066]三、結果[0067]1.一般觀察
[0068]各組沒有顯著的體重變化，在任一實驗組(數據未示出)檢測平均動脈血壓(MABP)，溫度，或注入動脈血氣數據。在對照組大鼠的死亡率為0% (0/20隻)，SAH組死亡率為20% (15/75隻)。SAH組大鼠在腦幹和Willis環的基底表面顯示有血塊。
[0069]2.腦組織細胞凋亡檢測及含水量檢測
[0070]在對照組大鼠腦中發現少數的TUNEL或FJB陽性凋亡細胞(圖1和圖3)。在SAH和SAH+賦形劑組，其皮層的細胞凋亡和壞死指數相對於對照組動物的指數顯著增加(P〈0.01)(圖1和圖3)。SAH組和SAH+賦形劑組之間的差別無統計學顯著性差異(P>0.05)。SAH+DMF組和SAH+賦形劑組比較，腦組織TUNEL陽性或FJB陽性細胞的數量顯著降低(Ρ〈0.01)(圖1 和圖 2)
[0071]SAH後48h大鼠腦樣品檢測到水分含量相對於對照組顯著增加(P〈0.05)(圖3)。SAH+DMF組相比SAH+賦形劑組在腦皮質中含水量平均值顯著減少(P〈0.05)。上述結果，初步說明蛛網膜下腔出血SAH後補充DMF改善了 EBI狀況。
[0072]3.Western blot 法檢測 Keapl, Nrf2,和 H0-1 的活性變化
[0073]如前面材料和方法中所描述，確定SAH後DMF對於Keapl/Nrf2/ARE途徑在腦皮層的影響。圖2、圖3顯示出對照組Keapl，Nrf2和HO-1的低含量水平。SAH後第2天(48小時)，SAH組和SAH+賦形劑組的Keapl, Nrf2與HO -1的含量顯著增加(Ρ〈0.05)(見圖5)。SAH組和SAH+賦形劑組之間的上述數值沒有統計上的顯著區別(Ρ>0.05)(見圖5)。經過DMF給藥，SAH+DMF組動物的Keapl，活性增強的Nrf2和HO-1進一步地活性顯著誘導增強(Ρ〈0.05)(圖 5)。
`[0074]4.EMSA檢測腦皮層樣品Nrf2的DNA結合活性
[0075]如圖6顯示了的Nrf2的DNA結合活性的EMSA放射自顯影。在對照組，弱EMSA放射自顯影顯示Nrf2的結合活性低。與對照組相比，在SAH和賦形劑組的受傷大腦的Nrf2結合活性顯著升高(P〈0.05)。在SAH+DMF組，在SAH後的血塊周圍的腦區，Nrf2的結合活性顯著進一步上調P〈0.05 (見圖7)。
[0076]5.實時定量Real-time-PCR測定HO-UNQOl和穀胱甘肽-S-轉移酶-AKGST-α I)的mRNA含量
[0077]在對照組大鼠腦組織中，這些蛋白質的mRNA表達處於較低的含量。SAH和SAH+賦形劑組相比對照組，HO-1, NQOl, GST-a I的mRNA含量顯著增加(P〈0.05)。SAH組和SAH+賦形劑組的上述基因的mRNA表達沒有顯著差異(P>0.05)。SAH+DMF組相比SAH+賦形劑組，大腦中HO-1，NQOl，GST-a I的mRNA表達顯著上調(Ρ〈0.05)，見圖9Α, 9Β。
[0078]6.免疫組化
[0079]免疫組化研究發現Keapl，Nrf2和H0_1主要分布在神經元和神經膠質細胞。SAH+DMF組相比SAH+賦形劑組，在SAH後48小時，有更多的Keapl，Nrf2與HO-1陽性免疫染色細胞出現，具有顯著性差異P〈0.05 (見圖10)。
[0080]7.DMF對SAH後腦組織氧化應激的抗氧化劑和解毒酶表達的作用
[0081]如圖11所示，大鼠腦組織中對照組的NQOl和GST-a I活性較低。SAH後，這些抗氧化劑和解毒酶與對照組相比在皮層中的含量大大增多。SAH後的DMF給藥可能會導致NQOl和GST-a I在大鼠腦組織的活性顯著增加。[0082]圖12-15顯示了組織中MDA，組織超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px酶活性的值。SAH組與對照組相比，組織中MDA含量顯著增加(P〈0.05)，而組織SOD和GSH-Px酶活性顯著下降(P〈0.05)；DMF的治療通過顯著降低(P〈0.05)已升高的MDA含量和顯著增加已降低的抗氧化酶活性，SOD和GSH-Px，P〈0.05;GSH-Px活性，P〈0.05顯示其保護作用，見圖12、13、14。
[0083]SAH後DMF的治療降低了大腦皮質的促炎症細胞因子含量
[0084]在對照組的大鼠大腦，IL-1 β，TNF- α和IL_6的濃度低(圖15)。相對於對照組，SAH後大腦皮質的三種炎性細胞因子含量極大地被誘導(P〈0.05)。如圖6所示，SAH後的DMF給藥導致IL-1 β，TNF- α和IL-6的濃度顯著降低(Ρ〈0.05)。
[0085]8.行為測試
[0086]各組的代表性試驗之一，也表示在圖16、17Α，17Β, 17C，17D中。對於所有行為的測量，遊泳速度和趨觸性(在池周邊時間％)進行了評估，發現四組無顯著差異。大鼠通常能找到可視平臺。通常在第一次試驗中，他們失敗了，這樣的事情同樣發生在整個群體。在四組的信號學習過程中，逃跑潛伏期和遊泳速度沒有顯著差異(Ρ>0.05)。在血液注射後的第二天和第三天後，所有四組的空間學習能力也是相同的。在第四天和第五天，與對照組相比SAH組的空間學習能力出現不足。在第四天和第五天，DMF組明顯表現出比賦形劑組的逃跑潛伏期短(圖17A-D)。所有的四組動物在每個測試日都學會找到平臺從水裡逃離(圖17A-D)。但SAH組和對照組相比， 在第四天和第五天，空間學習能力顯著不足，這是由於相對於賦形劑組的DMF的緩解作用。重複測量方差分析ANOVA表明，SAH組和對照組相比，逃跑潛伏期(圖17Α，Ρ〈0.01)和遊泳距離(圖17C，Ρ〈0.01)，具有顯著差異，DMF組相比賦形劑組的上述指標有所改善。把所有測試天分成單獨的四天，SAH組的逃跑潛伏期表現出顯著長於對照組。DMF組的前述指標表現出顯著短於賦形劑組(圖17Β，Ρ〈0.01)。但對於遊泳距離只有DMF組相比賦形劑組在第5天表現出顯著差異性(圖17D，Ρ〈0.01)。
[0087]本發明證明了 SAH後EBI的DMF的神經保護貢獻作用，顯示DMF激活SAH後的Keapl-Nrf2-ARE的途徑，並且在視交叉血液注入模型中，抑制氧化應激和多種炎症細胞因子的含量。SAH後EBI的整個過程，腦的氧化應激和炎症發揮著重要的作用。SAH後Keapl-Nrf2-ARE信號通路在腦組織中被激活，在EBI發展進程中發揮了有益的作用，可能是通過誘導抗氧化劑和解毒酶進而抑制腦的氧化應激。通過提高脂質過氧化，蛋白質氧化和降解，DNA損失，自由基能損傷大腦中的神經元和其他主要類型的細胞，藉由啟動凋亡級聯或壞死程序，導致內皮損傷和血腦屏障(BBB)擊穿。大量證據暗示著促炎症級聯反應在SAH後的EBI的發展和維持中，起著重要的作用。
[0088]綜上所述，本發明對DMF在SAH模型中的EBI和繼發性神經行為功能障礙的作用效果進行評估，以及SAH後DMF對Keapl/Nrf2/ARE抗氧化和抗炎途徑影響進行評估。我們發現，蛛網膜下腔出血SAH可上調有關Keap I/Nrf 2/ARE途徑的中介物的蛋白表達，在周圍的腦血液血塊的上遊因子(Keapl和Nrf 2)和下遊因子(HO-1，NQOl，GST-a 1)，經過DMF治療，可明顯上調。這些結果表明，DMF可以誘導激活大鼠大腦的Keapl/Nrf2/ARE信號通路，其在SAH後達到更好結果的抗氧化和抗消炎作用中，可發揮核心作用。DMF會減弱EBI的發展並促進SAH後神經行為的恢復，其機理可能涉及Keapl-Nrf2-ARE的介導的抗氧化和抗炎作用。[0089]以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實例的限制，上述實例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等同物界定。`
【權利要求】
1.富馬酸二甲酯DMF在製備治療蛛網膜下腔出血後早期腦損傷藥物組合物的應用。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述藥物組合物包含藥學上有效量的富馬酸二甲酯和藥學上可接受的載體。
3.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述藥物組合物為片劑或膠囊或緩釋劑。
4.根據權利要求1所述的`用途，其特徵在於，所述藥物組合物用於靜脈滴注。
【文檔編號】A61K31/225GK103768045SQ201310525886
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】王中, 陳罡, 劉一之, 邱教學 申請人:蘇州大學附屬第一醫院