一種通過培養龍牙楤木體細胞胚生產有用次生代謝物質的方法
2023-10-08 07:03:24 1
專利名稱：一種通過培養龍牙楤木體細胞胚生產有用次生代謝物質的方法
技術領域：
本發明專利涉及通過組織培養龍牙惚木體細胞胚發生，體細胞胚苗中三種有用次生代謝物質惚木總皂苷、齊墩果酸、總黃酮有效累積的培養方法。本發明屬農業生物技術領域。
背景技術：
龍牙惚木(Aralia elata Seem.)為五加科落葉灌木或小喬木。其根皮中主要含有惚木皂苷和黃酮類等重要藥用成分，而皂苷的主要成分是齊墩果酸型皂苷(王玉萍等，中國中藥雜誌，1998，23 (9) :519-521)。惚木皂苷和黃酮類具有抗炎、鎮靜、利尿、強心、抗氧化、抗病毒、抗糖尿病併發症等多種生理活性及藥理作用，且無毒害。近年來的研究顯示龍牙惚木皂苷在免疫調節、腫瘤防治方面有很顯著的作用，這使其在國際市場上越來越受到人們的關注(王忠壯等，上海第二軍醫大學出版社，2001)。然而龍牙惚木的野生資源由於·破壞性、掠奪性連年多茬採收，甚至割莖移栽，使其資源接近瀕危(高德武等，國土與自然資源研究，2001 (3) :77-78)。而通過細胞培養生產有用次生代謝物是一條可選的解決問題的途徑。通常情況下，植物次生代謝物的積累與植物細胞的分化程度有關，分化程度越高，次生代謝物的積累也越多。體細胞胚是一種很好的培養材料。雖然以快繁為目的體細胞胚規模化培養有不少研究報導，例如生物反應器培養挪威雲杉(Picea abies)、白雲杉(Picea glauca)、仙客來(Cyclamen persicum)、白樺(Betula pendula)的體細胞胚等。而以研究次生代謝物質累積為目的的大量培養的報導卻不多。在刺五加體細胞胚培養中，其外植體材料有從胚性細胞開始的，也有從魚雷胚開始的(邢朝斌等，中草藥，2009，40 (8) : 1302-1305)，而且僅僅是考察了其生物生長量，對其中的有效成分未做分析。從胚性愈傷組織到體細胞胚發生發育的過程是細胞有序的分化、發育的過程，而該過程中目的次生代謝物的累積具體如何還未查到相關報導。龍牙惚木方面的研究也未見報導。本發明的目的是通過培養龍牙惚木體細胞胚發生，提供一種有效生產三種次生代謝物質(總皂苷、齊墩果酸、總黃酮)的方法，為龍牙惚木規模化培養生產藥用產物提供一種培養技術。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用體細胞胚發生過程中的特殊發育材料，更有效地生產有用次生代謝物質的方法。具體發明內容如下。將培養萌發7天的無菌實生苗根部切成Icm根段接種到1/2SH+3. Omg/LIBA+0. 2mg/L KT培養條件下誘導胚性愈傷組織，並在同樣條件下進行愈傷組織的增殖。將
O.8g胚性愈傷組織分別接種入裝有50mL分化培養基和增殖培養基的150ml玻璃三角瓶中進行搖瓶懸浮培養，該分化培養基和增殖培養基的組成分別是1/2SH+1. Omg/L IBA+0. 2mg/L KT+20g/L 蔗糖，1/2SH+3. Omg/L IBA+0. 2mg/L KT+20g/L 蔗糖。搖床轉速為 110rpm/min。每隔2周繼代一次。增殖懸浮培養的胚性愈傷組織4周後取材，烘乾稱重。分化懸浮培養的愈傷組織培養2周時，細胞分化為球形胚，此時取材，烘乾稱重。懸浮培養4周後體細胞胚發育到魚雷和子葉胚時，轉入固體培養，在無任何植物生長調節劑的WPM培養基中進行萌發。待生長3周後，取材烘乾稱重。分析上述所取的愈傷組織、球形和心形體細胞胚、魚雷和子葉體細胞胚、體細胞胚萌發苗中的惚木總皂苷、齊墩果酸、總黃酮含量。以6-7月份採集的3-4年生人工栽培苗木根和當年生葉片為對照樣品。惚木總皂苷和總黃酮含量分別以齊墩果酸和蘆丁為標準品，採用分光光度法分析，監測波長分別為540和510nm。齊墩果酸含量以相同物質為標準品，採用高壓液相(HPLC)分析。體細胞胚苗中各成分的含量最高，分別為總皂苷2. 1%，佔栽培植株根中含量的29. 7%;齊墩果酸I. 04%，佔栽培植株根中含量的29. 9% ;總黃酮2. 3%,佔栽培植株葉中含量的42. 8%。分析出各種成分的含量後，根據生長速率(乾重g/周)算出其累積效率(mg/周)=各成分含量)*生長速率(mg/周)。上述體細胞胚發生過程的各材料中，體細胞胚苗的三種物質累積效率最高，分別為總阜苷6. 72mg/周、齊墩果酸3. 42mg/周、總黃酮7. 36mg/周。本發明中所用的培養基都是按常規處理(調整pH值為5. 8，經過高溫高壓滅菌(121°C、I. 5個大氣壓、15分鐘))後使用的，培養環境為常規組織培養室(溫度24 26°C，光照強度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，溼度60% 70% )。本發明的優點I、培養材料的生物量快速增值。從細胞到體細胞胚苗是一根有序生長的過程，可在短時間內使培養材料生物量大量增加。2、懸浮培養體系均勻，次生代謝物合成穩定。因為體細胞胚發生發育的材料相對同步，懸浮顆粒大小相對一致。克服了細胞培養過程中細胞無序生長造成的顆粒大小不均勻，懸浮培養系統不穩定的弊端。從而培養材料內次生代謝物的合成較穩定。3、本發明為進一步的擴大培養生產有用次生代謝物質提供了依據。
圖I體細胞胚發生及其再生:A-根段經4周的培養誘導的胚性愈傷組織；B-增殖的胚性愈傷組織；c-胚性愈傷組織懸浮培養2周後分化形成的球形體細胞胚；D-形成的球形胚的擴大圖；E-繼續懸浮培養2周後，發育形成的魚雷和子葉體細胞胚；F-倒入不含植物生長調節劑的WPM固體培養基中培養3周後，萌發形成的體細胞胚苗圖2胚性愈傷組織和處於不同發育時期的體細胞胚中總皂苷的量圖3標準品(a)和體細胞胚苗(b)的HPLC圖譜(箭頭表示齊墩果酸峰)圖4胚性愈傷組織和處於不同發育時期的體細胞胚中齊墩果酸含量圖5胚性愈傷組織及不同發育時期體細胞胚中總黃酮的含量圖6胚性愈傷組織及不同發育時期體細胞胚中總皂苷、齊墩果酸、總黃酮的累積效率
具體實施例方式實例I龍牙檍木胚性愈傷組織的誘導和增殖I)種子層積及胚培養龍牙惚木(由東北林業大學生命科學學院王秀華教授鑑定)種子採自黑龍江省林業多種經營研究所(牡丹江市)種子園。種子與溼沙混合後於4°C冰箱層積4個月後，選擇開莢的、合子胚發育成熟的種子，去除種皮，在超淨工作檯中先用70%的酒精消毒3分，再用5%次氯酸鈉消毒12分鐘，然後用滅菌水衝洗5遍。用鑷子取出合子胚，接種於事先準備好的1/2MS培養基中，使胚萌髮長成無菌小苗。2)誘導胚性愈傷組織及其增殖上述無菌實生苗培養7天後，將其根部切成Icm根段作為外植體，接種到1/2SH+IBA 3. Omg/L+KT O. 2mg/L培養條件誘導胚性愈傷組織，並在同樣條件下進行愈傷組織的增殖。實例2分析體細胞胚發育過程中有用物質的累積I)體細胞胚發育過程中的生物增長量將O. 8g胚性愈傷組織分別接種入裝有50mL分化培養基和增殖培養基的150mL玻璃三角瓶中進行搖瓶懸浮培養，該分化培養基和增殖培養基的組成分別是1/2SH+1. Omg/LIBA+0. 2mg/L KT+20g/L 蔗糖，1/2SH+3. Omg/L IBA+0. 2mg/L KT+20g/L 蔗糖。搖床轉速為 llOrpm/min。每隔2周繼代一次。每次取3瓶。增殖懸浮培養的胚性愈傷組織4周後取材，取3-4瓶，烘乾稱重。分化懸浮培養的愈傷組織培養2周時，細胞分化為球形球形胚，此時取材3瓶，烘乾稱重。懸浮培養4周後體細胞胚發育到魚類和子葉胚時，轉入固體培養，在無任何植物生長調節劑的WPM培養基中進行萌發。待生長3周後，取材烘乾稱重。統計上述各發育時期體細胞胚的生物生長量(乾重)(=收穫量-接種量)和生長速率(=生長量/培養時間(周))結果如表I。從中可以看出從胚性愈傷組織發育到體細胞胚苗的生長量和生長速率都是最大和最快的，分別為2. 25g，0. 32g/周。表I各不同發育時期體細胞胚的生物生長量
權利要求
1.本發明涉及一種通過體細胞胚發生生產有用次生代謝物的方法，其特徵在於組織培養條件下萌發7天的無菌實生苗根段在1/2SH+3. Omg/L IBA+0. 2mg/L KT培養條件下誘導胚性愈傷組織，並在同樣條件下進行愈傷組織的增殖。獲得的胚性愈傷組織在分化培養條件(1/2SH+L Omg/L IBA+0. 2mg/L KT+20g/L蔗糖)下進行搖瓶懸浮培養，根據發育時期每隔2周取材；4周後，發育為魚雷和子葉體細胞胚後轉入WPM固體培養基中培養3周，體細胞胚萌發為體細胞胚苗；該培養過程中體細胞胚苗相對於球形、魚類和子葉體細胞胚的生長速率為最快，三種次生代謝物質惚木總皂苷、齊墩果酸、總黃酮的累積效率最高。
全文摘要
一種通過培養龍牙楤木體細胞胚生產有用次生代謝物質的方法，其特徵是1)從無菌實生苗根段獲得的胚性愈傷組織分別在分化培養條件和增殖培養條件下進行搖瓶懸浮培養；2)根據體細胞胚不同發育狀況定期取材，並計算它們的生物生長量；3)分析體細胞胚各發育時期材料中楤木總皂苷、齊墩果酸、總黃酮的累積；4)體細胞胚苗中各成分含量最高，總皂苷佔栽培植株根中含量的29.7％；齊墩果酸佔栽培植株根中含量的29.9％；總黃酮佔栽培植株葉中含量的42.8％，且體細胞胚苗中三種物質累積效率最高，分別為總皂苷6.72mg/周、齊墩果酸3.42mg/周、總黃酮7.36mg/周。
文檔編號A01H4/00GK102893858SQ20111021455
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者由香玲, 曲冠證, 詹亞光, 代金玲, 陶雷, 譚嘯, 尹靜, 範桂枝, 曾繁瑣, 齊鳳慧 申請人:東北林業大學, 由香玲, 曲冠證