一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其製備方法

2023-10-29 11:13:32

一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其製備方法
【專利摘要】一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其製備方法，屬於基因工程及疫苗學【技術領域】。該疫苗抗原含有SEQIDNo.1所示的胺基酸序列。該製備方法包括熱激蛋白基因的克隆；質粒pETDnaK的構建；質粒pETDnaK的誘導表達。本發明具有如下優點：1、安全無毒。避免發生弱毒疫苗的返祖現象，以及使用滅活疫苗大量多次免疫可能對水體造成的汙染。2、高保護率。本發明的重組亞單位疫苗AHDnaK對嗜水氣單胞菌的免疫保護效率可達81.8%。3、操作簡便。與價廉的商業佐劑弗氏佐劑混合後即可用於注射。
【專利說明】一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其製備方法【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程及疫苗學【技術領域】，具體涉及一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其製備方法。
【背景技術】
[0002]嗜水氣單胞菌屬於弧菌科，氣單胞菌屬，是多種水生動物的原發性致病菌，具有高粘附力的嗜水氣單胞菌株可產生毒性很強的外毒素。嗜水氣單胞菌侵入水生動物後，在腸道內增殖，再進入肝臟、腎臟及其它組織，引起這些器官及血液病變，導致水生動物中爆發敗血症等嚴重流行性疾病。
[0003]目前對其防治，仍主要依賴傳統藥物。在養殖魚類中新型抗嗜水氣單胞菌病疫苗的開發是近些年的研究熱點，但主要集中於全菌滅活疫苗和減毒活疫苗。上述兩種疫苗製備方法簡便，但是滅活疫苗在水產養殖動物中的使用需要大劑量、多次免疫接種，而減毒活疫苗的儲藏和運輸條件極高，有效期較短，且存在返毒風險，因此它們均可能引起較大的毒副反應。養殖龜鱉相關病害的疫苗開發遠落後於魚類，市場上並無實際可用的易長期保存、高效疫苗來防治中華鱉弧菌病害。在動物飼料中添加一些可誘發自身免疫的天然化合物以增強水產養殖動物自身免疫能力是預防相關致病菌感染的一條切實可行的途徑。亞單位疫苗即由具免疫活性的致病菌蛋白所製成的疫苗。亞單位疫苗通常僅含一種或者幾種致病菌蛋白質，因而能消除許多無關抗原所誘發的抗體，減少疫苗帶來的副反應以及因疫苗引起的其它疾病，開發新型高效的亞單位疫苗是預防致病菌感染的發展趨勢之一。
【發明內容】

[0004]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其製備方法的技術方案。
[0005]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗，其特徵在於該疫苗抗原含有SEQID N0.1所示的胺基酸序列。
[0006]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗，其特徵在於所述的疫苗為含有SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列的重組質粒pETDnaK轉化大腸桿菌BL21(DE3)中獲得的重組蛋白。
[0007]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於包括以下步驟:
O熱激蛋白基因的克隆:以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，使用AH DnaK Fl和AHDnaK Rl為引物進行PCR擴增，將PCR產物純化後與載體pEASY-Simple-Tl室溫連接10分鐘，將混合液轉化至大腸桿菌DH5 α中，在含有100 μ g /ml氨苄青黴素、40 μ g/ml X-Gal和24 μ g/ml異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的LB固體培養基上培養16小時後篩選陽性克隆，獲得重組質粒pEASYDnaK，所述的引物AH DnaK Fl序列如SEQ ID N0.2所示，所述的引物AH DnaK Rl 序列如 SEQ ID N0.3 所示；2)質粒pETDnaK的構建:使用快速限制性內切酶SmaI酶切質粒pEASYDnaK，37°C水浴中孵育5分鐘後加入去磷酸化酶繼續孵育15分鐘後，使用1%瓊脂糖凝膠電泳回收熱激蛋白DnaK基因片段，將其插入pET259質粒Swa I多克隆位點處，轉化至大腸桿菌DH5 α中，使用含有50 μ g/ml卡那黴素的LB固體培養基後37°C篩選陽性克隆，獲得重組質粒pETDnaK ；
3)質粒pETDnaK的誘導表達:將步驟2)所得質粒pETDnaK轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，使用含有50 μ g/ml卡那黴素的LB固體培養基37°C篩選陽性克隆，獲得轉化子BL21/pETDnaK，將BL21/ pETDnaK於含有50 μ g/ml卡那黴素的LB液體培養基中37°C振蕩過夜培養；而後轉接至新鮮LB培養液中，於37°C振蕩培養至OD_為0.6，加入終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續培養4個小時後，收集菌體，並裂解離心收集上清,採用his親和層析柱純化重組蛋白，即可獲得具有序列表SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列的亞單位疫苗重組蛋白AH DnaK。
[0008]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於所述的步驟 I)中 PCR 條件為:94°C 5min 預變性模板 DNA，然後 94°C 30s, 55°C lmin，72°C lmin，5 個循環後調整為 94°C 30s, 68°C lmin,72°C lmin，25 個循環後 72°C延伸 lOmin。
[0009]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗在製備預防和治療中華鱉對嗜水氣單胞菌的侵染疫苗製劑中的應用。
[0010]本發明具有如下優點:
1、安全無毒。避免發生弱毒疫苗的返祖現象，以及使用滅活疫苗大量多次免疫可能對水體造成的汙染。
[0011]2、高保護率。本發明的重組亞單位疫苗AH DnaK對嗜水氣單胞菌的免疫保護效率可達81.8%ο
[0012]3、操作簡便。與價廉的商業佐劑弗氏佐劑混合後即可用於注射。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1:his親和層析柱回收穫得的重組蛋白DnaK的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳結果(泳道2)。泳道1，分子量標準。
【具體實施方式】
[0014]以下結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。
[0015]實施例1
重組亞單位疫苗AH DnaK的製備
1.1熱激蛋白基因的克隆 :以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，使用引物AH DnaKFl (5，- CCCGGGCATATGGGTAAAATCATCGGTATTGA -3』，該序列如 SEQ ID N0.2 所示，劃線鹼基為 Sma I 酶切位點)和 AH DnaK Rl (5，- CCCGGGCTCGAGCTTCTTGTCGTCTTTCACTTC -3』，該序列如SEQ ID N0.3所示，劃線鹼基為Sma I酶切位點)為引物進行PCR擴增，PCR條件為:94°C 5min預變性模板DNA，然後94°C 30s, 55°C lmin，72°C lmin，5個循環後調整為94°C 30s, 68°C lmin, 72 °C lmin，25個循環後72 °C延伸IOmin ;將PCR產物純化後與載體pEASY-Simple-Tl室溫連接10分鐘，將混合液轉化至大腸桿菌DH5 α中，在含有100 μ g /ml氨節青黴素、40μ g/ml X-Gal和24 μ g/ml異丙基_β _D_硫代批喃半乳糖苷的LB固體培養基上培養16小時後篩選陽性克隆，獲得重組質粒pEASY DnaK。
[0016]1.2質粒pET DnaK的構建:使用快速限制性內切酶Sma I酶切質粒pEASY DnaK,37°C水浴中孵育5分鐘後加入去磷酸化酶繼續孵育15分鐘後，使用1%瓊脂糖凝膠電泳回收熱激蛋白DnaK基因片段，將其插入pET259質粒Swa I多克隆位點處，轉化至大腸桿菌DH5 α中，使用含有50 μ g/ml卡那黴素的LB固體培養基37°C篩選陽性克隆，獲得重組質粒pET DnaK0
[0017]1.3質粒pET DnaK的誘導表達:將步驟2)所得質粒質粒pETDnaK轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，使用含有50 μ g/ml卡那黴素的LB固體培養基37°C篩選陽性克隆，獲得轉化子BL21/ pETDnaK,將BL21/ pETDnaK於含有50 μ g/ml卡那黴素的LB液體培養基中37°C振蕩過夜培養；而後轉接至新鮮LB培養液中，於37°C振蕩培養至0D_為0.6，加入終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續培養4個小時後，收集菌體，並裂解離心收集上清，採用his親和層析柱純化重組蛋白，即可獲得亞單位疫苗重組蛋白AH DnaK。
[0018]對亞單位疫苗重組蛋白AH DnaK經測序分析，證實其為具有序列表SEQ ID N0.1所述的胺基酸序列的抗原蛋白。
[0019]實施例2
重組亞單位疫苗DnaK的免疫應用 2.1注射疫苗準備
取AH DnaK蛋白與弗氏完全佐劑混合，獲得終濃度為100 μ g/ml的AH DnaK蛋白疫苗注射液，所述PBS組成成分按重量百分比計:0.8%NaCl，0.02%KC1,0.358%Na2HP04.12H20, 0.024% NaH2PO4,其餘為水。
[0020]2.2重組亞單位疫苗AH DnaK的免疫應用。將60隻中華鱉(每隻重約IOg)隨機分為兩組，每組30隻，分別命名為A組和B組。A組每隻中華鱉分別腹腔注射100 μ I上述2.1的疫苗注射液，B組每隻中華鱉分別腹腔注射100 μ I上述2.1的PBS緩衝液。21天後進行第二次免疫注射，A組的每隻中華鱉分別腹腔注射100μ I的疫苗注射液，B組每隻中華鱉分別腹腔注射100 μ I的PBS緩衝液。
[0021]2.3嗜水氣單胞菌懸液的製備。在LB液體培養基中培養嗜水氣單胞菌至0D600為
0.8，4°C條件下5000轉離心力離心10分鐘，收集菌體，將其使用PBS緩衝液重新懸浮至終濃度為 5X107CFU/ml。
[0022]2.4重組亞單位疫苗AH DnaK針對嗜水氣單胞菌的免疫保護效應檢測。在上述2.2第二次免疫注射後一周，用上述2.3中的嗜水氣單胞菌懸液腹腔注射上述2.2中的兩組中華鱉，每隻100 μ I的注射量。觀察每組中華鱉的死亡情況，14天後，統計各組中華鱉的死亡數目:Α組，2隻；Β組，11隻。採用下述公式計算相對成活率(RPS):
RPS=IOOX (1-免疫組中華鱉的總死亡百分比/D對照組中華鱉的總死亡百分比)
由此得出重組亞單位疫苗AH DnaK針對嗜水氣單胞菌的免疫保護效率(以RPS計)為81.8%。該結果表明，按照上述方法所製備和應用的AH DnaK是一種高效的保護性抗原，能夠顯著提高中華鱉對抗嗜水氣單胞菌的感染能力。
【權利要求】
1.一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗，其特徵在於該疫苗抗原含有SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列。
2.如權利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗，其特徵在於所述的疫苗為含有SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列的重組質粒pETDnaK轉化大腸桿菌BL21 (DE3)中獲得的重組蛋白。
3.如權利要求1或2所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: O熱激蛋白基因的克隆:以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，使用AH DnaK Fl和AHDnaK Rl為引物進行PCR擴增，將PCR產物純化後與載體pEASY-Simple-Tl室溫連接10分鐘，將混合液轉化至大腸桿菌DH5 α中，在含有100 μ g /ml氨苄青黴素、40 μ g/ml X-Gal和24 μ g/ml異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的LB固體培養基上培養16小時後篩選陽性克隆，獲得重組質粒pEASYDnaK，所述的引物AH DnaK Fl序列如SEQ ID N0.2所示，所述的引物AH DnaK Rl 序列如 SEQ ID N0.3 所示； 2)質粒pETDnaK的構建:使用快速限制性內切酶SmaI酶切質粒pEASYDnaK，37°C水浴中孵育5分鐘後加入去磷酸化酶繼續孵育15分鐘後，使用1%瓊脂糖凝膠電泳回收熱激蛋白DnaK基因片段，將其插入pET259質粒Swa I多克隆位點處，轉化至大腸桿菌DH5 α中，使用含有50 μ g/ml卡那黴素的LB固體培養基後37°C篩選陽性克隆，獲得重組質粒pETDnaK ； 3)質粒pETDnaK的誘導表達:將步驟2)所得質粒pETDnaK轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，使用含有50 μ g/ml 卡那黴素的LB固體培養基37°C篩選陽性克隆，獲得轉化子BL21/pETDnaK，將BL21/ pETDnaK於含有50 μ g/ml卡那黴素的LB液體培養基中37°C振蕩過夜培養；而後轉接至新鮮LB培養液中，於37°C振蕩培養至OD_為0.6，加入終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續培養4個小時後，收集菌體，並裂解離心收集上清,採用his親和層析柱純化重組蛋白，即可獲得具有序列表SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列的亞單位疫苗重組蛋白AH DnaK。
4.如權利要求3所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗的製備方法，其特徵在於所述的步驟I)中PCR條件為:94°C 5min預變性模板DNA，然後94°C 30s, 55°C lmin，72°Clmin，5 個循環後調整為 94°C 30s, 68°C lmin,72°C lmin，25 個循環後 72°C延伸 lOmin。
5.如權利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗在製備預防和治療中華鱉對嗜水氣單胞菌的侵染疫苗製劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK104001164SQ201410164721
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年4月23日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】黨偉, 陸洪良, 高原, 杜衛國 申請人:杭州師範大學