用於改善記憶力的膳食補充劑的製作方法
2023-10-29 08:01:47 2
專利名稱：用於改善記憶力的膳食補充劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及改善記憶力並且可以作為膳食補充劑攝取的組合物。該組合物包含可以通過在特定頻率和場強的電磁場中生長而得到的酵母細胞。
背景技術：
記憶包括以下的四個過程鑑定和記錄、信息儲存、識別和回憶。鑑定是將物體或者經歷印記在大腦中的過程。信息儲存是加強和保持所述印記的過程。識別是在刺激和所述印記之間建立聯繫的過程。回憶是激活所述印記的過程。另外，可以將記憶分成3個系統感覺記錄、短期信息儲存和長期信息儲存。
腦細胞在暴露於大範圍應力和毒性化合物之後會被損壞。這種損壞又會影響記憶力。攝取被化肥、殺蟲劑和化學藥品汙染的食物是將大腦暴露於毒性化合物的一種途徑。毒性化合物也可以被從空氣中吸入。因此需要提供一種有效減輕腦細胞損害並且提高記憶力的組合物。
發明概述本發明基於這樣的發現某些酵母細胞可以被具有特定頻率和場強的電磁場活化，從而產生一些物質，這些物質有助於記憶力退化和腦細胞損害的恢復並且改善功能正常的大腦的記憶力。本發明的組合物可以以健康飲料或者藥丸的形式、作為膳食補充劑攝取。
本發明包括一種含有多種酵母細胞的組合物，這些酵母細胞曾被培養在頻率範圍為大約12000-12100MHz、場強範圍為大約50-600mV/cm的交流電場中。在一個實施方案中，頻率範圍為12020-12090MHz。在另一個實施方案中，場強範圍為大約50-480mV/cm。將這些酵母細胞在交流電場中的培養一段時間，這段時間足以使得與未活化的酵母細胞相比，提高了所述的多種酵母細胞改善哺乳動物記憶力的能力。在一個實施方案中，在所述的時間段內，交流電場的頻率和場強可以在上述的範圍內變化。換句話說，可以使所述的酵母細胞暴露於一系列電磁場。典型的時間段是大約5-150小時。在一個實施方案中，時間段是50-77小時。本發明還包括製造這些組合物的方法。
可以被包含在此組合物中的酵母細胞全都可以從中國普通微生物菌種保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center)(「CGMCC」)得到，此保藏中心是布達佩斯條約認可的保藏中心(中國微生物菌種保藏管理委員會，中國科學院微生物研究所，海澱區，2714信箱，北京，100080，中國)。可以使用的酵母種類包括但不限於粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，清酒酵母(Saccharmycessake)，葡萄汁酵母(Saccharomyces urarum)，魯酵母(Saccharomycesrouxii)，卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，金橙紅酵母(Rhodotorulaaurantiaca)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。例如，所述的酵母細胞可以是漢遜釀酒酵母AS2.502(Saccharomyces cerevisiae HansenAS2.502)菌株。在另一個實施方案中，所述的酵母細胞選自下列菌株AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.535，AS2.558，AS2.560，AS2.561和AS2.562。其它有用的酵母種類描述在表1中。
除非作出相反的限定，這裡使用的所有科技術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的意思。下文描述示例性的方法和材料，在本發明的測試或者實踐中也可以使用與本文所述的方法和材料類似或等效的方法和材料。本文提及的所有出版物和其它文獻在此全部引入作為參考。在內容相互牴觸的情況下，以本發明的說明書、包括定義為準。所述的材料、方法和實施例都僅僅是說明性的，不能理解為對本發明的限制。在本發明的說明書和權利要求全文中，措詞「包含(comprise)」或其變體如「含有(comprises)」或「包括(comprising)」，應該被理解為表示包含所陳述的整數或者整數組，但是並不排除任何其它整數或者整數組。
從下面的發明詳述以及權利要求中，可以明白本發明的其它特點和優勢。
圖1是一幅示意圖，其顯示了使用電磁場來活化酵母細胞的示例性裝置。1酵母培養物；2容器；3電源。
圖2是一幅示意圖，其顯示了製作本發明酵母組合物的示例性裝置。此裝置包括信號發生器和相互連接的容器1、2和3。
發明詳述本發明基於這樣的發現某些酵母細胞株可以被具有特定頻率和場強的電磁場(「EMF」)活化，從而產生有益於記憶力改善的製劑。含有活化酵母細胞的酵母組合物可以以例如健康飲料或者藥丸的形式被用作膳食補充劑。
由於包含在這些酵母組合物中的活化酵母細胞，曾經經受過pH2.5-4.2的酸性條件培養，所以該組合物在胃中是穩定的並且可以被繼續運行到小腸。一旦進入小腸，這些酵母細胞就被各種消化酶破裂，這樣，有益於提供改善記憶力的物質就被釋放出來並且很容易被吸收。
發明者沒有被任何理論或者機理所束縛，並且相信EMF激活或者增強酵母細胞中的一個基因或一組基因的表達，這樣就使這些酵母細胞被活化並且使這些酵母細胞更有效地執行某些代謝活性，這些代謝活性會引起改善記憶力的物質的產生。I.用於本發明的酵母菌株在本發明中使用的酵母的類型包括，但不限於酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)和紅菌屬(Rhodotorula)的酵母。
在上面列出的類別範圍內的示例性種類包括但不限於表1中列出的種類。本發明中使用的酵母菌株可以從實驗室培養中得到，或者從公眾可以獲取的培養物保藏中心那裡得到，例如CGMCC和美國典型培養物保藏中心，10801 University Boulevard，馬納薩斯，VA 20110-2209。在表1中列出了可以使用的菌株(帶有CGMCC的序列號)的非限制性實例。通常，本發明優選的酵母菌株是那些用於食品和葡萄酒工業的菌株。因此，含有這些酵母細胞的組合物對於人消費是安全的。本發明酵母組合物的製備並不限於從純的酵母菌株開始，儘管這樣做是優選的。可以通過培養不同種類或菌株的酵母細胞的混合物來生產本發明的酵母組合物。
表1示例性的酵母菌株
II.電場的施加可以通過各種本領域已知的方法來產生和施加用於本發明的電磁場。例如可以通過施加交流電場或者振蕩磁場來產生EMF。
可以通過電極與培養基的直接接觸、或者通過電磁感應，將交流電場施加給細胞培養物。見例如圖1。使用電極與培養基相接觸的方法，可以在培養基中產生相對高的電場。必須注意防止在電極處的電解將非目的離子引入培養基，並且注意防止接觸電阻、氣泡或者電解的其它特性使電場水平下降到目的電場水平以下。電極應該與其環境相匹配，例如在氯離子富集的溶液中使用Ag-AgCl電極，而且電極應該在儘可能低的電壓下運轉。關於綜述，見Goodman等的Effects of EMF on Molecules andCells，Intemational Review of Cytology，A Survey of Cell Biology，Vol.158，Academic Press，1995。
也可以通過施加振蕩磁場來產生本發明使用的EMF。可以用通過赫姆霍茲線圈的振蕩電流來產生振蕩磁場。此振蕩磁場又會誘導出電場。
本發明使用的EMF的頻率範圍為大約12000MHz-12100MHz。典型的頻率包括12034，12041，12052，12064和12069MHz。本發明使用的場強範圍為50-600mV/cm(例如50-100，120-200，260-400或者450-490mV/cm)。示例性的場強包括65，122，142，160，168，188，280，300，335，387，367和475mV/cm。
當將一系列EMF施加到酵母培養物的時候，可以將酵母培養物保持在相同的容器中，使用一套相同的EMF發生器和發射器來改變頻率和/或場強。系列中的每個EMF都可以具有不同的頻率或者不同的場強；或者不同的頻率和不同的場強。這些頻率和場強優選處於上述的範圍內。儘管可以在系列中使用任何有效數目的EMF，但是優選將酵母培養物暴露於總數為2，3，4，5，6，7，8，9或者10個EMF的系列中。
儘管在EMF存在的情況下，酵母細胞甚至可以在培養幾個小時後被激活，但是優選的情況是，應該允許含有活化酵母細胞的組合物在EMF存在的情況下複製和生長總計50-77個小時。
圖1描述了產生交流電場的示例性裝置。可以通過AC源(3)產生所需頻率和強度的電場，AC源(3)能夠產生優選為正弦波形的、頻率範圍為5-20,000MHz的交流電場。也可以使用能夠用較窄的頻率範圍產生信號的信號發生器。如果需要，可以使用信號放大器來增加輸出。培養容器(2)可以由非導電性材料如玻璃、塑料或者陶瓷製成。連接培養容器(2)和信號發生器(3)的纜線，優選為高頻率同軸電纜，其傳輸頻率為至少20Ghz。在一個實施方案中，傳輸頻率為30Ghz。
可以通過多種方法將交流電場施加於所述的培養基，這些方法包括將酵母培養物(1)放置到與信號發射器(例如能夠傳送EMF的金屬線或者管)非常接近的地方。所述的金屬線或者管可以由紅銅製造，而且可以被放置到容器(2)內直至3-30cm的深度。例如，如果容器(2)中的流體深度為15-20cm，20-30cm，30-50cm，50-70cm，70-100cm，100-150cm或者150-200cm，那麼金屬線距容器(2)底部的長度可以分別是3-5cm，5-7cm，7-10cm，10-15cm，15-20cm，20-30cm和25-30cm。所用金屬線/管的數目可以是1-10個(例如2-3)。儘管並不要求，但是建議對於10L體積的培養物，應該使用直徑為0.5-2mm的金屬線/管。對於體積為10-100L的培養物，可以使用直徑為3-5mm的金屬線/管。對於體積為100-1000L的培養物，可以使用直徑為6-15mm的金屬線/管。對於體積大於1000L的培養物，可以使用直徑為20-25mm的金屬線/管。
在一個實施方案中，通過沒入培養物(1)的電極來施加電場。在這個實施方案中，一個電極可以是放置在容器(2)底部的金屬板，另一個電極可以含有均勻分布在培養物(1)中的許多電極線，這樣可以實現電場能量的均勻分布。所用電極線的數量取決於培養物的體積以及金屬線的直徑。III.培養基本發明使用的培養基含有能夠被酵母細胞吸收的營養源。可以將複合含碳物質以適當的形式(例如，糖類如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、麥芽糖、澱粉、木糖；甘露糖醇)作為酵母細胞的碳源。可以根據培養基的其它組分調節碳源的確切量。通常，含碳物質的量的範圍為大約培養基重量的0.5％-10％，優選為大約1％-5％，最優選為大約1.3％-2.2％。這些碳源可以單獨或者組合使用。可以被加入到培養基中的無機鹽是能夠產生鈉、鉀、鈣、硫酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽和類似離子的常規鹽。營養無機鹽的非限制性實例是(NH4)2HPO4，CaCO3，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4，NaCl，和CaSO4。IV.酵母細胞的電磁激活為了激活或者增強酵母細胞改善記憶力的固有能力，將這些細胞在適當的介質中、在無菌條件下、在20℃-35℃(例如23-32℃)、在上述的交流電場或者一系列交流電場中培養足夠長的時間例如5-150小時(例如50-77小時)。
在圖1(見上)中描述了進行培養的示例性裝置。示例性的培養基在每1000ml的無菌水中含有下列物質15g的可溶澱粉，10g的甘露糖醇，0.25g的K2HPO4，0.2g的KH2PO4，0.2g的MgSO4·7H2O，0.3g的NaCl，0.1g的CaSO4·2H2O，3.0g的CaCO3·5H2O，0.4g的酵母糊。隨後將所需菌株的酵母細胞添加到培養基中以形成含有1×108個酵母細胞/1000ml培養基的混合物。酵母細胞可以是表1中列出的任何菌株。在一個實施方案中，所述的菌株是釀酒酵母Hansen A2.502。隨後將混合物加入到圖1的裝置中。
釀酒酵母的活化過程涉及下列步驟1)將活化裝置的溫度保持在20-35℃(例如28-32℃)，將酵母細胞培養24-36小時；2)施加頻率為大約12034MHz、場強為大約170-200mV/cm(例如大約188mV/cm)的電場大約10-15小時(例如12小時)；3)將活化裝置的溫度保持在28-32℃，將酵母細胞培養24-36小時；4)隨後施加頻率為大約12041MHz、場強為大約120-200mV/cm(例如大約168mV/cm)的電場大約24-30小時(例如28小時)；5)而後施加頻率為大約12052MHz、場強為大約320-400mV/cm(例如大約367mV/cm)的電場大約18-20小時(例如19小時)；6)隨後施加頻率為大約12064MHz、場強為大約450-490mV/cm(例如大約475mV/cm)的電場大約7-10小時(例如8小時)；7)而後施加頻率為大約12069MHz、場強為大約290-320mV/cm(例如大約300mV/cm)的電場大約9-12小時(例如10小時)；和8)最後將含有活化酵母細胞的組合物凍幹以形成粉末，並將粉末存儲在4℃。優選地，凍乾酵母細胞的濃度大於1010細胞/g。V.酵母細胞對胃環境的適應由於本發明的酵母組合物在到達小腸以前必須通過胃，而有效組分是在小腸中從這些酵母細胞中釋放出來，因此優選將這些酵母細胞在酸性條件下培養以使這些細胞適應胃液。這種適應過程能夠使酵母在酸性胃環境中有更好的生存能力。
為了達到這一目的，可以將含有活化酵母細胞的酵母粉以10g(每克含有超過1010個活化的細胞)/1000m1與高酸性適應的培養基混和。而後對酵母混合物進行培養，首先在頻率為大約12064MHz、場強為350-400mV/cm(例如大約387mV/cm)的交流電場存在的情況下、在大約28-32℃培養45小時。將所得到的酵母細胞進一步在頻率為大約12069MHz、場強為260-300mV/cm(例如大約280mV/cm)的交流電場存在的情況下、在大約28-32℃培養22小時。隨後乾燥所得到的適應化酵母細胞並將其以粉末形式(≥1010細胞/g)室溫儲存或者在0-4℃真空儲存。
典型的適應化培養基是通過將700ml新鮮豬胃液和300ml野生中國山楂提取物混和製成的。用0.1M的鹽酸和0.2M的苯二酸氫鈉將適應化培養基的pH調節到2.5。豬胃液的製備如下。將大約4月齡的新生荷蘭白豬處死，回收它們胃中的全部內含物並將其與2000ml的水在無菌條件下混和。隨後使該混合物在無菌條件下，在4℃靜置6小時以沉澱食物殘渣。關於野生中國山楂提取物的製備，在無菌條件下乾燥500g新鮮的野生中國山楂，以減少水份含量(≤8％)。隨後研磨(≥20目)此乾果並將其加入1500ml的無菌水。將化合物在無菌條件下、在4℃靜置6小時。收集上清液以在適應化培養基中使用。VI.酵母混合物的製造為了製備本發明的酵母混合物，可以使用圖2中描述的裝置或其等效裝置。此裝置包括第一容器(1)、第二容器(2)、和第三容器(3)，每個容器裝備有一對電極(4)。所述電極中的一個是放置於容器底部上的金屬板，另一個電極包含多個均勻分布在容器空間內的電極線，以實現電場能量的均勻分布。所有三對電極都被連接到一個普通的信號發生器。
用於此目的的培養基是一種混合的水果提取物溶液，每1000L該溶液含有下述組分300L的野生中國山楂提取物、300L棗提取物、300L來自五味子(Schisandra chinensis Bail)(wu wei zi)的水果提取物、和100L的大豆提取物。關於山楂、棗、五味子提取物的製備，清洗新鮮的水果並在無菌條件下乾燥以將水含量減少到不超過8％。而後研磨(≥20目)100千克的乾果並將其加入到400L的無菌水中。將混合物在無菌條件下、在室溫攪動12小時，隨後以1000rpm離心以去除不溶的殘餘物。關於大豆提取物的製備，清洗新鮮的大豆並將其在無菌條件下乾燥以將含水量減少到不超過8％。隨後將30千克的大豆研磨成不小於20目的顆粒，加入130L無菌水。將混合物在無菌條件下、在室溫攪動12小時，隨後以1000rpm離心以去除不溶的殘餘物。一旦製備成了混合的水果提取物溶液，就將溶液在121℃下滅菌30分鐘，並在使用前冷卻到4℃。
將如上(上面的V部分)製備的1000g活化的酵母粉加入到1000L混合的水果提取物溶液中，將酵母溶液轉移到圖2中所示的第一容器(I)中。隨後，在頻率為大約12064MHz、場強為300-350mV/cm (例如大約335mV/cm)的交流電場存在的情況下、在大約28-32℃培養12小時。將酵母細胞進一步在頻率為大約12069MHz、場強為280-350mV/cm(例如大約300mV/cm)的交流電場存在的情況下培養。將培養繼續進行另10個小時。
隨後將酵母培養物從第一容器(1)轉移到第二容器(2)(如果需要，可以在現在可以使用的第一容器(1)中開始新的一批酵母培養物培養)，隨後將其處於頻率為大約12064MHz、場強為120-150mV/cm(例如大約142mV/cm)的交流電場中6小時。然後將電場的頻率和場強分別改變為大約12069MHz和140-180mV/cm(例如大約160mV/cm)。將培養繼續進行另8個小時。
而後將酵母培養物從第二容器(2)轉移到第三容器(3)，並將其處於頻率為大約12064MHz、場強為50-80mV/cm(例如大約65mV/cm)的交流電場中6小時。然後將電場的頻率和場強分別改變為大約12069MHz和110-140mV/cm(例如大約122mV/cm)。將培養繼續進行另10個小時。
將來自第三容器(3)的酵母培養物包裝到真空密封的瓶中以用作膳食補充劑。該膳食補充劑可以每次30-60ml、每天3-4次地攝取3個月(餐前和就寢前10-30分鐘)。如果需要，還可以將成品酵母培養物在24小時內乾燥並以粉末形式儲存。
在一個實施方案中，還可以以無菌可注射製劑的形式通過靜脈或者腹膜給予本發明的組合物。這樣的無菌製劑製備如下。將滅菌的健康飲料組合物首先在超聲波(1000Hz)下處理10分鐘，隨後在4355rpm離心另10分鐘。使用1M NaOH將所得到上清液的pH調節到7.2-7.4，並隨後在無菌條件下通過膜(對於靜脈注射0.22μm，對於腹膜內注射0.45μm)進行過濾。在使用前，將所得到的無菌製劑浸入35-38℃的水浴中30分鐘。
在交流電場存在的情況下，使用漢遜釀酒酵母AS2.502，按照如上所述的方法製備以下實驗中所使用的活化酵母組合物，所述的交流電場具有在建議使用範圍之後的括號中所例舉的電場頻率和場強。除了在沒有EMF的情況下進行培養，以相同的方法製備對照酵母組合物。除非作出相反的限定，所有的酵母組合物和相應的對照組合物均通過胃內給食給予所述的動物。實施例1小鼠平臺跳躍實驗在此實驗中，首先通過條件反射訓練小鼠執行一項任務。在它們能夠執行此任務後的一段時間，再次對小鼠進行測試。
在此實驗中使用的裝置包括一個長方形的盒子，盒子的底部覆蓋有平行的銅欄杆。每個相鄰銅欄杆之間的間隔為0.5cm。將銅欄杆連接到電源，通過變壓器調節電壓。將一個高度和直徑為4.5cm的圓形平臺放置在每個銅欄杆的左後端。將食物如油炸大豆粉放置在銅欄杆上。
首先將小鼠在盒子裡放置3分鐘使其適應。在小鼠開始爭搶食物後，立即向銅欄杆施加36V的交流電流。小鼠的正常反應是跳回平臺以避免電擊。由於食物的誘惑，多數小鼠重新跳回銅欄杆，當它們受到電擊後又重新返回平臺。在5分鐘的訓練過程中，記錄每隻小鼠被電擊的次數。此數字也被稱為錯誤數。24小時後，恢復訓練3分鐘。在此階段中，記錄被電擊小鼠的數目、每隻小鼠首次跳躍到銅欄杆之前的時間段(延遲期)、以及每隻小鼠的錯誤數。
將36隻NIH等級的小鼠分為3組，每組12隻小鼠。A，B和C組中的每隻小鼠每天被分別給予2ml活化的酵母組合物、對照酵母組合物和鹽水。小鼠在進行首次平臺跳躍實驗之前被處理6周(表2)。在表3中描述了在首次跳躍實驗的24小時後進行的平臺跳躍實驗的結果。
表2
表3
實施例2小鼠Y形迷宮實驗存在多種用於測試動物記憶力的方法。其中一種方法涉及使用Y形迷宮。見R.C.Miller等的Nature，228，1107-1108頁(1970)，該文獻在此引入作為參考。Y的主幹為起始點，此處是測試動物被最初放置的地方。迷宮的一條臂與電源相連，這樣，進入此臂的動物將會受到電擊。迷宮的另一條臂是有食物的安全地帶。
在此實驗中，將36隻NIH小鼠分成3個相等的組A，B和C。在Y形迷宮中訓練所有的小鼠。將小鼠首先放置在起始點，對其進行訓練以使其在帶電地帶受到電擊後具有逃向安全地帶的正常反應。訓練小鼠，直到它們學會在90％的情況下從帶電地帶逃向安全地帶。
訓練24小時後，每天分別給予A，B和C組的小鼠3ml活化的酵母組合物、對照酵母組合物和鹽水，共給予6周。6周以後，將小鼠再次放置在Y形迷宮中以進行行為學觀察。結果顯示在下面的表4中。
表4
此實驗證實，與對照酵母組合物和鹽水相比，活化的酵母組合物增強了被測試動物的記憶力。
雖然已經對本發明的大量實施方案進行了闡述，但是很明顯，可以對這些基本結構進行改變，以提供利用本發明組合物和方法的其它實施方案。
權利要求
1.一種含有多種酵母細胞的組合物，其中所述的多種酵母細胞的特徵在於作為曾經被在頻率範圍是12000-12100MHz、場強範圍是50-600mV/cm的交流電場存在的情況下培養過的結果，與未被如此培養的酵母細胞相比，所述的多種酵母細胞提高了它們改善哺乳動物的記憶力的能力。
2.權利要求1的組合物，其中所述的頻率範圍是12020-12090MHz。
3.權利要求1的組合物，其中所述的場強範圍是50-480mV/cm。
4.權利要求1的組合物，其中所述的酵母細胞選自下面的種類黃酒酵母，粟酒裂殖酵母Lindner，清酒酵母Yabe，葡萄汁酵母Beijer，魯酵母Boutroux，漢遜釀酒酵母卵形變種，漢遜卡爾酵母，金橙紅酵母Lodder和和漢遜釀酒酵母。
5.權利要求1的組合物，其中所述的酵母細胞是保藏在中國普通微生物菌種保藏中心的菌株細胞，其保藏號選自AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.535，AS2.558，AS2.560，AS2.561和AS2.562。
6.權利要求5的組合物，其中所述的菌株是AS2.502。
7.權利要求1的組合物，其中所述組合物的形式是片劑、粉劑或者健康飲料。
8.權利要求1的組合物，其中所述組合物的形式是健康飲料。
9.一種酵母組合物的製備方法，其包括在交流電場存在的情況下培養多種酵母細胞，所述交流電場的頻率範圍是12000-12100MHz、場強範圍是50-600mV/cm，其中所述的多種酵母細胞的特徵在於作為經過所述培養的結果，與沒有經過如此培養的酵母細胞相比，提高了其改善哺乳動物記憶力的能力。
全文摘要
含有多種酵母細胞的組合物，其中所述的多個酵母細胞曾經被在交流電場存在的情況下培養過一段時間，此交流電場具有特定的頻率和特定的場強，所述的一段時間足以提高所述多種酵母細胞改善哺乳動物記憶力的能力。本發明還包括製造這些組合物的方法。
文檔編號A61K47/00GK1481722SQ0314780
公開日2004年3月17日 申請日期2003年6月25日 優先權日2002年6月28日
發明者張令玉 申請人:歐亞生物科技有限公司