一種複合酶法自茶葉渣中提取茶多酚的方法

2023-09-25 18:42:25

一種複合酶法自茶葉渣中提取茶多酚的方法
【專利摘要】本發明涉及一種複合酶法自茶葉渣中提取茶多酚的方法。具體，茶葉渣水溶液以複合酶（果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶）酶解，酶解條件為pH5.0-6.5，溫度50-60℃，酶解2-4h，而後煮沸2min，使酶失活；5-10％乙醇溶液浸提1-3h，共3次，合併浸提上清液，進行濃縮，回收溶劑，得浸膏，將浸膏溶於水中，加到大孔吸附樹脂pH5.0-8.0中，加液量為柱體積1/3，先用水洗脫除雜，再用50-70%乙醇洗脫，用量為樹脂體積的3-4倍，回收茶多酚。本發明與傳統提取法比較具有提取速度快，成本低，不用重結晶，省時、省力；提取率高，雜質含量少，易於純化；提取工藝不使用有毒溶劑，對環境友好等特點；項目適宜大規模工業化生產。
【專利說明】一種複合酶法自茶葉渣中提取茶多酚的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於天然產物或原料加工領域，具體涉及一種複合酶法自茶葉渣中提取茶多酚的方法。
【背景技術】
[0002]茶葉渣是茶葉衝泡後的茶葉渣滓。茶葉在泡水時只能把水溶性強的部分成分浸泡出來，茶多酚(Tea Polyphenols)是茶葉中多酚類物質的總稱，包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等，未溶出成分主要是水難溶性成分，如黃酮類化合物。茶多酚是抗氧化劑，對人體內自由基具有清除作用，其清除自由基作用比VC、VE強很多倍，此外，茶多酚與抗氧化物還具有協同作用。對茶多酚提取分離的研究越來越引起世人的關注。茶葉渣滓直接丟棄造成巨大浪費，合理利用廢棄茶葉渣，變廢為寶具有很強的實際應用價值。
[0003]茶多酚的提取方法較多，但存在有以下問題，如水提法提取茶多酚含量很低；溶劑萃取法在提取過程中用到有機溶劑，使得茶多酚中殘留有毒性物質，不安全；沉澱法提取茶多酚對於PH值的控制有很高要求，pH過高或過低對茶多酚的提取都不利，且對沉澱劑的選擇要求高，有些金屬鹽離子容易產生殘留，使茶多酚的安全性無法保證；超臨界二氧化碳萃取法提取茶多酚無汙染、無雜質，但是成本高，不適合大規模生產；膜技術的方法提取茶多酚，成本高、產量低。

【發明內容】

[0004]針對現有技術的上述問題，本發明提供一種複合酶法自茶葉渣中提取茶多酚的方法。該方法簡單易行、成本低廉、適於大規模生產，提取的茶多酚產品安全、無汙染。
[0005]為了實現上述目的，本發明 包括以下技術方案:
[0006]一種複合酶法自茶葉渣中提取茶多酚的方法，該方法的步驟包括:
[0007]a、預處理:先將茶葉渣粉碎，將茶葉渣和水按重量比1:3-7混合，浸泡0.5-1小時；
[0008]b、複合酶解:向上述預處理液中，按茶葉渣重量的0.32%-1.16%加入複合酶，該複合酶為纖維素酶8-30重量份、果膠酶4-20重量份和木聚糖酶0.004-0.008重量份；用HCl調pH為5.0-6.5，溫度為50°C _60°C時酶解2-4小時，而後煮沸2_4min，使酶失活；
[0009]C、乙醇浸取:使用5-10體積％乙醇對步驟b酶解後的混合物加熱浸提，浸提溫度750C -80°C，將提取液離心，取上清液；
[0010]d、分離、提純:將步驟c獲得的上清液減壓濃縮，得浸膏，加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏液緩慢滴加到大孔吸附樹脂，用50-70體積％乙醇作為洗脫液進行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0011 ] 如上所述的方法，優選地，所述步驟b中纖維素酶為60萬U/g、果膠酶為80萬U/g和木聚糖酶為4.2萬U/g。
[0012]如上所述的方法，優選地，所述步驟c的具體操作為:向步驟b酶解後的混合物中加入無水乙醇，使乙醇終濃度達5-10體積％，加熱至75°C _80°C浸提l_2h ;過濾後的茶渣再用5-10體積％的乙醇浸提2次，每次所加5%-10%的乙醇為茶渣乾重的5~10倍，浸提溫度75°C -80°C，每次浸提l_2h，合併3次提取液，將提取液離心，取上清液。
[0013]如上所述的方法，優選地，所述步驟d中大孔吸附樹脂為D-1Ol、AB-8、X-5、LX_60、DM-130中的一種或幾種，大孔吸附樹脂中pH5.0-8.0。
[0014]如上所述的的方法，優選地，所述步驟b中複合酶中纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶添加量為重量比1500:1000:8。
[0015]如上所述的方法，優選地，所述步驟c中5-10體積％乙醇的浸提條件為，浸提溫度80 C，每次浸提2h。
[0016]本發明所述的茶葉渣是茶葉衝泡後的茶葉渣滓。
[0017]本發明的有益效果為:
[0018]1、茶多酚具有明顯的抗氧化、降血脂作用，用於製藥、食品保健品行業，用途廣泛。本專利研究了自茶葉渣中提取茶多酚的工藝製備的新方法。
[0019]2、本發明的提取方法以複合酶法進行酶解處理，成本低、環境友好、產量高、純度高，適宜工業化生產。
[0020]3、整個提取過程操作簡便，避免了有機溶劑帶來的毒性成分。
[0021]4、本發明中使用5-10%乙醇提取，提取液澄清，粘度低，產品雜質少，後續處理方便。
[0022]5、本發明使用的大孔吸附樹脂可反覆使用，成本低。
[0023]6、本發明提取茶葉渣`中的茶多酚，經複合酶處理，用50-70%乙醇洗脫，浸膏重量明顯多於水提法，且50-70%乙醇洗脫浸膏中茶多酚的含量可達80%以上。說明通過使用本專利發明的複合酶酶解，5-10%乙醇提取，50-70%的乙醇洗脫就可將大部分的茶多酚富集，純度大大增加。在複合酶中，木聚糖酶可分解原料細胞壁以及葡聚糖，降低提取的粘度，促進有效成分茶多酚的釋放，同時可降低提取液非澱粉多糖含量。本發明複合酶中包括少量木聚糖酶，提取率獲得顯著提高。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例中所用茶樹葉洛原料為:雙子葉植物屬被子植物門(Angiospermae)雙子葉植物綱(Dicotyledoneae)山茶科(Theaceae)、山茶屬(Camellia)茶 Camelliasinensis (L.)0.Kuntze的嫩葉製成的各類茶葉。稱取茶葉,用10倍重量的開水浸泡茶葉30-60分鐘，連續浸泡三次，茶葉渣放在恆溫乾燥箱中乾燥6小時至恆重。
[0025]所用纖維素酶為60萬U/g、果膠酶為80萬U/g、木聚糖酶為4.2萬U/g。
[0026]實施例1
[0027](I)取茶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntzes 樹葉禮:500g,粉碎。
[0028](2)加入3倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入果膠酶1.0g。
[0029](3) HCl調pH為5.6，溫度為50°C酶解2.5h，而後煮沸3min，使酶失活。
[0030](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度77°C，每次lh。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為8.332mg/g。[0031](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到AB-8大孔吸附樹脂，調pH6.0，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0032](6)選用4倍柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0033]實施例2
[0034](1)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0035](2)加入3倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入果膠酶1.5g。
[0036](3) HCl調pH為5.6，溫度為50°C酶解2.5h，而後煮沸3min，使酶失活。
[0037](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度77°C，每次lh。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液取上清液，減壓蒸發，提取量為7.865mg/g。
[0038](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到AB-8大孔吸附樹脂，調pH7.2，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0039](6)選用4倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0040]實施例3
[0041](1)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0042](2)加入3倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入果膠酶2.0g。
[0043](3) HCl調pH為5.6，溫度為50°C酶解2.5h，而後煮沸3min，使酶失活。
[0044](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度75°C，每次lh。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為7.241mg/g。
[0045](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到LX-60大孔吸附樹脂，調pH7.0，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0046](6)選用4倍柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0047]實施例4
[0048](I)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0049](2)加入3倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入果膠酶2.5g。
[0050](3) HCl調ρΗ5.6，溫度50°C酶解2.5h，而後煮沸3min，使酶失活。
[0051](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度76°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為6.390mg/g。
[0052](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到X-5大孔吸附樹脂,調pH6.7，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0053](6)選用4倍柱體積的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0054]實施例5
[0055](1)取茶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntzes 樹葉禮:500g,粉碎。
[0056](2)加入3倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入纖維素酶1.5g。
[0057](3) HCl調ρΗ5.6，溫度57°C酶解2.5h，而後煮沸3min，使酶失活。
[0058](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度74°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為6.777mg/g。
[0059](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到D-101大孔吸附樹脂，調pH7.8，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0060](6)選用4倍柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0061]實施例6
[0062](I)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0063](2)加入3倍量的蒸餾水，浸泡I小時,加入纖維素酶2.0g。
[0064](3) HCl調ρΗ5.6，溫度55°C酶解2.5h，而後煮沸3min，使酶失活。
[0065](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度78°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為8.406mg/g。
[0066](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到X-5大孔吸附樹脂,調pH6.5，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。[0067](6)選用4倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0068]實施例7
[0069](I)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0070](2)加入3倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入纖維素酶2.5g。
[0071](3) HCl調pH為5.6，溫度為50°C酶解2.5h，而後煮沸3min，使酶失活。
[0072](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度73°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為9.821mg/g。
[0073](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到D-101大孔吸附樹脂，調pH7.0，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0074](6)選用4倍柱體積的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0075]實施例8
[0076](I)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0077](2)加入4倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入纖維素酶1.0g。
[0078](3) HCl調ρΗ5.6，溫度50°C酶解2.5h，，而後煮沸3min，使酶失活。
[0079](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度77°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為9.056mg/g。
[0080](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到AB-8大孔吸附樹脂，調pH8.0，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0081](6)選用4倍柱體積的55%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0082]實施例9
[0083](I)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0084](2)加入4倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入纖維素酶3g、果膠酶1.5g、木聚糖酶IOmg0
[0085](3) HCl調ρΗ6.0，溫度為55°C酶解2h，而後煮沸2min，使酶失活。[0086](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度80°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為14.210mg/g。
[0087](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到X-5大孔吸附樹脂,調pH7.0，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0088](6)選用4倍柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0089]實施例10
[0090](I)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0091](2)加入5倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入纖維素酶2g、果膠酶l.0g、木聚糖酶8mg。
[0092](3) HCl調ρΗ6.0，溫度55°C酶解3h，而後煮沸2min，使酶失活。
[0093](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度80°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為11.527mg/g。
[0094]((5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到LX-60大孔吸附樹脂，調pH7.5，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0095](6)選用4倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0096]實施例11
[0097](I)取茶葉 Camellia sinen`sis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0098](2)加入5倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入纖維素酶1.8g、果膠酶1.2g、木聚糖酶6mg。
[0099](3) HCl調ρΗ6.5，溫度60°C，酶解4h，而後煮沸2min，酶失活。
[0100](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度80°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為10.454mg/g。
[0101](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到X-5大孔吸附樹脂,調pH7.0，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0102](6)選用4倍柱體積的65%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0103]實施例12
[0104](I)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0105](2)加入4倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入纖維素酶0.8g、果膠酶0.4g、木聚糖酶IOmg0
[0106](3) HCl調pH為5.5，溫度為55°C酶解5h，而後煮沸3min，酶失活。
[0107](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度70°C，每次lh。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為10.836mg/g。
[0108](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到LX-60大孔吸附樹脂，調Ph8.0，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0109](6)選用4倍柱體積的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。[0110]實施例13
[0111](I)取茶葉 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0112](2)加入3倍量的蒸餾水，浸泡I小時，加入纖維素酶2.5g，果膠酶l.0g。
[0113](3) HCl調pH為5.6，溫度為50°C酶解2.5h，而後煮沸3min，使酶失活。
[0114](4)加乙醇，使乙醇終濃度達5體積％，加熱浸提。茶葉渣再用終濃度為5體積％的乙醇溶液浸提2次。提取條件為:溫度73°C，每次2h。合併3次提取液，提取液過濾，離心，取上清液，減壓蒸發，提取量為10.06mg/g。
[0115](5)上清液減壓濃縮，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏緩慢滴加到D-101大孔吸附樹脂，調pH7.0，加樣至柱體1/3處，加入3倍柱體積蒸餾水衝洗。
[0116](6)選用4倍柱體積的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
[0117]實施例14茶多酚的含量檢測
[0118](一)標準品的配製:茶多酚含量測定按GB/T8313—2002《茶:茶多酚的測定》進行。準確稱取標準品茶多酚5mg，加蒸餾水定容至25ml，混勻，分別吸取茶多酚標準溶液1.0ml、
2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml於25ml容量瓶中，各加蒸餾水5ml，酒石酸亞鐵溶液5ml，最後加入PH7.5的磷酸緩衝液至刻度，搖勻。利用空白的試劑作參照，用紫外分光光度計於539nm處測定吸光度。
[0119](二)樣品(洗脫液)測定:準確吸取浸提液(洗脫液)0.2mL，加水至5mL至25mL容量瓶，加酒石酸亞鐵5mL，充分混合，加pH7.5磷酸鹽緩衝液至刻度，用IOmm比色杯，用紫外-可見分光光度計在波長539n m處，以試劑空白溶液做參比，測定吸光度，計算茶多酚提
取率和含量。
[0120]各實施例茶多酚提取率和各洗脫液的含量
【權利要求】
1.一種複合酶法自茶葉渣中提取茶多酚的方法，其特徵在於，該方法的步驟包括: a、預處理:先將茶葉渣粉碎，將茶葉渣和水按重量比1:3-7混合，浸泡0.5-1小時； b、複合酶解:向上述預處理液中，按茶葉渣重量的0.32%-1.16%加入複合酶，該複合酶為纖維素酶8-30重量份、果膠酶4-20重量份和木聚糖酶0.004-0.008重量份；用HCl調pH為5.0-6.5，溫度為50°C _60°C時酶解2_4小時，而後煮沸2_4min，使酶失活； C、乙醇浸取:使用5-10體積％乙醇對步驟b酶解後的混合物加熱浸提，浸提溫度750C -80°C，將提取液離心，取上清液； d、分離、提純:將步驟c獲得的上清液減壓濃縮，得浸膏，加水至浸膏完全溶解，將上述浸膏液緩慢滴加到大孔吸附樹脂，用50-70體積％乙醇作為洗脫液進行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟b中纖維素酶為60萬U/g、果膠酶為80萬U/g和木聚糖酶為4.2萬U/g。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟c的具體操作為:向步驟b酶解後的混合物中加入無水乙醇，使乙醇終濃度達5-10體積％，加熱至75°C _80°C浸提l_2h ;過濾後的茶渣再用5-10體積％的乙醇浸提2次，每次所加5%-10%的乙醇為茶渣乾重的5~10倍，浸提溫度75°C -80°C，每次浸提l_2h，合併3次提取液，將提取液離心，取上清液。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟d中大孔吸附樹脂為D-101、AB-8、X-5、LX-60、DM-130中的一種或幾種，大孔吸附樹脂中pH5.0-8.0。
5.如權利要求1-4中任一項所述的的方法，其特徵在於，所述步驟b中複合酶中纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶添加量為重量比1500:1000:8。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述步驟c中5-10體積％乙醇的浸提條件為，浸提溫度80°C，每次浸提2h。
【文檔編號】A61P3/06GK103655928SQ201310610964
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月26日 優先權日:2013年11月26日
【發明者】葛喜珍, 林強, 田平芳 申請人:北京聯合大學生物化學工程學院