葡萄球菌屬的趨化性抑制蛋白(chips)及其應用的製作方法

2023-09-22 03:18:15 10

專利名稱：葡萄球菌屬的趨化性抑制蛋白(chips)及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種可用於治療炎症反應的新蛋白質。本發明進一步涉及一種純化所述蛋白質的方法。最後，本發明涉及一個篩選試驗，應用該篩選試驗可檢測類似蛋白質。
炎症反應是一種很普遍的過程，其中，防禦細胞奔向一個感染源並在此處保證消滅病原。在這裡釋放不同的介體，它們有助於消滅作用但還產生炎症。可以區別急性炎症(例如膿毒)和潛伏的慢性炎症(例如風溼症)。抵抗力降低了的人更經常而且更嚴重地出現急性炎症(例如在愛滋病的情況下)。
細菌感染導致趨化因子的形成，趨化因子保證白細胞來到感染源。趨化物質以梯度形式存在，白細胞沿著該梯度定向運動。趨化劑的來源可能是細菌自身。這些趨化劑例如是具有末端甲醯基的小蛋白質，例如fMLP(N-甲醯-甲硫氨醯-亮氨醯-苯丙氨酸)。其它趨化劑有活化補體因子(過敏毒素C3a和C5a)，白三烯[例如LTB4(白三烯B4)和PAF(血小板活化因子)，以及由不同類別的細胞產生的趨化因子，例如白細胞介素-8(單核細胞和內皮細胞)，RANTES(活化時調節的、正常T-細胞表達和分泌的)，eotaxin,MCP(單核細胞趨化蛋白)，MIP(巨噬細胞炎性蛋白)和其它趨化因子。
某些趨化因子僅僅對確定類別的白細胞是特異性的，其它的則影響很多細胞。趨化因子的受體被細分為兩大類CC受體和CXC受體，它們都屬於蛇根鹼(跨膜7次的受體)。蛇根鹼是視紫紅質樣的GTP結合蛋白連接的受體。
趨化細胞因子的總科(趨化因子)的特徵在於4個保守半胱氨酸。根據前兩個半胱氨酸的相對位置可區別兩科CXC或α-趨化因子與CC或β-趨化因子。CXC趨化因子尤其對粒細胞有活性，而CC趨化因子則活化寬範圍的白細胞(包括單核細胞、嗜酸性粒細胞、T-淋巴細胞、NK細胞和樹枝狀細胞)。該科趨化因子和典型性趨化劑(例如fMLP和C5a)結合併活化蛇根鹼。
趨化因子的中和已在實驗上被應用了，具體地說，發現了施用抗IL-8的抗體在一些動物實驗炎症模型中有效。此外，最近證實了一些趨化因子受體(尤其CCR5和CXCR4)在HIV感染細胞中起輔因子的作用。就HIV的T細胞營養株來說，CXCR4已被鑑定為輔因子，就單主寄生株來說，這是CCR5。用抗體或配體封阻這些受體抑制了體外模型中的HIV感染。此外，發現了具有CCR5受體的遺傳性變型(包括32個鹼基對缺失)的人們能抗HIV感染。
除了趨化性的誘導、白細胞的定向遷移之外，低濃度的一些趨化因子也是其它白細胞功能的有效激活劑或引物。所以，希望實現趨化因子的封阻，於是，可以抑制炎症反應。
因此，本發明的目的是提高一種具有炎症-抑制特性、用於治療急性和慢性炎症反應和HIV的新治療劑。
在導致本發明的研究過程中，在生長的金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(S.aueus)]胞外培養基中發現了一種蛋白質，發現該蛋白質能封阻不同的趨化因子受體。將不同的細胞與培養基保溫導致一些趨化因子受體的表達[既包括典型性趨化劑(例如fMLP和C5a)的受體在粒細胞上的表達又包括CXCR4和CCR5受體在淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞上的表達]大為減少。受體表達的減少與趨化性相對於趨化因子的大為降低有關，也與HIV的感染減小有關。
在生長的金黃色葡萄球菌培養物上清液中表現了該蛋白質的活性。然而，按本發明，還通過一些配體染料柱純化了所述活性蛋白質。首先在所謂的「黃色柱」[「活性黃86」配體染料交聯的4％珠狀瓊脂糖柱(Sigma)]上進行了預純化，接著在吸附層析柱[所謂的「綠色柱」(「活性綠19」配體染料交聯的4％珠狀瓊脂糖柱(Sigma))]和DNA柱[DNA纖維素(Pharmacia)]上進行。後兩種柱可以互換。所述DNA柱除去與本發明的蛋白質相同分子量的汙染物。所述吸附層析柱濃縮蛋白質並且對該蛋白質是選擇性的。最後，還通過凝膠過濾和任選濃縮的方法進行了後純化。在凝膠過濾中，選定了分子量約為17kD的蛋白質。這就是本發明的蛋白質。
所述純化方法的每一步都可通過檢測不同柱的流過物質或洗出液的活性來監測。這是通過監測流過物質或洗出液是否能防止fMLP與粒細胞結合而進行的。實施例中給出了詳盡的試驗方案。
通過微量測序測定了純化了的蛋白質的前(N-末端)15個胺基酸。在圖4中給出了該序列。序列分析表明，未發現與資料庫中已知細菌的或真核生物的胺基酸序列的同源性。所以，這是一種新的、獨特的蛋白質。
由於該蛋白質是從金黃色葡萄球菌的上清液中分離的並且給出趨化性的抑制作用，所以，本文還將所述蛋白質稱為「CHIPS」得自金黃色葡萄球菌的趨化性抑制蛋白。
因此，本發明的第一方面涉及CHIPS蛋白質，其特徵在於a)約為17kD的分子量；b)圖4中給出的N-末端胺基酸序列；以及c)一種生物活性，它包括在實施例1中描述的試驗中防止fMLP與粒細胞結合的能力，及其生物活性片段。
CHIPS蛋白質影響白細胞對化學引誘物源(例如細菌)的趨化性。發現了按本發明，白細胞(尤其是粒細胞)上至少兩種受體(fMLP和C5a)的數量被下調了。該減量調節是可逆的。
本發明進一步涉及一種治療組合物，它包含合適的賦形劑和CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段。所述組合物可被用於治療急性和慢性炎症反應和HIV感染。所述蛋白質保證封阻提供白細胞向趨化物質運動的受體。
本發明也涉及用於治療急性和慢性炎症反應和HIV感染的CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段，以及CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段在生產用於治療所述症狀的治療製劑方面的應用。
按本發明的後續方面，提供了用於治療葡萄球菌(Staphylococcus)感染的、抗CHIPS蛋白質和/或其片段的抗體。所述蛋白質將封阻CHIPS或其片段的活性，所以再起動被細菌終止的趨化性，於是恢復了對細菌的自然防禦。
所述治療組合物(按本發明，它包含作為活性組分的CHIPS或抗它的抗體)特別希望被胃腸外(更具體地說，靜脈內)施用。所述治療組合物可通過將CHIPS與適合靜脈內施用的、藥物上可接受的賦形劑複合(即，混合、溶解等)而製備。治療組合物中活性組分的濃度可在0.001％～100％之間變化，取決於治療的性質和施藥方法。施用的活性組分劑量同樣取決於施藥途徑和用途，但例如可在0.001～1mg/kg體重、優選在1μg～100μg/kg體重的範圍內變化。
本發明進一步涉及一種純化CHIPS蛋白質的方法，該方法包括a)將金黃色葡萄球菌的培養物上清液或預純化後從其獲得的液體導引經過吸附層析柱；b1)接著將吸附層析柱的流過物質首先導引經過親和層析柱，再將親和層析柱的洗出液導引經過DNA柱；或者b2)接著將吸附層析柱的流過物質首先導引經過DNA柱，再將DNA柱的流過物質導引經過吸附層析柱；c)將步驟b)的最後那個柱的流過物質或洗出液導引流過凝膠過濾柱並選擇分子量約為17kD的級分。
「流過物質」在本文應被理解為那部分裝填的液體，即，該裝填的液體中具有從柱中流出未另外處理的組分。該流過物質中的組分不與柱結合。「洗出液」應被理解為洗脫後從柱中流出的液體，它包含得自裝填到柱上的液體的、與柱結合併在洗脫後又從柱中釋放的組分。在本發明的方法中，吸附柱結合裝填的培養基或預純化後從其中獲得的液體的大部分組分。所述親和柱結合CHIPS和Snase(葡萄球菌核酸酶)，Snase具有與CHIPS相同的分子量以及分別對於親和柱、吸附柱相同的親和性(或其缺乏)。所述DNA柱只結合Snase，於是將它與CHIPS分離。
如果第一個親和層析柱是所謂的配體染料「黃」柱，第二個親和層析柱是所謂的配體染料「綠」柱，並且，所述DNA柱是DNA纖維素柱，那麼，本方法特別奏效。
最後，本發明還涉及一種測定CHIPS蛋白質或具有類似功能的蛋白質的活性的測定或分析方法，該方法包括a)在第一個區室引入容許趨化性的標記細胞(尤其是白細胞)；b)將一種或多種化學引誘物引入通過至少能滲透細胞的膜與第一個區室隔離的第二個區室；c)將需測試的蛋白質置於第一個區室中；d)在一定的時間後測定第二個區室中的標記量。
細胞能朝化學引誘物的方向運動通過所述膜。CHIPS或類似蛋白質的存在通過鈍化化學引誘物的受體而阻止這種遷移。該測試還能更普遍地用於測定其它物質的趨化性調節活性。那麼，方法步驟是相同的。
按這種方式發現與CHIPS類似的蛋白質能經歷與CHIPS相同的純化，於是，能測定這二者之間的同源性。
本發明的CHIPS蛋白質還見於表皮葡萄球菌(S.epidermis)和金黃色葡萄球菌中。
在下文的實施例中，除了描述CHIPS對不同的白細胞上不同趨化因子受體的活性的測試與T細胞和巨噬細胞中HIV感染的抑制作用的測試之外，還描述了這種方法其中，經過配體染料親和層析與吸附層析、凝膠過濾和濃縮這些步驟從金黃色葡萄球菌的培養物上清液分離CHIPS，給出這些實施例只是為了闡述而決不是以任何方式限制本發明。
在實施例中參考了下列圖

圖1示出了粒細胞與一系列濃度葡萄球菌上清液(SaS)保溫以及對fMLP受體和C5a受體的影響。
圖2示出了一系列濃度SaS對於粒細胞向fMLP的趨化性的影響。
圖3示出了凝膠過濾柱的級分與光密度(OD)(菱形線)和fMLP受體分析中以抑制百分數表示的活性(條形線)。
圖4示出了CHIPS的前15個(N-末端)胺基酸的序列(預計總共125個中的)。
圖5a示出了粒細胞與一系列濃度純化了的CHIPS保溫以及對fMLP受體和C5a受體的影響。
圖5b示出了粒細胞與一系列濃度純化了的CHIPS保溫以及對定向遷移至fMLP的影響。
圖6示出了CXCR4在淋巴細胞上的表達。
將2升的SaS導引經過前後偶聯的三個柱(25ml)。這三個柱相繼是「活性黃86」配體染料交聯的4％珠狀瓊脂糖柱(Sigma)、DNA纖維素(Pharmacia)和「活性綠19」配體染料交聯的4％珠狀瓊脂糖柱(Sigma)。洗滌後，用2M NaCl洗脫所述綠(活性綠19)柱，匯集活性級分，用聚乙二醇濃縮10x。在Pharmacia Superdex-200凝膠過濾柱上分離濃縮後的物質，然後匯集活性級分，濃縮，透析並凍幹。將最終純化的物質重懸浮於少量無菌水中，特別用於微量測序分析。
為此，將一個樣品在12.5％SDS-PAGE(Mini-ProteanⅡ；BioRad)上分析，再通過Mini Trans-Blotter(BioRad)轉移到Immobilon-PPVDF膜(Millipore)上。用考馬斯藍將蛋白質染色，切除約17kD的蛋白質。按自動Edman操作法(其中，應用了Perkin Elmer/AppliedBiosystems 476A)測定該樣品的N-末端胺基酸序列。通過HPLC分析了胺基酸衍生物。1.2fMLP與粒細胞的結合從健康志願者的肝素化血液分離了粒細胞，即，按標準方法[Troelstra等，白細胞生物學雜誌(J.Leukocyte Biol.)61:173～178(1997)]經過Histopaque-Ficoll梯度分離的。用無菌水溶解粒細胞級分中的殘餘紅細胞(達30sec)，在恢復等滲性後洗滌。最後將細胞重懸浮於含0.05％人血清白蛋白的RPMI(Gibco)(RPMI/HSA)中。
在Falcon管中，在37℃下將50μl細胞(5×106個細胞/ml)與50μl含CHIPS的原料(SaS，純化的CHIPS或柱級分)保溫30min。將細胞置於冰上，用RPMI/HSA洗滌一次(在4℃下)，重懸浮於50μl新鮮培養基中。然後，添加5μl BODIPY標記的fMLP(最終濃度0.1μM；Molecular Probes)，將樣品在冰上保溫60分鐘。洗滌後，用流式細胞器(FACScan；Beeton Dickinson)分析與粒細胞結合的螢光fMLP。用LysisⅡ軟體計算5000個粒細胞的平均螢光值。1.3趨化性為了測定定向遷移，應用了Transwel系統(Costar)，它包括由3μm聚碳酸酯膜隔離的一個上區室和一個下區室。用BCECF[2-羧乙基-5-(和-6-)羧基螢光素；Molecular Probes](一種進入細胞的細胞質的螢光標記)標記粒細胞。在22℃下將細胞(5×106個)與3μMBCECF-AM[2-羧乙基-5-(和-6-)羧基螢光素的乙醯甲基酯]保溫20分鐘，接著，洗滌三次，以5×106個細胞/ml重懸浮於RPMI/HSA中。將100μl細胞和所需量的CHIPS蛋白質引入Transwel系統的上區室，將整個區室懸浮於標準24孔微量滴定板(Costar)的孔中。每個孔含有600μl RPMI/HSA(添加了或未添加測試用的化學引誘物)。所述化學引誘物是重組C5a(Sigma)、重組白細胞介素-8(Pepro Tech)、血小板活化因子-16(PAF-16；Calbiochem)或fMLP(Sigma)。在37℃下保溫60分鐘後，從孔中移出所述Transwel容器，在CyoFluorⅡ(PerSeptiveBiosystems)中分析微量滴定板的螢光。螢光度是遷移穿過了膜的粒細胞數的直接量度，以添加的細胞數的螢光百分數表示螢光度。結果圖1示出了粒細胞與一系列濃度葡萄球菌上清液(SaS)保溫對fMLP受體和C5a受體的影響。可見C5A受體和fMLP受體的急劇減量調節。
圖2示出了向引誘劑(fMLP)的趨化性(細胞運動)被強烈抑制了。
圖3示出了最強烈抑制活性處於240和280ml之間的洗出範圍內。該體積級分在這裡相應於約17kD的蛋白質。
圖4示出了CHIPS的前35個(N-末端)胺基酸的序列(預計總共125個中的)。基於該序列，按標準Fmoc化學[尤其按De Haas等在免疫學雜誌(J.Immunol.)161:3607～3615(1998)以及Alonso de Velasco等在傳染與免疫(Infect.Immun.)62:799～808(1994)中描述的那樣]製備了所述前15個胺基酸的合成肽。在兔中產生的抗該肽的抗體(按生產商Pierce的指示偶聯到KLH上，用弗氏完全佐劑進行皮下免疫，接著用弗氏不完全佐劑強化注射)(例如Alonso de Velasco等在上文描述的那樣)中和了CHIPS的活性。
粒細胞的平均螢光值是細胞表面上受體量的量度。以同對比緩衝劑保溫的細胞百分數表示扣除背景值之後的相對表達量。結果圖5a示出了由於純化了的CHIPS,C5a受體和fMLP受體二者也從細胞表面消失了。
圖5b示出了粒細胞與一系列濃度純化了的CHIPS保溫以及對定向遷移至fMLP的影響。可見，向fMLP的趨化性(細胞運動)被純化了的CHIPS完全地而且劑量依賴性地抑制了。
權利要求
1．葡萄球菌屬的趨化性抑制蛋白質(CHIPS蛋白質)，其特徵在於a)約為17kD的分子量；b)圖4中給出的N-末端胺基酸序列；以及c)一種生物活性，它包括在實施例1描述的試驗中防止fMLP與粒細胞結合的能力，及其生物活性片段。
2．用作生物活性物質的、權利要求1的CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段。
3．用作藥物的、權利要求1或2的CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段。
4．用於治療急性和慢性炎症反應和HIV感染的、權利要求1的CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段。
5．權利要求1的CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段在生產用於治療急性和慢性炎症反應和HIV感染的治療製劑方面的應用。
6．抗CHIPS蛋白質和/或其片段的抗體。
7．用於治療葡萄球菌屬感染的權利要求6的抗體。
8．治療組合物，它包含合適的賦形劑和CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段。
9．用於治療急性和慢性炎症反應和HIV感染的、權利要求8的組合物。
10．治療組合物，它包含合適的賦形劑和一種或多種抗CHIPS蛋白質和/或其生物活性片段的抗體。
11．純化CHIPS蛋白質的方法，它包括a)將金黃色葡萄球菌的培養物上清液或預純化後從其獲得的液體導引經過吸附層析柱；b1)接著將吸附層析柱的流過物質首先導引經過親和層析柱，再將親和層析柱的洗出液導引經過DNA柱；或者b2)接著將吸附層析柱的流過物質首先導引經過DNA柱，再將DNA柱的流過物質導引經過吸附層析柱；c)將步驟b1)最後那個柱的流過物質或步驟b2)最後那個柱的洗出液導引流過凝膠過濾柱並選擇分子量約為17kD的級分。
12．權利要求11的方法，其特徵在於，所述親和層析柱是所謂的配體染料「黃」柱，所述吸附層析柱是所謂的配體染料「綠」柱，並且，所述DNA柱是DNA纖維素柱。
13．測定CHIPS蛋白質或具有類似功能的蛋白質的活性的方法，該方法包括a)在第一個區室引入容許趨化性的標記細胞，尤其是白細胞；b)將一種或多種化學引誘物引入通過至少能滲透細胞的膜與第一個區室隔離的第二個區室；c)將需測試的蛋白質置於第一個區室中；d)在一定的時間後測定第二個區室中的標記量。
14．測定物質的趨化性調節活性的方法，該方法包括權利要求13的方法步驟，其中，需測試的物質替代步驟c)中的蛋白質。
全文摘要
本發明涉及一種新的、具有免疫調節特性的、細菌金黃色葡萄球菌的蛋白質。本發明進一步涉及一種治療組合物的生產,該組合物可作為一般性的炎症抑制劑和用於治療愛滋病,本發明還涉及抗CHIPS的抗體在治療葡萄球菌屬感染方面的應用。
文檔編號A61P31/04GK1309662SQ99808416
公開日2001年8月22日 申請日期1999年7月12日 優先權日1998年7月10日
發明者J·A·G·范斯特裡吉普, C·P·M·范凱瑟爾 申請人:亞利製藥有限公司