臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法

2023-09-22 12:03:55

專利名稱：臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法
技術領域：
本發明屬生物技術方法，主要涉及一種造血幹/祖細胞在體外擴增培養的新生物技術方法，尤其是能有效地提高造血幹/祖細胞體外擴增倍數和保持其質量的方法。
背景技術：
已有的造血幹/祖細胞體外擴增技術方法大致可歸為兩類第一類方法是在培養體系中外加不同組合的重組細胞生長因子，目的是利用細胞生長因子對造血幹/祖細胞增殖和分化進行適當的調控。第二類是近幾年來發展起來的方法，即用骨髓基質細胞來模擬體內造血幹/祖細胞生長和分化的環境，以促進其快速擴增和功能的激活。
目前上述兩類技術方法中，第一類技術方法能在一定程度上提高造血幹/組細胞的擴增倍數。但如果組合中的細胞因子種類太少，就難以達到理想的擴增效果，而太多的話則會因為費用昂貴而難以在臨床移植中應用。同時，不管如何組合重組細胞因子，也難以模擬體內支持造血幹/祖細胞生長和分化的環境，在一定程度上限制了造血幹/祖細胞的體外擴增效率。第二類技術方法可以模擬體內造血幹/祖細胞生長和分化環境，但是骨髓來源相對比較困難，並且骨髓間充質幹細胞難以建系，所以難以滿足培養造血幹/祖細胞大批量擴增培養所需的支持細胞需求。
臍血來源豐富，採集簡便，可以滿足大批量支持細胞的需求。同時，臍血間充質幹細胞和造血幹/祖細胞可以來自於同一份樣品，因此前者作為培養後者的支持細胞，具有最佳的相容性。目前未見有用臍血間充質幹細胞建立滋養層支持造血幹/祖細胞體外擴增技術的報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法，可開闢造血幹/祖細胞體外擴增中新的支持細胞來源，為造血幹/祖細胞擴增和分化提供新的微環境，提高其體外擴增效率。
本發明的目的通過以下方案實現從臍血中培養出臍血間充質幹細胞，並作為培養體系中的支持細胞，在結合外源生長因子的培養體系中體外擴增造血幹/祖細胞，達到進一步提高造血幹/祖細胞體外擴增效率的目的。
本發明方法所述的臍血中培養出的臍血間充質幹細胞，在培養體系中形成滋養層，體外支持造血幹/祖細胞擴增。
本發明方法所述的外源生長因子主要包含SCF、G-CSF和MGDF(每種細胞因子濃度為100ng/mL)。
本發明方法所述的從臍血中分離造血幹/祖細胞，種植到上述含有臍血間充質幹細胞層的培養體系中，在5％CO2和37℃下培養14天。
本發明方法所述的從臍血中分離造血幹/祖細胞，包含單個核細胞或純化CD34+細胞。
本發明的有益效果是採用臍血間充質幹細胞共培養的技術有效地提高造血幹/祖細胞體外擴增倍數，並保持了其擴增後的質量。在單個核細胞擴增培養中，用臍血間充質幹細胞滋養層結合外源細胞因子的擴增體系比僅用外源細胞因子的擴增體系提高了2.09倍，CD34+擴增培養中，用臍血間充質幹細胞滋養層結合外源細胞因子的擴增體系比僅用外源細胞因子的擴增體系提高了2.94倍，用臍血間充質幹細胞滋養層結合外源細胞因子的擴增體系擴增出的細胞比僅用外源細胞因子的擴增體系擴增出的細胞具有更多的GEMM-CFC形成潛能。新擴增技術具有明顯的擴增優勢。


圖1為人臍血間充質幹細胞的形態和鹼性磷酸酶染色。
圖2為流式細胞儀檢測臍血間充質幹細胞表面標記物的結果。
圖3兩種培養體系下臍帶血造血幹/祖細胞的擴增動態。
圖4兩種培養體系中GEMM-CFC的擴增。
具體實施例方式
實施例一 本發明方法的一種具體步驟用IMDM培養液培養臍血間充質幹細胞約7天，直至臍血間充質幹細胞在培養瓶中鋪層。然後在培養體系中加入三種細胞生長因子SCF、G-CSF和MGDF(每種細胞因子濃度為100ng/mL)，建立新的造血幹/祖細胞體外擴增培養體系。從臍血中分離造血幹/祖細胞(單個核細胞或純化CD34+細胞)，種植到上述含有臍血間充質幹細胞層的新培養體系中，在5％CO2和37℃下培養14天。
實施例二 臍血間充質幹細胞形態學及其免疫組化特性從臍血分離到的間充質幹細胞培養14天以後，可觀測到一些纖維狀似的細胞，隨後它們形成克隆，並逐漸擴張。在30天後，一種纖維狀細胞佔據了整個培養瓶的表面(參見圖1a)。
其中圖1a為培養30天的臍血間充質幹細胞，圖1b為臍血間充質幹細胞的鹼性磷酸酶染色(×100)。
用流式細胞儀分別檢測了臍血間充質幹細胞的CD13、CD14、CD29、CD166四種抗原，發現CD14(單核細胞的標誌性抗原)呈陰性，而CD13(髓系細胞、單核細胞表達的抗原)、CD166(內皮細胞、骨髓細胞、單核細胞表達的抗原)以及CD29(骨髓成纖維細胞的標誌性抗原)呈陽性。貼壁細胞中每種抗原的表達率分別是CD13為51.8％、CD166為35.6％、CD29為16.5％、CD14為3.8％。檢測的數據用Veresion3.1軟體分析的結果(參見圖2)。用成纖維細胞的標誌鹼性磷酸酶染色，發現培養的細胞(參見圖1b)都呈陽性，即胞漿呈灰色，內有很多黑色顆粒，甚至有的細胞黑色顆粒連成片。
實施例三 臍血造血幹/祖細胞的體外擴增效果1.有核細胞的擴增從臍血分離單個核細胞，並進一步分選出CD34+細胞，然後按本擴增技術體系進行體外擴增。分別在第7、9和14天對單個核細胞和CD34+細胞擴增的細胞進行取樣，並計細胞總數，由此計算擴增倍數。結果參見圖1。
參見圖3的擴增結果，其中(a)單個核細胞培養的有核細胞的擴增，(b)CD34+細胞培養的有核細胞擴增。在臍血間充質幹細胞滋養層並結合外源細胞因子的共擴增培養體系中，有核細胞擴增的速度明顯大於非共擴增培養體系(P＜0.01)單個核細胞擴增培養中，共擴增培養體系比非共擴增培養體系提高了2.1倍；CD34+擴增培養體系中，共擴增培養體系比非共擴增培養體系提高了3.0倍(見表1)。通過對比可以看出，臍血間充質幹細胞滋養層對CD34+細胞擴增的支持作用要大於對單個核細胞擴增的支持作用，同時也說明CD34+細胞具有非常高的擴增潛力。
表1 兩種培養體系下臍血造血幹/祖細胞的擴增(x±s)起始細胞×10擴增細胞×104提高倍數A組62.5±0.5 602.5±8.4 2.09±0.2單個核 62.5±0.5 1257.5±13.
細胞B組0CD34+A組7.4±0.798.8±7.02.94±0.1細胞B組7.4±0.7290.5±25.32.造血幹/祖細胞總集落擴增分析用臍血間充質幹細胞做滋養層並結合外源細胞因子的共擴增培養體系中，單個核細胞培養和CD34+細胞培養的GEMM-CFC擴增效率都比僅用外源細胞因子的非共擴增培養體系要高(P＜0.05)(見圖4)。
單個核細胞和CD34+細胞培養中的起始GEMM-CFC分別是57±4.7×104和23±2.1×104。經過14d的擴增後，用臍血間充質幹細胞做滋養層並結合外源細胞因子的共擴增培養體系(B組)中，單個核細胞擴增後的GEMM-CFC是2086±295.3×104(擴增36.6±4.2倍) CD34+細胞擴增後的GEMM-CFC是1807±155.9×104(擴增78.8±3.3倍)。在僅用細胞因子的非共擴增培養體系(A組)中，單個核細胞擴增後的GEMM-CFC是1046±141.6×104(擴增15.2±2.3倍)；CD34+細胞擴增後的GEMM-CFC是508±33.6×104(擴增22.2±1.1倍)。所以，共擴增培養體系與非共擴增培養體系比較，在單個核細胞擴增後的GEMM-CFC相對提高擴增效率2.0±0.1倍；CD34+細胞擴增後的GEMM-CFC相對提高擴增效率3.5±0.1倍。
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權利要求
1.臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法，其特徵是從臍血中培養出的臍血間充質幹細胞，並作為培養體系中的支持細胞，在結合外源生長因子的培養體系中體外擴增造血幹/祖細胞。
2.根據權利要求1所述的臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法，其特徵是用臍血中培養出的臍血間充質幹細胞形成培養體系的滋養層。
3.根據權利要求1所述的臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法，其特徵是外源生長因子主要包含SCF、G-CSF和MGDF。
4.根據權利要求1和2所述的臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法，其特徵是從臍血中分離造血幹/祖細胞，種植到上述含有臍血間充質幹細胞層的新培養體系中，在5％CO2和37℃下培養14天。
5.根據權利要求4所述的臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法，其特徵是從臍血中分離造血幹/祖細胞包含單個核細胞或純化CD34+細胞。
全文摘要
本發明提供一種臍血間充質幹細胞支持造血幹/祖細胞體外擴增方法，是從臍血中培養出臍血間充質幹細胞，並作為培養體系中的支持細胞，在結合外源生長因子的培養體系中體外擴增造血幹/祖細胞，達到進一步提高造血幹/祖細胞體外擴增效率的目的。採用臍血間充質幹細胞共培養的方法有效地提高造血幹/祖細胞體外擴增倍數，並保持了其擴增後的質量，擴增出的細胞具有更多的GEMM－CFC形成潛能。本發明的擴增方法具有明顯的擴增優勢。
文檔編號C12N5/08GK1539964SQ20031010825
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月28日 優先權日2003年10月28日
發明者王金福 申請人:浙江大學, 杭州大力神醫療器械有限公司