一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法

2023-09-22 12:05:45 3

專利名稱：一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法
技術領域：
本發明屬於天然產物化學的技術領域，具體涉及一種從橄欖葉中分離提取高純度橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法。
背景技術：
油橄欖(Olea europaea L.),又稱洋橄欖、齊墩果,為木犀科(Oledceae)木犀欖屬(Olea L)植物，昌世界名貴常綠木本油料和果用樹種。油橄欖原產小亞細亞，經引種進入我國，現有油橄欖面積約50萬畝。油橄欖以葉和果實入藥用於治療多種疾病，橄欖葉的煎劑或浸劑在地中海國家常作為糖尿病的民間用藥，有一定的療效。油橄欖葉提取可用做膳食補充劑以增強免疫功能。 現有資料表明油橄欖具有抗心率不齊，抗真菌，抗高膽固醇，降血糖，降血壓，抗炎，抗氧化，抗病毒，利尿等多種藥理活性。從油橄欖葉中分離得到的化學成分可分為黃酮類、糖類、萜類、有機酸類及其它化合物。橄欖苦昔的藥理作用主要有降血壓、抗氧化、抗微生物和抗癌等作用。橄欖葉中還含有穗花杉雙黃酮，依賴性地清除二苯代苦味醯肼(DPPH)自由基，並能顯著減輕溶血性磷脂醯膽鹼(LPC)所致的ECV304細胞損傷。穗花杉雙黃酮可通過抑制轉錄因子NF- K B的活化，抑制一氧化氮合酶的誘導生成，從而發揮抗炎活性，另外還具有體外降糖的效果。目前國內有報導用橄欖葉提取加工橄欖葉提取物，但大多採用簡單水提或醇提後直接噴霧乾燥成分，產品中橄欖苦甙、總酚及黃酮含量低。在2007年《青橄欖葉的化學成分研究》文獻中報導了從橄欖葉分離到了穗花杉雙黃酮。王成章也報導了橄欖苦甙在橄欖葉中比果實和樹皮中含量要高得多。公開號為CN101955503A的中國專利介紹了一種橄欖苦甙的製備方法，取多花素馨花作為原料，採用超臨界CO2萃取技術進行提取，有機溶劑萃取，大孔樹脂吸附分離，濃縮過濾，結晶重結晶得到橄欖苦甙。此方法因為原材料是花部分，對大規模製備橄欖苦甙有一定難度，另外，在目前生產過程中超臨界CO2萃取技術很少應用，主要是一次投料生產量小，生產設備成本過高，所以這一技術很難應用於生產。公開號為CN102060893A的中國專利介紹了一種從油橄欖葉中同步製備橄欖苦苷和橄欖總黃酮的工藝方法，雖然採用了大孔吸附樹脂串聯吸附、梯度解吸附，分離開了大部分的物質，但將解吸液回收有機溶劑後直接噴霧乾燥，分別得到較高含量的橄欖苦苷和橄欖總黃酮提取物產品。此方法分離過程太長，造成其有效成分得率過低，另外將解吸液直接噴霧乾燥，解吸液中金屬離子以鹽的形式存在於產品中，其它雜質也會降低其有效成分含量。

發明內容
本發明採用的技術方案包括乾燥過後的油橄欖葉經用乙醇溶液提取、過濾、減壓濃縮，萃取，然後用樹脂吸附、乙醇洗脫、將洗脫液濃縮，結晶與重結晶製得橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮純品。
因此，本發明提供一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法，步驟包括(I)粉碎橄欖葉，並將橄欖葉、60%乙醇按重量(kg) /體積比(L) =1:1-8進行混合，加熱至50°C左右進行回流提取；(2)過濾除渣後，在50°C減壓濃縮至無乙醇味；(3)將濃縮液用2-3倍體積的乙酸乙酯分三次進行萃取，分離得到三次乙酸乙酯層萃取液，合併其萃取液，並在50°C將其萃取液進行減壓濃縮，直至獲得乾燥物；(4)將乾燥物用等重量水進行溶解，上H—103大孔樹脂進行吸附，用40%乙醇進行洗脫，收集洗脫液I，再用70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液II ；
(5)將洗脫液I進行減壓濃縮至原有體積的1/4-1/5，加入三倍體積的無水乙醇進行結晶和重結晶，得橄欖苦甙；(6)將洗脫液II進行減壓濃縮至原有體積的1/5-1/6，加入二倍體積的丙酮進行結晶和重結晶，得穗花杉雙黃酮。在一個實施方案中，步驟⑵的回流提取時間為5小時至18小時。在一個實施方案中，步驟(2)的過濾過程是紗布過濾、陶瓷膜過濾。其中，優選是三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次。在一個實施方案中，步驟(5)、(6)中進行結晶和重結晶時結晶溫度在低溫下進行，優選是在4 °C左右。技術效果I、本發明方法中所用的原料、設備均為常見的普通原料、設備，避免了工業化生產過程中對於昂貴原材料、儀器的依賴，大大地降低了生產成本。2、本發明所用的試劑均為無毒、廉價、量產的化學試劑，整個過程中可利用成熟的試劑回收的常規技術，這極大地降低了向環境排放廢棄物。3、經過長期摸索，本發明確定了採用高濃度乙醇在低溫條件下進行結晶，橄欖苦甙的純度是最高，可達到97. 37-98. 23%。4、由於能同時提取出橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮，極大地降低了其生產成本，又節約了橄欖葉資源。


圖I :橄欖苦甙標準品的HPLC曲線圖，其中縱坐標表示峰面積，橫坐標表示分離時間。圖2:從橄欖葉中提取的橄欖苦甙的純度HPLC曲線圖，其中縱坐標表示峰面積，橫坐標表示分離時間。圖3 :穗花杉雙黃酮純品的C-NMR譜圖4 :穗花杉雙黃酮純品的H-NMR譜
具體實施例方式下面，本發明將用實施例進行進一步的說明，但是它並不限於這些實施例的任一個或類似實例。
實施例I稱取IOOkg橄欖葉，普通粉碎機進行粉碎，加入400L的60%乙醇進行混合，加熱至50°C左右進行回流提取10小時後，採用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次；進行過濾除渣後，在50°C減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液80L ;將濃縮液用200L的乙酸乙酯分三次進行萃取，分離得到三次的乙酸乙酯層，合併乙酸乙酯萃取液220L，將其萃取液進行50°C減壓濃縮，直至獲得乾燥物2. 65kg ;將乾燥物用2. 65kg水進行溶解，上H —103大孔樹脂進行吸附，用40%乙醇進行洗脫，收集洗脫液I 40L，再用70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液
II30L ;將洗脫液I進行減壓濃縮至8L，加入24L的無水乙醇在4°C進行結晶和重結晶，得橄欖苦甙I. 17kg ;將洗脫液II進行減壓濃縮至5L，加入IOL的丙酮在4°C進行結晶和重結晶，得穗花杉雙黃酮0. 36kg。所得重結晶樣品進行純度，其檢測儀器為AgilentllOO高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，色譜柱為Shim-pack ODS C18柱(4. 6 X 150mm，5 y m)，流動相為0. 2%磷酸溶液一乙睛(79:21，V/V)，檢測波長254nm ;柱溫30°C ;流速1. OmL/min ;上樣量為10 u L，檢測所得到橄欖苦甙的純度為98. 43%。流動相為0. 5%磷酸二氫鈉溶液一甲醇(40:60, V/V)，檢測波長330nm ;柱溫30°C ;流速1. OmL/min ;上樣量為IOy L，檢測所 得到穗花杉雙黃酮的純度為97. 68%。實施例2稱取200kg橄欖葉，普通粉碎機進行粉碎，加入600L的60%乙醇進行混合，加熱至50°C左右進行回流提取10小時後，採用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次；進行過濾除渣後，在50°C減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液150L ;將濃縮液用350L的乙酸乙酯分三次進行萃取，分離得到三次的乙酸乙酯層，合併乙酸乙酯萃取液380L，將其萃取液進行50°C減壓濃縮，直至獲得乾燥物5. 48kg ;將乾燥物用5. 48kg水進行溶解，上H —103大孔樹脂進行吸附，用40%乙醇進行洗脫，收集洗脫液I 60L，再用70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液II 45L ;將洗脫液I進行減壓濃縮至12L，加入36L的無水乙醇在4°C進行結晶和重結晶，得橄欖苦甙
2.35kg ;將洗脫液II進行減壓濃縮至8L，加入16L的丙酮在4°C進行結晶和重結晶，得穗花杉雙黃酮0. 84kg。按實施例I中檢測方法進行檢測所得到橄欖苦甙的純度為98. 26%，穗花杉雙黃酮的純度為98. 25%。實施例3稱取500kg橄欖葉，普通粉碎機進行粉碎，加入2000L的60%乙醇進行混合，加熱至50°C左右進行回流提取10小時後，採用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次；進行過濾除渣後，在50°C減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液300L ;將濃縮液用800L的乙酸乙酯分三次進行萃取，分離得到三次的乙酸乙酯層，合併乙酸乙酯萃取液850L，將其萃取液進行50°C減壓濃縮，直至獲得乾燥物11. 28kg ;將乾燥物用11. 28kg水進行溶解，上H—103大孔樹脂進行吸附，用40%乙醇進行洗脫，收集洗脫液I 150L，再用70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液
II120L ;將洗脫液I進行減壓濃縮至30L，加入90L的無水乙醇在4°C進行結晶和重結晶，得橄欖苦甙5. 74kg ;將洗脫液II進行減壓濃縮至20L，加入40L的丙酮在4°C進行結晶和重結晶，得穗花杉雙黃酮1.95kg。按實施例I中檢測方法進行檢測所得到橄欖苦甙的純度為98. 78%，穗花杉雙黃酮的純度為97. 83%。
權利要求
1.一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法，其具體步驟包括 (1)粉碎油橄欖葉，並將橄欖葉、50%乙醇按重量(kg)/體積比(L)=1:1-8進行混合，力口熱回流提取； (2)過濾除渣後，減壓濃縮至無乙醇味； (3)將濃縮液用2-3倍體積的乙酸乙酯萃取三次，分離乙酸乙酯層並進行濃縮，直至獲得乾燥物； (4)將乾燥物用等重量水進行溶解，上H —103大孔樹脂進行吸附，用40%乙醇進行洗脫，收集洗脫液I，再用70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液II ； (5)將洗脫液I進行減壓濃縮至原有體積的1/4-1/5，加入三倍體積的無水乙醇進行結晶和重結晶，得橄欖苦甙； (6)將洗脫液II進行減壓濃縮至原有體積的1/5-1/6，加入二倍體積的石油醚進行結晶和重結晶，得穗花杉雙黃酮。
2.根據權利要求I的方法，步驟(2)的過濾過程是紗布過濾、陶瓷膜過濾，其中，優選是三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾I次。
3.根據權利要求I或2的方法，其中步驟(5)、(6)中進行結晶和重結晶時結晶溫度在低溫下進行，優選是在4°C左右。
全文摘要
一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮的方法。乾燥過後的油橄欖葉經用乙醇溶液提取、過濾、減壓濃縮，萃取,然後用樹脂吸附、乙醇洗脫、將洗脫液濃縮，結晶與重結晶製得橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮純品。所用的試劑均為無毒、廉價、量產的化學試劑，整個過程中可利用成熟的試劑回收的常規技術，這極大地降低了向環境排放廢棄物。由於能同時提取出橄欖苦甙和穗花杉雙黃酮，極大地降低了其生產成本，又節約了橄欖葉資源。
文檔編號C07H1/08GK102731592SQ20121020915
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月25日 優先權日2012年6月25日
發明者代洪波, 李蘭嵐, 王斯成 申請人:向華