在高濃度蛋白質溶液中減少或防止液-液相分離的方法

2023-09-22 14:01:35 2

專利名稱：在高濃度蛋白質溶液中減少或防止液-液相分離的方法
技術領域：
本發明一般涉及蛋白質製劑的領域。
背景技術：
來自生物技術的蛋白質和肽藥物的可得性為大量疾病的治療和預防創 造了新的選擇。基於蛋白質的療法，特別是基於單克隆抗體的療法，已經 成為治療疾病如癌症、變應性疾病、哞喘和類風溼性關節炎的一種重要方 法。
基於抗體的療法一般以常規的間期施用給患者，並需要通過注射進行 若干mg/kg的給藥(dosing)。皮下注射是這些療法的一個優選的施用途徑。 因為皮下注射使用的體積小(常為1.5 mL)，所以對於高劑量抗體療法而言， 該施用途徑需要高濃度的蛋白質製劑。
使用高濃度蛋白質溶液中的一個挑戰是高於特定蛋白質濃度的蛋白質 溶液中乳光(即混濁)的發生。該現象能夠造成不均勻的溶液並影響蛋白質 溶液的加工。另外，溶液的乳光可具有消極的商業後果。因此，期望獲得 澄清的蛋白質溶液，使得在加工期間操作簡便且最終藥物產品有更吸引人 的外觀。
因此，存在開發下述方法的需要，所述方法用於獲得不是乳光的(即混濁的)高濃度蛋白質溶液。
發明概述
本發明涉及配製高濃度蛋白質溶液的方法。更明確地，本發明涉及減 少或防止以高蛋白質濃度配製的蛋白質溶液的液-液相分離的方法。因此， 本發明一般提供高濃度蛋白質溶液，其具有減少的乳光並因此視覺上
(visibly)是澄清的。如本文中所述，視覺上澄清的溶液有助於加工期間操作 的簡便，並且作為商業化的產品更加吸引人。另外，本發明提供了使用蛋 白質溶液的液-液相分離濃縮和純化蛋白質的方法。
本發明 一方面提供了測定蛋白質濃度的方法，在該濃度下再配製 (reformulate)在顯示液-液相分離的蛋白質溶液中的蛋白質以便減少或防 止蛋白質溶液中的液-液相分離。更明確地，減少和/或防止液-液相分離的 方法包括將溶液維持或調節至期望的溫度。例如， 一種方法包括允許顯示 液-液相分離的蛋白質溶液經歷液-液相分離成為上部和下部液相。然後測 量已經歷了液-液相分離的蛋白質溶液的上部和下部相中蛋白質的濃度。大 於蛋， 質。
期望溫度下的液-液相分離。在某些實施方案中，期望溫度下在蛋白質溶液 中配製蛋白質的蛋白質濃度被選擇為比下部相中蛋白質濃度高約0.5 %到 約40%。在其他實施方案中，期望溫度下在蛋白質溶液中配製蛋白質的蛋 白質濃度被選擇為比下部相中蛋白質濃度高約0.5%到約5%、約5%到約 10%、約10%到約20%、約20%到約30%、約30%到約40%、約5%到 約20%、約5%到約30%,或約5%到約40%。
在本發明的其他方面中，下述方法包括構建蛋白質溶液的相分離曲線 和選擇在期望的溫度下處於相分離曲線以外的濃度，所述方法用於測定下 述蛋白質濃度，在該濃度下再配製在顯示液-液相分離的蛋白質溶液中的蛋 白質，以便減少或防止在期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相分離。在期 望的溫度下處於相分離曲線外的濃度允許再配製在蛋白質溶液中的蛋白質以便減少或防止在期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相分離。在該方面的 某些實施方案中，通過繪製兩個或多個不同溫度下蛋白質溶液的處於平衡 中的兩種共存液相的濃度構建相分離曲線，所述溫度下該蛋白質溶液顯示 液-液相分離。在某些實施方案中，兩個或更多不同溫度中至少一個是期望 的溫度。
在本發明的另一方面中，下述方法包括提供至少第一蛋白質溶液，其 具有一種蛋白質濃度和笫 一溫度，在該溫度下第 一蛋白質溶液顯示液-液相 分離，)，和至少第二蛋白質溶液，其處於第一蛋白質溶液的濃度下並具有 第二溫度，在該溫度下第二蛋白質溶液顯示液-液相分離，所述方法用於確 定濃度，在該濃度下在蛋白質溶液中配製蛋白質以減少或防止在期望的溫 度下蛋白質溶液中的液-液相分離。這些方法還涉及允許第一和第二蛋白質 溶液經歷液-液相分離成為上部和下部相。測量第一和第二蛋白質溶液的上 部和下部相中蛋白質的濃度並用於構建相分離曲線。該相分離曲線指定了
在第一和第二溫度下第一和第二蛋白質溶液的處於平衡中的上部和下部相 的濃度。在期望的溫度下處於相分離曲線外的蛋白質濃度被選擇用於在蛋 白質溶液中配製蛋白質，以便減少或防止在期望的溫度下蛋白質溶液中的 液-液相分離。在該方面的某些實施方案中，允許第三蛋白質溶液經歷液-液相分離，且在構建相分離曲線時包括其上層和下層的濃度，所述第三蛋 白質溶液具有與第一蛋白質溶液相同的蛋白質濃度和第三溫度。在其他實 施方案中，允許第四蛋白質溶液經歷液-液相分離，且在構建相分離曲線時 包括其上層和下層的濃度，所述第四蛋白質溶液具有與第一蛋白質溶液相 同的蛋白質濃度和第四溫度。在另一實施方案中，允許第五蛋白質溶液經 歷液-液相分離，且在構建相分離曲線時包括其上層和下層的濃度，所述第 五蛋白質溶液具有與笫一蛋白質溶液相同的蛋白質濃度和第五溫度。通過 本文的教導能夠明白，使用本文所述方法構建相分離曲線時可包括其他蛋 白質溶液。
在本發明的另一方面，下述方法包括提供第一濃度下第一蛋白質溶液 中的蛋白質、提供第二濃度下第二蛋白質溶液中的蛋白質和提供第三濃度
9下第三蛋白質溶液中的蛋白質，其中第一、笫二和第三蛋白質溶液處於第 一、第二和第三溶液不顯示液-液相分離的溫度下，所述方法用於確定濃度，
在該濃度下在蛋白質溶液中配製蛋白質以便減少或防止在期望的溫度下蛋 白質溶液中的液-液相分離。該方法還包括將第一、第二和第三溶液冷卻至 第一、第二和第三溶液的濁點溫度，並通過針對第一、第二和第三濃度繪 制第一、第二和第三蛋白質溶液的濁點溫度構建相分離曲線。在期望的溫 度下處於相分離曲線外的濃度被確定為下述濃度，在該濃度下在蛋白質溶 液中配製蛋白質以便減少或防止在期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相 分離。
在本發明的另一方面中，用於在蛋白質溶液中配製蛋白質的下述方法 包括在下述濃度下在蛋白質溶液中配製蛋白質，所述方法中蛋白質溶液在 期望的溫度下不顯示液-液相分離，所述濃度處於在期望的溫度下蛋白質溶 液的相分離曲線外。
還在本發明的另一方面中，用於再配製在下述蛋白質溶液中蛋白質的 下述方法包括對顯示液-液相分離的蛋白質溶液進行液-液相分離成為上部 和下部液相，所述蛋白質溶液在期望的溫度下顯示液-液相分離，所述方法 中再配製的蛋白質溶液在期望的溫度下不顯示液-液相分離。然後測量蛋白 質溶液的上部和下部相的濃度。在下述濃度下再配製在溶液中的蛋白質， 所述濃度高於蛋白質溶液下部相的濃度。這減少或防止在期望的溫度下再 配製的蛋白質溶液中的液-液相分離。
在本發明的又一方面中，在蛋白質溶液中配製蛋白質使得該蛋白質溶
液在期望的濃度下不顯示液-液相分離的方法包括在如下溫度下儲存蛋白 質溶液，所述溫度高於發生液-液相分離的溫度並且處於蛋白質溶液的相分 離曲線外。
在本發明的另一方面，從在期望的溫度下顯示液-液相分離的蛋白質溶 液獲得在期望的溫度下不顯示液-液相分離的蛋白質溶液的方法包括允許 顯示液-液相分離的蛋白質溶液在期望的溫度下經歷分離成為上部和下部 相。取出蛋白質溶液的下部相。該下部相是在期望的溫度下不顯示液-液相分離的蛋白質溶液。
本發明還提供了從顯示液-液相分離的較低濃度蛋白質溶液獲得較高
濃度蛋白質溶液的方法。該方法一般包括允許原始的蛋白質溶液分離成為 上部和下部相，並將下部相與上部相分離。下部相是下述蛋白質溶液，其
具有比較低濃度的蛋白質溶液更高的蛋白質濃度。
在本發明的另一方面中，在期望的溶液中濃縮蛋白質的方法包括在任 何溶液中配製該蛋白質，其中該蛋白質溶液顯示液-液相分離。促進蛋白質 溶液中的液-液相分離，從而在蛋白質溶液中形成上部和下部相。將上部相 與下部相分離。該下部相具有比原始蛋白質溶液更高的蛋白質濃度。然後 進行緩沖液交換，將蛋白質從其所在的蛋白質溶液中轉移至期望的溶液中。
本文使用的"蛋白質"包括蛋白質、肽、蛋白質片段、綴合蛋白質和 含有非天然存在的胺基酸的多肽。根據本發明的蛋白質可以是受體、配體、 轉錄因子、酶、凝結因子、信號轉導蛋白和抗體。蛋白質也可以是多克隆 抗體或其抗原結合片段，或單克隆抗體或其抗原結合片段。
對蛋白質溶液而言期望的溫度可以是將要加工、製造、儲存或施用該 蛋白質溶液的溫度。另外，可以通過重力分離或離心達成液-液相分離。
除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域 普通技術人員通常所理解的相同含義。儘管在本發明的實踐或測試中能夠 使用與本文所述的方法和材料類似或等效的方法和材料，但是合適的方法 和材料在下文描述。本文提到的所有的出版物、專利申請、專利和其他參 考文獻被完整引入作為參考。另外，材料、方法和實施例僅用於闡述，而 非旨在限制。
根據附圖、詳述和權利要求書可以理解本發明的其他特徵和優點。 附圖概述


圖1是曲線圖，其描述了通過PEG沉澱測量的蛋白質相對溶解度和通 過500 nm處吸光度測量的乳光之間的反相關。該實驗中的所有蛋白質以 90 mg/ml配製在pH 6.0的10 mM組氨酸中。圖2是使用抗-Al抗體(50。C下在10 mM Tris pH 8.0中70 mg/ml)和抗 -81單克隆抗體(50°(:下在20 mM琥珀酸鹽緩沖液pH 6.0中50 mg/ml)進行 液-液相分離現象的圖解。在左側管中觀察到液-液相分離。
圖3是涉及溫度猝熄方法(temperature quench method)的實驗步驟的 圖示，所述方法用於構建以70 mg/ml配製在10 mM Tris pH 8中的抗-Al 抗體的相圖。
圖4是使用溫度猝熄方法構建的以70 mg/ml配製在10 mM Tris pH 8 中的抗-Al抗體的相圖。被認為是"超出"相圖或相圖"以外"的區域用 斜線畫上陰影。被認為是相圖"以內，，或"以下"的區域被填滿。
圖5是使用濁點方法構建的抗-Al抗體的相圖。被認為是"超出"相 圖或相圖"以外"的區域用斜線畫上陰影。被認為是相圖"以內"或"以 下"的區域被填滿。
圖6提供了相圖與在10。C的固定溫度下以不同濃度被配製在10 mM TrispH8中的四種抗-Al抗體製劑外觀的相關性。圖中用星號指出IO'C下 的下部和上部相界濃度。該圖表明使用"超出"相圖或相圖"以外"的濃 度配製的蛋白質製劑是澄清的，而具有落入相圖"之內或內部"的濃度的 那些蛋白質製劑是乳白色的。
圖7提供了以59 mg/ml配製在10 mM Tris pH 8中的抗-Al抗體製劑 上部和下部相中賦形劑濃度的比較，所述抗體製劑已經過液-液相分離。"透 析後"樣品對應於在液-液相分離之前的蛋白質製劑。
圖8提供了以59 mg/ml配製在10 mM Tris pH 8中的抗-Al抗體製劑 上部和下部相中蛋白質大小(SEC-HPLC)和電荷(CEX-HPLC)的比較，所 述抗體製劑已經過液-液相分離。
圖9提供了以59 mg/ml配製在10 mM Tris pH 8中的抗-Al抗體製劑 上部和下部相中抗-Al的二級結構的比較，所述抗體製劑已經過液-液相分 離，所述比較使用FTIR醯胺I語。
圖10提供了以59 mg/ml配製在10 mM Tris pH 8中的抗-Al抗體制 劑上部和下部相中蛋白質的三級結構的比較，所述抗體製劑已經過液-液相分離，所述比較使用螢光與45°角比色杯。 發明詳述
對基於蛋白質的療法而言，存在增長的實現高蛋白質濃度的需求。然 而，由於在高蛋白質濃度下配製的某些蛋白質溶液中液-液相分離的現象， 乳光(即蛋白質溶液的混濁)對蛋白質配方設計師(formulator)而言是一個主 要問題。本文公開的方法通過減少或防止期望的溫度下的液-液相分離提供 了以高濃度配製蛋白質的新方法。因此，這些方法產生具有降低的乳光的 蛋白質溶液。本文所述的方法使用液-液相分離和/或相圖測定適合在目的 緩沖液/溶液中配製蛋白質的濃度，所述濃度在期望的溫度下使用，從而得 到的高蛋白質濃度溶液具有減少的液-液相分離並且視覺上是澄清的。本文 所述的方法還利用液-液相分離和相分離曲線測定適合在目的緩沖液/溶液 中配製蛋白質的溫度，所述溫度在固定的濃度下使用，使得得到的蛋白質 溶液具有減少的液-液相分離並且視覺上是澄清的。另外，本發明提供了濃 縮蛋白質溶液和純化蛋白質的方法。
溶解度和乳光之間的關係
蛋白質溶液中蛋白質的溶解度與蛋白質溶液的乳光相關。"乳光"表 示蛋白質溶液的可檢測的混濁或濁度。發明人已發現溶解度和乳光之間存 在反相關，特別是在高蛋白質濃度下。更明確地，蛋白質溶液中降低的蛋 白質溶解度與蛋白質溶液中高蛋白質濃度下蛋白質溶液提高的乳光相關。 該信息對配方設計師確定如何在高濃度下配製蛋白質是有用的。"高濃度" 表示大於約50 mg/ml (例如50 mg/ ml、 75 mg/ml、 100 mg/ml、 200 mg/ml、 300 mg/ml、 400 mg/ml、 500 mg/ml等等)的蛋白質濃度。在本申請通篇中 使用的術語"約"表示在所述值周圍±20%的數值。如果具體的蛋白質溶液 是混濁的，則配方設計師可以找到配製蛋白質的備選方法，以減少或防止 蛋白質溶液的混濁。例如，可在若干緩衝液/溶液中測試高濃度下目的蛋白 質的溶解度，以測定蛋白質在所述緩衝液中的溶解度。如果溶解度在具體
13的緩沖液/溶液中很低，則很可能蛋白質溶液會是乳光的。因此，配方設計 師可選擇其中蛋白質在高濃度下更可溶的不同緩沖液/溶液，從而使配方設 計師能夠實現澄清的蛋白質製劑。
測定蛋白質溶液中蛋白質溶解度的方法是本領域公知的。美國臨時申
請號60/801 ，862(併入本文作為參考)描述了使用聚乙二醇沉澱預測蛋白質 相對溶解度的新方法。
一般可通過用眼的簡單目測法(即溶液是否是混濁或渾濁的)、直角光 散射或螢光測定乳光。然而在一些情況下，乳光是人眼不能探測的。在這 些情況下，和在需要定量讀數的情況下，可以使用更靈敏的方法如分光光 度法或用於探測樣品吸光度的等效手段測定乳光，所述分光光度法例如通 過4吏用可見光分光光度計(在400-600 nm範圍內例如500 nm處測量)的自 動化分光光度法。測定乳光的其他方法包括光電濁度分析法(例如自動濁度 分析法)。
乳光和液-液相分離
液-液相分離可導致蛋白質溶液的乳光。"液-液相"分離(也已知為二 元液相分離和凝聚)表示一種現象，在低於相分離臨界溫度的溫度下，蛋白 質溶液通過該現象分離成為不等的蛋白質濃度的兩個共存液相中。通常在
具有高蛋白質濃度的蛋白質溶液中觀察到液-液相分離；這類蛋白質溶液是 乳光的。
若干種因素在液-液相分離中起作用。這些因素包括，但不僅限於，蛋 白質溶液的溫度、蛋白質溶液中的蛋白質濃度、溶液或緩沖液的pH、溶液 或緩衝液的離子強度，和蛋白質自身相互作用和溶解度特性。關於溫度， 在溶液的溫度低於相分離臨界溫度時觀察到液-液相分離。"相分離的臨界 溫度"表示一個溫度，在該溫度下蛋白質溶液具有經歷液-液相分離的潛能。
關於濃度，高濃度蛋白質溶液也更可能顯示相分離。關於pH,如果以高蛋 白質濃度配製的蛋白質溶液的pH接近蛋白質的等電點(pI)，則蛋白質溶液 中可能發生液-液相分離。最後，以高濃度配製的蛋白質溶液中提高的離子
14強度有助於液-液相分離。
可如下促進液-液相分離將高濃度蛋白質溶液混合併允許蛋白質溶液 沉降。重力分離導致上部液相和下部液相的分離，它們由狹窄彎月面 (meniscus)隔開。除了重力分離以外，促進兩相分離的備選方法是離心(例 如在4，000Xg下)。對於相同的蛋白質溶液而言，沉降速度在更低的溫度下 更大，這歸因於兩相之間密度的較大差異。可以通過常規技術人員已知的 任何手段(例如通過使用巴斯德吸管)將下部相與上部相分離。
經歷過液-液相分離的蛋白質溶液的上部相和下部相具有不同的蛋白 質濃度。下部相具有比上部相更高的蛋白質濃度。上部和下部相中蛋白質 的濃度可通過本領域已知的任何方法測定，包括但不僅限於，蛋白質內在 UV吸光度(280 nm下)的測量、Lowry測定法、Smith銅/雙辛可寧酸 (bicinchoninic)測定法和Bradford染料測定法。
為了測定在期望的溫度下以特定高濃度配製在選定的緩衝液/溶液中 時，未知的蛋白質是否會經歷液-液相分離，將該蛋白質以特定的濃度配製 在期望的緩衝液/溶液中，混合併在期望的溫度下溫育。如果混合的蛋白質 溶液是混濁的，則首先指出液-液相分離是可能發生的。當然，在重力分離 或離心後如果蛋白質溶液分離成為上部和下部液相，則這會是顯而易見的。
構建相圖
如果蛋白質溶液在期望的溫度下在期望的緩衝液/溶液中經歷液-液相 分離，則必須找到避免該現象的方法。這對於藥物製劑是特別重要的，因 為液-液相分離產生不均一的溶液，該溶液外觀也是混濁的。本文所述的方 法提供了該問題的解決方法。在一些實施方案中，這些方法涉及相圖的使 用。
在本申請的上下文中，相圖(也已知為相分離曲線或共存曲線)是指出 相行為(即蛋白質溶液是否以一相或兩相存在)作為蛋白質溶液中蛋白質濃 度和蛋白質溶液溫度的函數的圖譜。相圖指定了給定溫度下處於平衡中的 共存的液相的兩種濃度。相圖通常通過下述兩種方法之一獲得(l)溫度猝 熄法，或(ii)濁點溫度法。溫度猝熄法
在構建相圖的該方法的 一個非限制性實例中，將含有相同高濃度蛋白
質(例如約50-100 11^/1111)的蛋白質溶液的若干樣品從蛋白質溶液不顯示液-液相分離的溫度降低至更低的溫度。可以按照經驗測定蛋白質溶液不顯示 液-液相分離的溫度。通常，溫度越高，蛋白質溶液顯示液-液相分離的機 會越低。 一般可從室溫開始，並且如果在該溫度下觀察到目的蛋白質溶液 的相分離，可以移至更高的溫度。 一旦確定了未發現發生相分離的溫度， 則將所有蛋白質溶液從其現有溫度移至該溫度。然後將這些樣品冷卻至若 幹不同的更低溫度，在所述更低溫度下發生液-液相分離。可以在控溫箱中 將樣品溫育約30分鐘，然後視覺檢查溶液是混濁還是澄清。然後通過重力 分離或離心允許混濁樣品平衡為上部和下部相。取出來自各蛋白質溶液的 上部和下部相的樣品等分試樣，並測量這些樣品中的蛋白質濃度。通過繪
制蛋白質溶液的具體溫度下各蛋白質溶液上部和下部相的濃度構建相圖， 所述溫度下所述溶液顯示液-液相分離。通常，將溫度繪製在y軸上並將蛋 白質濃度繪製在x軸上。實施例3中提供了構建相圖的該方法的一個非限 制性說明。
濁點法
在該方法的一個非限制性實例中，已知蛋白質濃度並處於蛋白質溶液 不是乳光的溫度下的一種或多種蛋白質溶液被置於光散射分光光度計中， 然後將溫度緩慢降低。可根據經驗測定蛋白質溶液不是乳光的溫度。例如， 可以從室溫開始並根據需要移至更高的溫度，直至獲得在給定濃度下不混 濁的溶液。在各溫度下監測蛋白質溶液的光散射強度。通過入射束的廣泛 多重散射引起的投射束的消失檢測蛋白質溶液中相分離的開始。這對應於 溶液開始變得混濁。相分離開始並因此發生乳光的溫度是濁點溫度T;蟲點。 然後針對蛋白質溶液的濃度繪製各蛋白質溶液的T鼓，獲得基於濁點溫度 的相圖。通常將溫度繪製在y軸上，將濃度繪製在x軸上。實施例4中提供了該方法的非限制性說明。 解釋相圖
高濃度蛋白質溶液的液-液相分離的相圖像倒置的拋物線。曲線的升支
和降支在曲線的最高點匯合，所述最高點定義了臨界溫度(Tc)。臨界溫度 代表相分離能夠開始發生的溫度，只要蛋白質溶液中的蛋白質濃度在適宜 的範圍內。在相分離曲線以外(即倒置拋物線以外)的區域中，蛋白質溶液 是均一和單相的。在曲線下的區域中，液-液相分離發生，且高密度相的沉 積導致宏觀分離成為兩個透明層，底部液相中具有高蛋白質濃度，上部液 相中具有低蛋白質濃度。
確定濃度的方法，所述濃度用於配製具有降低的乳光的蛋白質溶液
本申請部分涉及確定濃度的方法，以所述濃度在緩沖液/溶液中配製蛋 白質，其中得到的蛋白質溶液在期望的溫度下不顯示或顯示減少的液-液相 分離。本申請還部分涉及確定濃度的方法，以所述濃度在緩沖液/溶液中配 制蛋白質使得蛋白質溶液在期望的溫度下是基本澄清的(即具有減少的乳 光)。這些方法適用於測定新濃度，當原始配製的蛋白質溶液在期望的溫度 下顯示液-液相分離時以所述新濃度在緩衝液/溶液中再配製蛋白質。
通常，這些方法涉及測定用於在緩沖液/溶液中配製的蛋白質濃度，其 應是在期望的溫度下處於蛋白質溶液相圖以外的濃度。如果使用在期望的 溫度下位於曲線以外和左側(更低濃度蛋白質溶液)或以外和右側(更高濃度 蛋白質)的蛋白質濃度配製蛋白質溶液，則蛋白質溶液在期望的溫度下在這 些濃度下不會顯示液-液相分離或乳光。"期望的溫度"表示將要使用、操 作或儲存蛋白質的溫度。期望的溫度的非限制性實例包括將要製造、加工、 儲存蛋白質溶液或將其施用給受試者的溫度。
通常當配方設計師配製遞增蛋白質濃度的蛋白質溶液時，他們不嘗試 將蛋白質溶液的濃度提高到超出發生乳光或液-液相分離的濃度。本文中， 發明人驚人和意外地發現只要蛋白質濃度被提高到超出在期望的溫度下的
17相圖或在相圖以外，則混濁或液-液相分離可以減少或甚至消失。這對於嘗 試配製用於治療的高濃度蛋白質(例如單克隆抗體)製劑的配方設計師而言 是極為重要的發現。
然而，如果事先(a pr':ori)已知在期望的濃度下需要蛋白質溶液，則不 必須製備蛋白質溶液的相圖以實施本文所述的方法。例如，當配方設計師 以某濃度在緩衝液/溶液中配製蛋白質並發現配製的溶液在期望的溫度下 經歷液-液相分離或是乳光時，可以使用該方法。在該情況下，配方設計師 能夠測定已經歷了液-液相分離的蛋白質溶液的上部和/或下部相的濃度。 為了獲得在期望的溫度下不顯示相分離的高濃度蛋白質溶液，應當選擇比 下部相(例如具有更高蛋白質濃度的相)更大的濃度。為了獲得在期望的溫 度下不顯示液-液相分離的低濃度蛋白質溶液，應當選擇比上部相更低的濃 度。如果僅對配製高濃度蛋白質溶液感興趣，測量經歷過液-液相分離的蛋 白質溶液下層的濃度就足夠了。如果以高於下層濃度的濃度配製蛋白質溶 液在發生相分離的溫度下使用，則得到的蛋白質製劑在期望的溫度下顯示 減少的液-液相分離或無液-液相分離，並會是基本澄清的。在某些實施方 案中，蛋白質濃度被選擇為比下部相中蛋白質的濃度高約0.5%到約5%、 約5%到約10%、約10%到約20%、約20%到約30%、約30%到約40%、 約5%到約20%、約5%到約30%或約5%到約40%。
另一方面，方法涉及通過構建相圖測定在蛋白質溶液中配製蛋白質的 濃度。相圖可以通過任何方法製備，包括但不僅限於溫度猝熄法和濁點法。
如果使用溫度猝熄法構建相圖，則使用具有相同的蛋白質濃度並在兩 個不同的溫度下經歷相分離的至少兩種蛋白質溶液。在一些實施方案中， 使用具有相同蛋白質濃度並在三個不同溫度下經歷相分離的至少三種蛋白 質溶液。在其他實施方案中，使用具有相同蛋白質濃度並在四個不同溫度 下經歷相分離的至少四種蛋白質溶液。還在其他實施方案中，使用具有相 同蛋白質濃度並在五個不同溫度下經歷相分離的至少五種蛋白質溶液。可
使用上述溫度猝熄法的任何變型構建蛋白質溶液的相圖。
如果使用濁點法構建相圖，則使用具有相同蛋白質的不同蛋白質濃度的至少兩種蛋白質溶液。在一些實施方案中，使用具有相同蛋白質的不同 蛋白質濃度的至少三種蛋白質溶液。在其他實施方案中，使用具有相同蛋 白質的不同蛋白質濃度的至少四種蛋白質溶液。還在其他實施方案中，使 用具有相同蛋白質的不同蛋白質濃度的至少五種蛋白質溶液。
與使用的方法無關，相圖會允許配方設計師選擇蛋白質濃度，在所述 蛋白質濃度下蛋白質溶液在期望的溫度或溫度範圍下顯示出液-液相分離 的可能性降低。明確地，配方設計師會尋找要使用、儲存、加工和/或製造 製劑的溫度或溫度範圍，並基於該溫度選擇處於在該溫度下相圖以外的濃 度。在某些實施方案中，蛋白質濃度被選擇為比相分離曲線上對應於期望
溫度的最高蛋白質濃度(即上部相界限濃度)高約0.5%到約5%、約5%到 約10%、約10%到約20%、約20°/。到約30%、約30%到約40%、約5% 到約20%、約5%到約30%,或約5%到約40%。通過對給定的蛋白質溶 液針對若干不同的目的溫度選擇處於相圖以外的濃度，可以在緩沖液/溶液 中配製蛋白質，所述緩衝液/溶液針對該溫度範圍不顯示液-液相分離。當 給定的蛋白質溶液需要在不同的溫度下被儲存、使用、加工或製造時，這 尤其有用。
配製具有減少的乳光的蛋白質溶液的方法
本文所述的方法可用於以高濃度配製蛋白質，其中得到的蛋白質溶液 顯示減少的乳光或無乳光。在一個特定的實施方案中，該方法適用於下述 情況蛋白質必須在特定的緩衝液/溶液中配製且其中在特定的濃度和期望 的溫度下，蛋白質在該緩衝液/溶液中顯示液-液相分離。在另一特定的實 施方案中，本申請的方法適用於下述情況其中必須將蛋白質從一種緩沖 液/溶液中再配製進另一緩衝液/溶液中，且其中當蛋白質被配製在新的緩沖 液/溶液中時顯示液-液相分離。在這類情況下，使用從顯示液-液相分離的 蛋白質溶液的相圖鑑定的濃度，可以在緩沖液/溶液中配製蛋白質從而蛋白 質溶液在期望的溫度下不顯示液-液相分離。
為了以高濃度在緩沖液/溶液中配製在固定溫度下使用的蛋白質，蛋白
19質濃度在期望的溫度下處於蛋白質溶液相分離曲線以外或超過該曲線是足 夠的。可以以比期望的溫度下曲線上最高的濃度更高的任何濃度配製蛋白 質。
一般地，以下述濃度配製蛋白質，所述濃度比相分離曲線上對應於期
望溫度的最高蛋白質濃度(即上部相界限濃度)高約0.5%到約5%、約5% 到約10%、約10%到約20%、約20%到約30%、約30%到約40%、約 5%到約20%、約5%到約30%、或約5%到約40%之間。
如果隨著蛋白質製劑中蛋白質濃度提高，蛋白質溶液開始成為粘性的 或顯示聚集的徵兆，則可以使用降低粘度和/或減少聚集的任何方法降低蛋 白質溶液的粘度和/或聚集(例如美國臨時申請號60/752,660和60/784,130, 均併入本文作為參考)。在一些實施方案中，為了降低高濃度蛋白質溶液的 粘度，可向蛋白質製劑中添加約0.5 mM到25 mM之間(例如0.5 mM到約 5 mM、約2 mM到約10 mM、約5 mM到約10 mM、約10 mM到約15 mM、 約15mM到約20mM、約13 mM到約25 mM)的氯化鉤或氯化鎂。在其 他實施方案中，為了減少高濃度蛋白質溶液的聚集，可以添加約lmM到 約145 mM之間(例如約lmM到約5 mM、約5 mM到約10 mM、約10 mM 到約20 mM、約20 mM到約50 mM、約50 mM到約100 mM、約100 mM 到約140mM)的甲硫氨酸。在其他的實施方案中，可向高濃度蛋白質製劑 中添加上文定義範圍內的氯化鉤/氯化鎂和甲硫氨酸二者。
質溶液中的液-液相分離，可再次使用相圖。在該情況下，應將溫度提高至 高於相圖上對應於期望濃度的最高溫度。在某些實施方案中，將溫度提高 約rC、約2。C、約3。C、約4。C、約5。C、約6。C、約7。C、約8。C、約9。C、 約10。C,比相圖上對應於期望濃度的最高溫度高約0.5。C到約5。C之間、約 0.5。C到約10。C之間，或約5。C到約10。C之間。
本發明還涉及從顯示液-液相分離的蛋白質溶液獲得不顯示或顯示減 少的液-液相分離的蛋白質溶液的方法。該方法一般涉及促進顯示液-液相 分離的蛋白質溶液的液-液相分離，並分離蛋白質溶液的下部相。可通過例 如重力分離或離心促進液-液相分離。可以通過本領域已知的任何方法將下部相與上部相分離，包括使用巴斯德吸管。蛋白質溶液的下部相是不顯示或顯示與原始蛋白質溶液相比減少的液-液相分離的蛋白質溶液。
濃縮蛋白質的方法
本申請還涉及濃縮蛋白質的方法。在一個實施方案中，提供了從顯示液-液相分離的較低濃度蛋白質溶液獲得較高濃度蛋白質溶液的方法。該方法涉及促進原始蛋白質溶液的液-液相分離並將上部相與下部相分離。下部相是具有比原始的較低濃度蛋白質溶液更高的蛋白質濃度的蛋白質溶液。
可調整該方法從而將蛋白質從較低濃度蛋白質溶液濃縮至全新的緩衝液/溶液中。該方法包括上述步驟，但是還包括將蛋白質轉移至新緩沖液/溶液的緩沖液交換步驟。進行緩沖液交換的方法可以使用本領域已知的任何方法進行，包括但不僅限於基於膜的方法，如透析、超濾和滲濾。
如果在濃縮後，蛋白質溶液開始成為粘性的或顯示聚集的徵兆，則可以使用降低粘度和/或減少聚集的任何方法降低蛋白質溶液的粘度和/或聚
集(例如美國臨時申請號60/752,660和60/784,130)。在一些實施方案中，為了降低高濃度蛋白質溶液的粘度，可向蛋白質製劑中添加約0.5 mM到25mM之間(例如0.5 mM到約5 mM、約2 mM到約10 mM、約5 mM到約10mM、約10mM到約15mM、約15mM到約20mM、約13mM到約25mM)的氯化鈣或氯化鎂。在其他實施方案中，為了減少高濃度蛋白質溶液的聚集，可以添加約1 mM到約145 mM之間(例如約lmM到約5 mM、約5 mM到約10 mM、約10 mM到約20 mM、約20 mM到約50 mM、約50 mM到約100 mM、約100 mM到約140 mM)的甲硫氨酸。在其他的實施方案中，可向高濃度蛋白質製劑中添加上文定義範圍內的氯化鈣/氯化鎂和甲硫氨酸二者。測量粘度和聚集的方法是本領域技術人員公知的。純化蛋白質的方法
也可以利用液-液相分離將期望的蛋白質從其他蛋白質的混合物中純化出來。這類純化基於以目的蛋白質為基礎對相分離條件的仔細選擇。如果選擇的相分離條件(例如pH、離子強度)對目的蛋白質是獨特的，但對蛋
21白質要從中純化的蛋白質混合物的剩餘部分不是獨特的，則在選定的相分離條件下只有目的蛋白質會相分離，並可以將富含蛋白質的底層作為純的蛋白質溶液收集。
液-液相分離尤其適用於純化抗體或其抗原結合片段。這是因為與具有
小於7(通常遠小於7)的等電點(pl)的多數蛋白質不同，多數抗體具有約8和9之間的pl。因為這些高pl,可以使用具有接近抗體pl的pH的緩沖液將抗體與其他蛋白質相分離。藉此，抗體將以高濃度存在於在下層中，
而剩餘的蛋白質將在上層中。例如在純化抗-Al抗體的過程中，含抗-Al和來自細胞碎片和培養基的其他蛋白質的蛋白質溶液可以被緩衝液交換至pH 8.0的緩衝液中，這對抗-Al抗體而言是最優的相分離條件。在這些條件下，抗-Al會分成兩相，並可將底部高濃度層作為純化的抗-Al抗體收集。
當然，用於純化的上述步驟也可以被用於除抗體以外具有高等電點的蛋白質。
如果緩衝液條件可導致在具有約8-10的pH的緩衝液中多於一種蛋白質經歷相分離，則可能從其他蛋白質的混合物中同時純化兩種或更多的蛋白質。即使僅期望一種蛋白質，該步驟也會提供比原始蛋白質混合物更純淨的蛋白質。如上所述，可通過重力實現或通過離心促進液-液相分離。
蛋白質
本文所述的方法一般適用於任何蛋白質。本文使用的"蛋白質"包括蛋白質、肽、蛋白質片段、綴合蛋白質和含有非天然存在的胺基酸的多肽。蛋白質可得自任何來源，例如分泌的重組蛋白質、從天然來源分離的蛋白質、非分泌的重組蛋白質或合成蛋白質。在某些實施方案中，蛋白質包括但不僅限於抗體、抗原結合的抗體片段、配體結合分子、可溶的受體、配體、凝結因子、信號轉導蛋白和轉錄因子。
本文使用術語"抗體"包括多克隆抗體、單克隆抗體、具有多表位特異性的抗體組合物、雙特異性抗體、雙抗體，或其他純化的抗體製劑和重組抗體。抗體可以是例如任何同種型(IgG、 IgA、 IgE、 IgM等)的完整抗體或其片段，其與目的蛋白質結合。可以使用常規技術將抗體片段化，並篩選片段對目的抗原的結合。優選抗體片段包含完整抗體的抗原結合和/或可變區。因此，術語抗體片段包括抗體分子的蛋白水解切割的區段或重組製備的部分，其能夠選擇性結合某蛋白質。這類蛋白質水解和/或重組片段的非限制實例包括Fab、 F(ab')2、 Fab'、 Fv和單鏈抗體(scFv),其含有通過肽接頭連接的V[LI和/或V[H結構域。scFv可共價或非共價連接，形成具有兩個或更多個結合位點的抗體。
在一些實施方案中，抗體是人源化的單克隆抗體。本文使用的術語"人源化的單克隆抗體，，是來自非人來源(受體)的單克隆抗體，其已被改變為
含有存在於等同人單克隆抗體(供體)中的至少一個或多個胺基酸殘基。"完全人源化的單克隆抗體"是已被改變為含有存在於等同人單克隆抗體的抗原結合區中的所有胺基酸的單克隆抗體。人源化的抗體也可包含不存在於受體抗體或供體抗體任一個中的殘基。可進行這些修飾以進一步改進和優
化抗體功能性。人源化的抗體也可任選地包含人免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分。
在某些實施方案中，要被配製、濃縮和/或純化的蛋白質不包括溶菌酶、Y畫晶體蛋白、P—乳球蛋白、竹芋蛋白(thaumatin)、刀豆球蛋白A(concanavalinA)和過氧化氫酶。
適合在本文公開的方法中使用的蛋白質濃度包括但不僅限於，5mg/mL至)j約50 mg/mL、約50 mg/mL f'j約100 mg/mL、約100 mg/mL至'j約200 mg/mL、約200 mg/mL到約300 mg/mL，和約300 mg/mL到約500mg/mli。
實施例
本發明還通過以下的實施例闡述。實施例僅就闡述的目的提供。它們不旨在理解為以任何方式限制本發明的範圍或內容。實施例1
確定溶解度和乳光之間的關係
為了測試溶解度和乳光之間是否存在關係，研究了以90 mg/ml配製在10 mM組氨酸pH 6.0中的11種不同的單克隆抗體。測試這些抗體溶液的溶解度和乳光。如美國臨時申請號60/801,862中所述通過PEG沉澱評價溶解度。通過測量抗體溶液在500 mn的吸光度測量乳光。圖1中所示來自這些研究的數據表明，蛋白質的溶解度越低，蛋白質溶液的乳光越強。
因此，在高蛋白質濃度下，溶解度和乳光之間存在反相關。
實施例2液-液相分離
於5。C下以70 mg/ml在10 mM Tris pH 8.0中配製抗-Al單克隆抗體。該蛋白質溶液的pH接近該抗體的pl。當混合蛋白質溶液時其外觀混濁；然而，當允許蛋白質溶液沉降時發生液-液相分離，得到上部和下部相(見圖2，上圖)。
於5'C下以50 mg/ml在20 mM琥珀酸鹽pH 6.0中配製抗-Bl單克隆
抗體。當混合蛋白質溶液時溶液變得混濁；然而，當允許蛋白質溶液沉降時發生液-液相分離，得到上部和下部相(見圖2，下圖)。
當於5"C下以90 mg/ml在10 mM Tris pH 9.0中配製的抗-Cl抗體被混合併允許沉降時，觀察到類似的液-液相分離現象(數據未顯示)。
因此，在高濃度的若干種蛋白質中觀察到液-液相分離。pH、離子強度和溶解度特性可有助於觀察到的相分離。如在該實施例中看到的，顯示液-液相分離的蛋白質溶液是乳光的。
實施例3
通過溫度摔熄法構建抗-Al蛋白質溶液的相圖
將抗-Al單克隆抗體的五個樣品(其各以70 mg/ml在10 mM Tris pH8.0中配製)分別從室溫冷卻至16。C、 15°C、 10°C、 5'C和0。C，並允許經歷宏觀的重力驅動的分離，直到通過重力沉降實現兩個澄清的液體層。從各
樣品中分離來自上層和下層的等分試樣，並使用UV-vis光譜法(280 nm)測量各層的濃度。針對蛋白質溶液的溫度繪製上層和下層的濃度，得到相圖(見圖4)。
將抗-Al蛋白質溶液冷卻至低於該緩沖液中的臨界溫度時，其經歷液-液相分離。在曲線下的區域發生液-液相分離，並且高密度相的沉降導致宏觀分離成為兩個透明層，高蛋白質濃度相在底部，低蛋白質濃度相在頂部。在給定溫度下，具有不同蛋白質濃度的兩個液相平衡共存。
實施例4
通過濁點法構建抗-Al蛋白質溶液的相圖
製備以200 mg/ml、50 mg/ml、30 mg/ml和10 mg/ml在10 mM Tris pH8.0中配製的四個抗-Al抗體樣品。將這四種溶液於30。C下置於光散射分光光度計中。在該溫度下，所有這些溶液是澄清的。緩慢冷卻這些溶液時，
在各溶液中在具體的溫度(T;M)下開始相分離。該現象的標誌是由於入射束
的廣泛多重散射引起的透射束的消失。在該T法點溫度以下，溶液成為不透明的。對於各溶液而言，針對蛋白質溶液的濃度繪製濁點溫度，得到蛋白質溶液的相圖。
值得注意的是構建相圖的溫度猝熄法(實施例3)和濁點法顯示給出基本類似的結果。
實施例5
使用相圖預測乳光
為了測定相圖是否可用於確定給定的蛋白質溶液是乳光的(即混濁的)或是澄清的，以不同的濃度在10 mM Tris pH 8.0中製備四種不同的抗-Al蛋白質溶液樣品(即創建相圖的實驗中所使用的相同蛋白質和緩沖液)，所述不同的濃度落入該相圖的不同區域(即相分離曲線以外或之外)。
如圖5中所示，相圖與乳光的發生良好相關。在相分離曲線以外，蛋
25白質溶液是澄清的並保留在單相中，但是在相分離曲線下，蛋白質溶液成
為混濁並在重力分離後分離成為兩層。相圖證明了在10。C的固定溫度下，當濃度達到高於18 mg/ml時抗-Al溶液開始成為不透明的，但是當濃度繼續提高至高於180 mg/ml時出乎意料地澄清。
因此，對由於液-液相分離而具有乳光趨勢的蛋白質溶液而言，只要濃度超出相分離曲線，則在某溫度下可達成高蛋白質濃度下的澄清溶液。
實施例6
分析液-液相分離的上部和下部相的特性
允許以59 mg/ml配製在10 mM Tris pH 8.0中的抗-Al經歷液-液相分離，分離來自上部和下部相的等分試樣並用於分析以下的特性兩相中蛋白質的(i)緩衝液組份，(ii)高分子量種類，(iii)酸性種類，(iv)二級結構，和(v)三級結構。
緩衝液組份的分析表明兩相中Tris和氯離子的濃度是基本同一的(見圖7)。
通過尺寸排除高效液相層析進行的高分子量種類的分析指出上部和下部相中沒有顯著差異(見圖8，上圖)。
類似地，在兩相中通過陽離子交換高效液相層析進行的酸性種類分析顯示無顯著差異(見圖8，下圖)。
通過FTIP醯胺I譜表徵的來自兩相的抗-Al的二級結構基本上相似(見圖9)。
最後，通過螢光使用45。角比色杯表徵的來自兩相的抗-Al的三級結構也顯示無顯著差異(見圖10)。
總之，這些數據提示經歷液-液相分離的蛋白質溶液的上部和下部相是基本相似的。因此，蛋白質二級或三級結構、理化特性或賦形劑含量的差
異很可能不是液-液相分離的根本原因。其他實施方案應當理解儘管本發明已結合其詳述被描述，但是前文描述旨在說明而 非限制本發明的範圍，所述範圍由附帶的權利要求定義。其他方面、優點 和變更在以下權利要求書的範圍內。
權利要求
1. 確定濃度的方法，在該濃度下再配製在顯示液-液相分離的蛋白質溶液中的蛋白質以便減少或防止在期望的溫度下該蛋白質溶液的液-液相分離，該方法包括(a)允許顯示液-液相分離的蛋白質溶液經歷液-液相分離成為上部和下部液相；(b)測量已經歷了液-液相分離的蛋白質溶液中上部和下部相中蛋白質的濃度；和(c)選擇大於下部相蛋白質濃度的蛋白質濃度用於再配製蛋白質，以便減少或防止在所述期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相分離。
2. 確定蛋白質濃度的方法，在該濃度下再配製在顯示液-液相分離的蛋 白質溶液中的蛋白質以便減少或防止在期望的溫度下該蛋白質溶液的液-液相分離，該方法包括(a) 構建蛋白質溶液的相分離曲線；和(b) 選擇在期望的溫度下處於相分離曲線外的濃度， 其中在期望的溫度下處於相分離曲線外的濃度是下述濃度，在該濃度下再配製蛋白質溶液中的蛋白質以便減少或防止在所述期望的溫度下蛋白 質溶液中的液-液相分離。
3. 權利要求2的方法，其中通過溫度摔熄方法或濁點方法構建相分離 曲線。
4. 權利要求2的方法，其中構建蛋白質溶液的相分離曲線包括繪製 在蛋白質溶液顯示液-液相分離的至少兩個或更多不同溫度下蛋白質溶液 的兩個處於平衡中的共存液相的濃度，其中所述兩個或更多不同溫度的至 少一個是期望的溫度。
5. 確定濃度的方法，以所述濃度在蛋白質溶液中配製蛋白質以減少或 防止期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相分離，所述方法包括(a)提供具有一種蛋白質濃度和第一溫度的第一蛋白質溶液，在所述第一溫度下第一蛋白質溶液顯示液-液相分離；(b) 提供處於第一蛋白質溶液濃度和第二溫度的第二蛋白質溶液，在 所述第二溫度下第二蛋白質溶液顯示液-液相分離；(c) 允許來自(a)和(b)的蛋白質溶液經歷液-液相分離成為上部和下部相；(d) 測量笫一和第二蛋白質溶液的上部和下部相中蛋白質的濃度；(e) 構建相分離曲線，所述曲線指出在第一和第二溫度下第一和第二 蛋白質溶液處於平衡中的上部和下部相的濃度；和(f) 確定在期望的溫度下處於相分離曲線外的濃度， 其中在期望溫度下處於相分離曲線外的濃度是在蛋白質溶液中配製蛋白質從而減少或防止所述期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相分離的濃 度。
6. 權利要求5的方法，其還包括(a) 提供處於笫一蛋白質溶液濃度和第三溫度下的第三蛋白質溶液， 在所述第三溫度下第二蛋白質溶液顯示液-液相分離；(b) 允許第一、第二和第三蛋白質溶液經歷液-液相分離成為上部和下 部相；(c) 測量第一、第二和第三蛋白質溶液的上部和下部相中蛋白質的濃度；(d) 構建相分離曲線，所述曲線指出在第一、第二和第三溫度下第一、第二和第三蛋白質溶液處於平衡中的上部和下部相的濃度；和(e) 確定在期望的溫度下處於相分離曲線外的濃度， 其中在期望溫度下處於相分離曲線外的濃度是在蛋白質溶液中配製蛋白質從而減少或防止期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相分離的濃度。
7. 確定濃度的方法，以所述濃度在蛋白質溶液中配製蛋白質以減少或 防止期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相分離，所述方法包括(a) 以第一種濃度在第一蛋白質溶液中提供蛋白質；(b) 以第二種濃度在第二蛋白質溶液中提供蛋白質；(c) 以第三種濃度在第三蛋白質溶液中提供蛋白質；其中第一、第二和笫三蛋白質溶液處於第一、第二和第三溶液基本澄 清的溫度下；(d) 將第一、第二和第三溶液冷卻至第一、第二和第三溶液的濁點溫 度；和(e) 通過針對第一、第二和第三種濃度繪製第一、第二和第三蛋白質 溶液的濁點溫度來構建相分離曲線，其中在期望溫度下處於相分離曲線外的濃度是在蛋白質溶液中配製蛋 白質從而減少或防止在所述期望的溫度下蛋白質溶液中的液-液相分離的 濃度。
8. 權利要求l-7中任一項的方法，其中所述蛋白質選自受體、配體、 轉錄因子、酶和抗體。
9. 權利要求l-7中任一項的方法，其中所述蛋白質是多克隆抗體或其 抗原結合片段。
10. 權利要求9的方法，其中所述蛋白質是單克隆抗體或其抗原結合 片段。
11. 權利要求1-7中任一項的方法，其中所述期望的溫度是待加工、制 造、儲存或施用蛋白質溶液的溫度。
12. 權利要求1-7中任一項的方法，其中再配製蛋白質溶液中蛋白質的 蛋白質濃度被選擇為比下部相中蛋白質濃度高約5%到約40%。
13. 權利要求1-7中任一項的方法，其中通過重力分離或離心實現液-液相分離。
14. 在蛋白質溶液中配製蛋白質使得該蛋白質溶液在期望的溫度下不 顯示液-液相分離的方法，其包括以下述濃度在蛋白質溶液中配製蛋白質， 所述濃度在期望的溫度下處於該蛋白質溶液的相分離曲線外。
15. 在蛋白質溶液中配製蛋白質使得該蛋白質溶液在期望的濃度下不 顯示液-液相分離的方法，其包括在如下溫度下儲存蛋白質溶液，所述溫度 高於發生液-液相分離的溫度並且在期望的蛋白質濃度下處於蛋白質溶液的相分離曲線外。
16. 用於再配製蛋白質溶液中蛋白質的方法，所述蛋白質溶液在期望 的溫度下顯示液-液相分離，所述方法使得再配製的蛋白質溶液在期望的溫 度下不顯示液-液相分離或顯示減少的液-液相分離，所述方法包括(a) 使得顯示液-液相分離的蛋白質溶液經歷液-液相分離成為上部和 下部液相；(b) 測量蛋白質溶液的上部和下部相的濃度；和(c) 以高於蛋白質溶液下部相濃度的濃度再配製蛋白質。
17. —種方法，所述方法用於從在期望的溫度下顯示液-液相分離的蛋 白質溶液獲得在所述期望的溫度下不顯示液-液相分離或顯示減少的液-液 相分離的蛋白質溶液，該方法包括(a) 允許在期望的溫度下顯示液-液相分離的蛋白質溶液經歷分離成為 上部和下部相；和(b) 取出蛋白質溶液的下部相；其中下部相是在期望的溫度下不顯示液-液相分離或顯示減少的液-液相分離的蛋白質溶液。
18. —種方法，所述方法用於從顯示液-液相分離的較低濃度蛋白質溶 液獲得較高濃度蛋白質溶液，該方法包括(a)允許原始的蛋白質溶液分離成為上部和下部相；和 Ob)將上部相與下部相分離，其中下部相是具有比所述較低濃度蛋白質溶液更高的蛋白質濃度的蛋 白質溶液。
19. 在期望的溶液中濃縮蛋白質的方法，其包括(a) 在任何溶液中配製蛋白質，其中蛋白質溶液顯示液-液相分離；(b) 促進蛋白質溶液中液-液相分離，從而形成上部和下部相；(c) 將上部相與下部相分離，其中下部相具有比原始蛋白質溶液更高 的蛋白質濃度，和(d) 進行緩衝液交換以將蛋白質從高濃縮蛋白質溶液轉移至期望的溶液中。
20. 權利要求18或19的方法，其還包括向下部相中添加約0.5 mM到 約25 mM之間的氯化鉤。
21. 權利要求18或19的方法，其還包括向下部相添加約l mM到約 145 mM之間的曱硫氨酸。
22. 權利要求18或19的方法，其還包括向下部相中添加約0.5 mM到 約25 mM之間的氯化鉀或氯化鎂，和約1 mM到約145 mM之間的曱石危氨 酸。
全文摘要
本發明描述了在蛋白質溶液中以高濃度配製蛋白質的方法，其中該蛋白質溶液缺乏或具有減少的液-液相分離。這類蛋白質溶液是基本澄清和基本均勻的。另外，提供了使用液-液相分離濃縮和純化蛋白質的方法。
文檔編號B01D37/00GK101489640SQ200780026178
公開日2009年7月22日 申請日期2007年6月12日 優先權日2006年6月12日
發明者A·坎託爾, N·W·沃恩, 黎 李 申請人:惠氏公司