一種黃芩藥材的uplc-ms指紋圖譜測定方法

2023-09-22 21:34:30

專利名稱：一種黃芩藥材的uplc-ms指紋圖譜測定方法
技術領域：
本發明涉及中藥指紋圖譜的測定方法，具體地說是黃芩藥材超高效液相色譜-質譜聯用指紋圖譜的構建及其標準指紋圖譜。屬於藥物分析技術領域。
背景技術：
中藥指紋圖譜是採用現代分析技術建立的能夠反映中藥材或中成藥的某類或幾類成分的色譜或光譜信息的圖譜，能較全面地反映中藥的整體化學特徵，體現其內在的整體質量，可彌補僅用少數成分來控制中藥質量的弊端，已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質量的有效手段。然而，中藥化學成分的多樣性和複雜性以及藥效物質基礎的不確定性，增加了中藥指紋圖譜建立的難度以及指紋圖譜的有效性和重現性。目前，中藥指紋圖譜研究比較多的是中藥化學指紋圖譜，是指採用色譜、波譜和其他分析方法建立的用以表徵中藥化學成分特徵的指紋圖譜。高效液相色譜(HPLC)具有分離效能高、分析速度快、重現性好的特點，以及可配備不同的檢測器來分析各種類型樣品的優勢，已成為公認的建立中藥指紋圖譜的主導方法。近年來興起的超高效液相色譜技術 (UPLC)藉助於HPLC的理論及原理，採用1. 7 μ m粒徑的色譜柱填料，使一次指紋圖譜的分析時間由原來的至少1小時縮短為10分鐘左右，並且色譜峰容量和穩定也顯著提高，尤其適合於中藥及天然產物的研究，為中藥指紋圖譜研究提供了新的分離平臺。紫外(UV)檢測器是目前與液相色譜聯用進行指紋圖譜研究應用最廣泛的檢測方法。然而化學成分的紫外吸光度具有加和性，當中藥的複雜化學成分沒有獲得良好分離時， 所檢測的響應值是多成分吸光度的加和，從而使測定結果產生偏差，不能真實反映中藥化學成分的含量。而且紫外檢測法只適合具有紫外吸收的中藥化學成分，對於無紫外吸收或吸收較弱的成分，難以進行有效的檢測。質譜(MQ檢測器可用於中藥中各種化合物的檢測，均可產生較好的響應，是一種高靈敏度的通用型檢測器，更重要的是能提供化合物的分子量和分子結構信息(串聯質譜)。採用質譜檢測器，通過確定離子的質量掃描範圍，可以使其包含所有目標化合物的信息。應用總離子流檢測模式，可以綜合化合物的全部信息；進而，通過考查共有色譜峰的質譜信息，可以確定色譜峰的組成情況，保證色譜峰為單一化合物組成，具有較好的科學性。由於中藥化學成分的複雜性，保證中藥指紋圖譜中的色譜峰為單一化合物峰是很難的，這也幾乎是不可能的，而採用質譜檢測器，可以從總離子流色譜圖 (TIC)中提取特定m/z的離子，建立提取離子色譜圖(EIC)，從而保證了色譜峰為單一化合物組成。另外，通過對共有峰進行質譜定性，建立共有峰的提取離子色譜圖，進而通過色譜峰與化合物m/z的一一對應關係，實現對各共有峰的準確定位和測量，從而可彌補其它方法實驗室之間的重現性差的缺點。UPLC-MS結合了最優良的色譜分離能力和最靈敏、最智能的檢測能力，在中藥化學指紋圖譜研究中極具發展前景和空間，優勢突出，特點明顯，必將成為中藥指紋圖譜的發展趨勢和方向。黃芩是一味常用中藥，為唇形科植物黃芩kutellaria baicalensis Georgi的
3乾燥根，具有清熱燥溼、瀉火解毒、止血、安胎的功效。黃芩主要含有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分，《中國藥典》「黃芩」和「黃芩提取物」項下僅對其所含的黃芩苷進行了含量測定和控制，難以有效控制黃芩藥材及其提取物的整體質量。在《中國藥典》的基礎上，有專利進一步測定了黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷的含量(專利申請號 200510029014. 7)，另有採用HPLC-UV指紋圖譜和多成分含量測定的方法控制黃芩質量(專利申請號200510031453. 1)。但是仍沒有利用UPLC-MS進行黃芩質量控制的報導。本發明在黃芩血清藥物化學研究的基礎上，選擇能夠被吸收入血的成分作為指紋圖譜測定指標， 並經10個產地黃芩指紋圖譜的測定，確定共有指紋峰及其變化範圍，作為黃芩質量控制的方法。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺點和不足，提供一種利用UPLC-MS進行黃芩藥材質量控制的方法，以及由此方法所得到的黃芩藥材標準指紋圖譜。為實現此目的，本發明通過黃芩血清藥物化學研究闡明黃芩的入血成分，以黃芩入血成分作為檢測指標，並利用UPLC-MS技術進行構建黃芩藥材化學指紋圖譜，用於黃芩的質量控制。本發明的黃芩藥材UPLC-MS指紋圖譜的測定方法包括如下步驟(1)供試品溶液的製備稱取黃芩藥材粉末適量，精密稱定，置於錐形瓶中，用 70%甲醇20mL超聲提取10 45分鐘，放至室溫，過濾，濾液置於50mL容量瓶中；殘渣再用甲醇20mL超聲提取10 45分鐘，放至室溫，過濾，殘渣用少量甲醇洗滌，濾液併入50mL容量瓶中，定容，搖勻，13000rpm離心15分鐘，吸取上清液，作為供試品溶液；(2)測定條件色譜分離柱為ACQUITY UPLC 系列柱；流動相為0. 1 %甲酸乙腈-0. 甲酸水，採用梯度洗脫方式；流速0. 3 0. 5mL/min ；柱溫40-45°C ；進樣量為 1 5μ L。質譜掃描方式正離子全掃描檢測模式；掃描質量範圍100-1000mDa ；(3)測定方法吸取供試品溶液，注入UPLC-MS聯用儀，測定，記錄18分鐘的色譜圖。設定各共有峰的質核比(m/z)，建立各峰的提取離子色譜圖，以黃芩苷峰面積為1，計算各峰面積的相對比值，進行相似度評價。其中，所述的供試品取樣量為0. 10-0. 50g，超聲提取時間30-45分鐘。其中，所述的色譜柱為ACQUITY UPLC HSST3柱，流速0. 4mL/min,柱溫40°C，進樣量2 μ L ；或所述的色譜柱為ACQUITY UPLC C18柱，流速0. 3mL/min,柱溫45°C，進樣量 5 μ L0其中，所述提取離子色譜圖的建立根據各峰分子離子的質核比從總離子流色譜圖中提取獲得，23個共有峰的質核比(m/z)分別為峰1，m/z 305 ；峰2，m/z 549 ；峰3，m/ ζ 463;峰 4，m/z 549;峰 5，m/z 549;峰 6，m/z 477;峰 7，m/z 347;峰 8，m/z 447;峰 9，m/ ζ 447 ；峰 10，m/z 477 ；峰 11，m/z 431 ；峰 12，m/z 461 ；峰 13，m/z 477 ；峰 14，m/z 447 ； 峰 15，m/z 461 ；峰 16，m/z491 ；峰 17，m/z 271 ；峰 18，m/z 271 ；峰 19，m/z 285 ；峰 20，m/z 315;峰 21，m/z 375;峰 22，m/z 285;峰 23，m/z 315 ；其中峰 8 為黃芩苷。其中，所述共有峰的分子式表徵應用飛行時間質譜測定了標準指紋圖譜中各峰的精確質量，計算各峰的分子式分別如下峰1，C15H12O7 ；峰2，C26H28O13 ；峰3，C21H18O12 ；峰 4，C26H28O13 ；峰 5，C26H28O13 ；峰 6，C22H20O12 ；峰 7，C17H14O8 ；峰 8，C21H18O11 ；峰 9，C21H18O11 ；峰 10，C22H20O12 ；峰 11，C21H18O10 ；峰 12，C22H20O11 ；峰 13，C22H20O12 ；峰 14，C21H18O11 ；峰 15，C22H20O11 ；峰 16，C23H22O12 ；峰 17，C15H10O5 ；峰 18，C15HltlO5 ；峰 19，C16H12O5 ；峰 20，C17H14O6 ；峰 21，C19H18O8 ；峰 22，C16H12O5 ；峰 23，C17H14O6。本發明還提供黃芩藥材的質量控制方法，是將來源於10個以上產地的符合《中國藥典》規定的黃芩藥材按上述的測定方法記錄指紋圖譜，採用平均數方法生產標準指紋圖譜，將待測樣品指紋圖譜與標準指紋圖譜進行比對，相似度大於0. 9，認為所述待測產品的
質量合格。本發明利用指紋圖譜從整體上表徵黃芩藥材的化學成分，並通過血清藥物化學方法證明該指紋圖譜中的23個共有峰均為被吸收入血的成分，是黃芩發揮藥效的潛在有效成分。通過比較共有峰可以找出不同藥材之間的細微差異，適於黃芩藥材真偽、產地和品質的鑑別和質量控制。與現有技術相比，本發明具有以下優點(1)本發明在國內首次採用UPLC-MS作為分析手段，建立黃芩化學指紋圖譜質量控制方法，與現有報導的HPLC-UV分析方法相比，不僅大大縮短了分析時間，提高了分離效率和檢測靈敏度。而且能給各峰賦予分子量的信息，通過建立提取離子色譜圖，可準確計算各峰的峰面積，並在實驗室間重現時若保留時間發生偏離，可通過各峰的分子量信息進行準確定位，從而保證了指紋圖譜檢測方法的可複製性。(2)中藥血清藥物化學研究表明，中藥(外用和作用於腸道的中藥除外)口服給藥後，其有效成分只有被吸收入血後才能發揮藥理作用。中藥的功效是多成分、多靶點協同作用的結果，其入血成分均有可能對其藥效有所貢獻，因此以入血成分作為指紋圖譜檢測的指標成分，更能夠保證中藥的有效性。本發明經過黃芩血清藥物化學的研究，證明該指紋圖譜中的23個共有峰均為被吸收入血的成分，以此作為黃芩藥材指紋圖譜測定的指標成分， 建立的化學指紋圖譜更具有效性。


圖1為10個產地黃芩藥材的UPLC-MS提取離子色譜圖，圖中標記了 23個共有峰。圖2為黃芩藥材和大鼠含藥血清UPLC-MS提取離子色譜圖，其中(A)大鼠含藥血清；(B)黃芩藥材；各峰標記了保留時間和質核比。圖3為黃芩藥材指紋圖譜精密度考察的UPLC-MS提取離子色譜圖。圖4為黃芩藥材指紋圖譜穩定性考察的UPLC-MS提取離子色譜圖。圖5為黃芩藥材指紋圖譜重複性考察的UPLC-MS提取離子色譜圖。圖6為黃芩藥材UPLC-MS色譜圖及各共有峰的提取離子色譜圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。以下實施例僅用於說明本發明而不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動和修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。同時為了簡單和清除的目的，下文恰當地省略了公知技術的描述，以免那些不必要的細節影響對本技術方案的描述。
實施例1黃芩藥材UPLC-MS指紋圖譜的測定方法。1.儀器與試藥液相色譜儀為美國Waters公司Acquity UPLC系統，包括二元高壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極體陣列檢測器。質譜儀為美國Waters公司LCT PremierXE系統，包括電噴霧離子源、Lock-spray在線校正系統、注射器針泵。工作站為Masslynx V4. 1。乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。黃芩苷對照品，購自中國藥品生物製品檢定所。藥材購自哈爾濱三棵樹藥材市場， 產地分別為黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西、陝西、內蒙古、安徽、甘肅，共10批樣品，其中黑龍江產地2批。按2010年版《中國藥典》檢驗均符合規定。2.供試品溶液的製備稱取黃芩藥材粉末0. 10g，精密稱定，置於錐形瓶中，用70%甲醇20mL超聲提取30 分鐘，放至室溫，過濾，濾液置於50mL容量瓶中；殘渣再用甲醇20mL超聲提取30分鐘，放至室溫，過濾，殘渣用少量甲醇洗滌，濾液併入50mL容量瓶中，定容，搖勻，13000rpm離心15分鐘，吸取上清液，作為供試品溶液。3.指紋圖譜檢測條件色譜條件色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 tt (2. 1 X 100mm, 1. 8 μ m)；流動相為 0. 甲酸乙腈(A) -0. 甲酸水(B)，梯度洗脫(0min,16% A ；3min,20% A ；llmin,24% A ； 13min,38% A ； 18min,40% A ；20min, 100% Α)；流速:0. 4mL/min ；柱溫:40°C ；進樣量為 2 μ L0質譜條件電噴霧電離源，正離子掃描模式，毛細管電壓1800V，錐孔電壓60V， 脫溶劑氣溫度350°C，源溫度110°C，脫溶劑氣體流速700L/h，錐孔氣體流速20L/h，亮氨酸-腦啡汰溶液在線校正，掃描質量範圍為lOO-lOOOmDa，掃描方式為全掃描。4.指紋圖譜的建立與評價(1)共有峰的確定收集10個產地的黃芩藥材，按「供試品溶液的製備」項下方法操作，在上述檢測條件下進行分析。從檢測結果看，有23個峰是各批供試品共有的，因此將這23個峰作為黃芩藥材的共有指紋峰，從總離子流色譜圖中獲取這23個峰的提取離子色譜圖，見圖1。其中黃芩苷的峰面積最大，選為參照峰，不同產地黃芩藥材指紋圖譜共有峰的相對峰面積見表1。飛行時間質譜為高分辨質譜，能夠測定離子的精確質量，進而根據測量偏差小於 5PPM和同位素擬合度最小的原則計算各共有峰的分子式，見表2。(2)黃芩入血成分的確定取Wistar大鼠Q20 士 20g)，禁食12h，口服給予黃芩水煎液，給藥後Ih用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，經肝門靜脈採血，6000rpm離心lOmin，取血清lmL，使通過預先用 2mL甲醇活化、2mL水平衡後的OASIS HLB固相萃取柱，用2mL水衝洗，棄去，再用2mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，於40°C水浴中氮氣流下吹乾，用150yL甲醇復溶，13000rpm離心 15min，吸取上清液5 μ L，按擬定的色譜條件檢測，獲得^個峰質核比的提取離子色譜圖， 見圖2。取黃芩供試品溶液，按擬定的色譜條件檢測，獲取23個峰質核比的提取離子色譜圖，見圖2。比較黃芩藥材及其含藥血清的UPLC-MS色譜圖，結果上述指紋圖譜中確定的23個共有峰在含藥血清中均存在，表明這23個共有峰均能被吸收入血。(3)指紋圖譜相似度評價將10個產地的黃芩藥材指紋圖譜測定數據用平均數的方法生成指紋圖譜共有模式，並以此共有模式為黃芩藥材的標準指紋圖譜，應用相關係數法和夾角餘弦法對各產地黃芩藥材的指紋圖譜進行相似度評價，結果各藥材相似度均大於0. 9，見表1。說明建立的黃芩藥材指紋圖譜質控方法能夠運用於實際生產中治療量控制，滿足藥材鑑別和質量控制的需求。5.指紋圖譜的方法學考察為了考察分析方法的可靠性，對指紋圖譜檢測方法的精密度、穩定性、重現性進行考察，結果證明精密度、穩定性和重現性良好，能滿足指紋圖譜的要求。(1)精密度試驗取同一份供試品溶液，按擬定的檢測條件進行檢測，重複進樣5次，記錄各色譜峰的峰面積。以黃芩苷峰面積為參照，計算各色譜峰相對峰面積的一致性，結果相對峰面積的RSD值均低於3%，用相似度計算，將所得的指紋圖譜與共有模式進行相似度評價，相似度均大於0. 99。見圖3。(2)穩定性試驗取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h按擬定的檢測條件進行檢測，記錄各色譜峰的峰面積。以黃芩苷峰面積為參照，計算各色譜峰相對峰面積的一致性，結果相對峰面積的RSD值均低於3%，用相似度計算，將所得的指紋圖譜與共有模式進行相似度評價，相似度均大於0. 99。結果表明，黃芩藥材供試品溶液在M小時內穩定。見圖4。(3)重複性試驗取同一批號的供試品5份，按供試品溶液製備方法製備成供試品溶液，按擬定的檢測條件進行檢測，記錄各色譜峰的峰面積。以黃芩苷峰面積為參照，計算各色譜峰相對峰面積的一致性，結果相對峰面積的RSD值均低於3%，用相似度計算，將所得的指紋圖譜與共有模式進行相似度評價，相似度均大於0. 99，見圖5。實施例2黃芩藥材UPLC-MS指紋圖譜的測定。1.儀器與試藥液相色譜儀為美國Waters公司Acquity UPLC系統，包括二元高壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極體陣列檢測器。質譜儀為美國Waters公司LCT PremierXE系統，包括電噴霧離子源、Lock-spray在線校正系統、注射器針泵。工作站為Masslynx V4. 1。乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。黃芩藥材購自哈爾濱三棵樹藥材市場，產地分別為黑龍江。經檢驗符合2010年版 《中國藥典》規定。2.供試品溶液的製備 稱取黃芩藥材粉末0. 50g,精密稱定，置於錐形瓶中，用70 %甲醇20mL超聲提取45 分鐘，放至室溫，過濾，濾液置於50mL容量瓶中；殘渣再用甲醇20mL超聲提取45分鐘，放至室溫，過濾，殘渣用少量甲醇洗滌，濾液併入50mL容量瓶中，定容，搖勻，13000rpm離心15分鐘，吸取上清液，作為供試品溶液。3.指紋圖譜檢測條件色譜條件色譜柱為ACQUITY UPLC C18 tt (2. 1 X 100mm，1. 7 μ m)；流動相為 0. 甲酸乙腈(A) -0. 甲酸水(B)，梯度洗脫(0min,10% A ； 2min,28% A ；6min,32% A ；8min,38%A ；12min, 50% A ;15min, 100% Α)；流速:0. 3mL/min ；柱溫45°C ；進樣量為 5 μ L。質譜條件電噴霧電離源，正離子掃描模式，毛細管電壓1800V，錐孔電壓60V， 脫溶劑氣溫度350°C，源溫度110°C，脫溶劑氣體流速700L/h，錐孔氣體流速20L/h，亮氨酸-腦啡汰溶液在線校正，掃描質量範圍為lOO-lOOOmDa，掃描方式為全掃描。4.指紋圖譜測定取黃芩藥材，按「供試品溶液的製備」項下方法操作，在上述檢測條件下進行檢測， 獲得黃芩藥材的UPLC-MS色譜圖。根據實例1中確定的23個共有峰的分子式或分子離子 m/z，從採集的UPLC-MS色譜圖中提取這23個共有峰的色譜圖，見圖6。結果表明雖然對供試品溶液製備方法和檢測條件進行了適當改動，但仍可通過各峰代表化合物的分子離子m/ ζ值對各峰進行準確定位，進而計算峰面積，進行指紋圖譜的評價。黃芩藥材UPLC-MS色譜圖及共有峰的提取離子色譜圖。峰號與實例1中確定的共有峰峰號一致。表1. 10個產地黃芩藥材指紋圖譜的相對峰面積及相似度評價結果
權利要求
1.一種黃芩藥材UPLC-MS指紋圖譜的測定方法，包括如下步驟(1)供試品溶液的製備稱取黃芩藥材粉末適量，精密稱定，置於錐形瓶中，用70%甲醇20mL超聲提取10 45分鐘，放至室溫，過濾，濾液置於50mL容量瓶中；殘渣再用甲醇 20mL超聲提取10 45分鐘，放至室溫，過濾，殘渣用少量甲醇洗滌，濾液併入50mL容量瓶中，定容，搖勻，13000rpm離心15分鐘，吸取上清液，作為供試品溶液；(2)測定條件色譜分離柱為ACQUITYUPLC 系列柱；流動相為0. 1 %甲酸乙腈-0. 甲酸水，採用梯度洗脫方式；流速0. 3 0. 5mL/min ；柱溫40-45°C ；進樣量為 1 5μ L。質譜掃描方式正離子全掃描檢測模式；掃描質量範圍100-1000mDa ；(3)測定方法吸取供試品溶液，注入UPLC-MS聯用儀，測定，記錄18分鐘的色譜圖。設定各共有峰的質核比(m/z)，建立各峰的提取離子色譜圖，以黃芩苷峰面積為1，計算各峰面積的相對比值，進行相似度評價。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述的供試品取樣量為0.10-0. 50g，超聲提取時間30-45分鐘。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述的色譜柱為ACQUITYUPLC HSST3柱，流速 0. 4mL/min,柱溫 40°C，進樣量 2 μ L。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述的色譜柱為ACQUITYUPLC C18柱，流速 0. 3mL/min,柱溫 45°C，進樣量 5 μ L。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述的提取離子色譜圖是根據各峰分子離子的質核比從總離子流色譜圖中提取獲得的，23個共有峰的質核比(m/z)分別為峰l，m/z 305 ； 峰 2，m/z 549;峰 3，m/z 463;峰 4，m/z 549;峰 5，m/z 549;峰 6，m/z 477;峰 7，m/z 347 ； 峰 8，m/z 447 ；峰 9，m/z 447 ；峰 10，m/z 477 ；峰 11，m/z 431 ；峰 12，m/z 461 ；峰 13，m/z 477 ；峰 14，m/z 447 ；峰 15，m/z 461 ；峰 16，m/z 491 ；峰 17，m/z 271 ；峰 18，m/z 271 ；峰 19，m/z285 ；峰 20，m/z 315;峰 21，m/z 375;峰 22，m/z 沘5 ；峰 23，m/z 315;其中峰 8 為黃芩苷。
6.根據權利要求1所述的方法，其中應用飛行時間質譜測定了標準指紋圖譜中各峰的精確質量，計算各峰的分子式分別如下峰1，C15H12O7 ；峰2，C26H28O13 ；峰3，C21H18O12 ；峰4， C26H28O13 ；峰 5，C26H28O13 ；峰 6，C22H20O12 ；峰 7，C17H14O8 ；峰 8，C21H18O11 ；峰 9，C21H18O11 ；峰 10， C22H20O12 ；峰 11，C21H18O10 ；峰 12，C22H20O11 ；峰 13，C22H20O12 ；峰 14，C21H18O11 ；峰 15，C22H20O11 ；峰 16，C23H22O12 ；峰 17，C15H10O5 ；峰 18，C15HltlO5 ；峰 19，C16H12O5 ；峰 20，C17H14O6 ；峰 21，C19H18O8 ；峰 22，C16H12O5 ；峰 23，C17H14O6。
7.一種黃芩藥材的質量控制方法，是將來源於10個以上產地的符合《中國藥典》規定的黃芩藥材按權利要求1-6任一項所述的測定方法記錄指紋圖譜，採用平均數方法生產標準指紋圖譜，將待測樣品指紋圖譜與標準指紋圖譜進行比對，相似度大於0. 9，認為所述待測產品的質量合格。
全文摘要
本發明提供一種黃芩藥材UPLC-MS指紋圖譜的測定方法，是採用超高效液相色譜-質譜聯用儀進行測定，它具有23個共有峰，每個峰都標定了離子質量和分子式，測定步驟包括製備供試品溶液；設定指紋圖譜檢測的色譜條件和質譜條件；記錄18分鐘的色譜圖，根據各峰分子離子的質核比獲得23個共有峰的提取離子色譜圖，進行指紋圖譜評價。本發明的優點是採用了超高效液相色譜儀進行分離，質譜儀進行檢測，大大縮短了分離時間，提高了分離效率和檢測靈敏度，並能實現對共有峰的準確定位。該方法靈敏度高，專屬性強，可用於黃芩藥材的鑑別和質量評價。
文檔編號G01N30/02GK102435689SQ201110302768
公開日2012年5月2日 申請日期2011年10月9日 優先權日2011年10月9日
發明者劉樹民, 柳長鳳, 閆廣利 申請人:劉樹民