一種聯合用心臟停跳保存液及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-22 16:20:20

專利名稱：一種聯合用心臟停跳保存液及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及心臟停跳保存液，特別是一種用於外科手術時心臟停跳和保護的聯合 用心臟停跳保存液。
背景技術：
心臟事件是患者在圍手術期發生嚴重併發症和死亡的最主要原因，其中，體外循 環手術直接作用於心臟，是心臟事件發生的一大誘因。雖然傳統心臟停跳保存液的使用，使 得外科醫生實施體外循環相關的手術比以前更加安全和有效，但是體外循環以後仍然會對 心臟造成一定程度的損傷。首先，對心臟手術病人實施心臟停跳，會由於心臟缺血再灌注損 傷而損傷心肌，從而引起不良預後。其次，體外循環相關的有害作用會導致手術後持續的心 功能障礙。最後，隨著社會的老齡化發展，老年病人心臟手術數量增加，由於老年病人的心 髒恢復能力更差，提高心臟保護效果就顯得更為重要。因此，尋找方便可行、切實有效的減 少和減輕體外循環手術中心臟缺血再灌注損傷的方法，對於降低嚴重併發症和死亡率有重 大的科學、社會和經濟意義，也是我國發展醫療衛生事業，保障人民健康安全的重大需求。目前，雖然St. Thomas液仍然是體外循環相關手術經典的心臟停跳保存液，但是 使用St. Thomas液還存在很多問題。首先，在心臟停跳過程中，St. Thomas液不能為缺血 缺氧的心肌提供氧氣，因此，不可避免會造成缺血再灌注損傷。其次，雖然現在含血停跳保 存液被廣泛使用，並有大量文獻指出它優於單純的晶體停跳保存液，但是還是存在問題，如 (1)惡性腫瘤病人和血液病病人的血液由於臨床安全的考慮，並不能被直接使用。(2)由於 體外循環過程中使用了大量的預充液，血液被很大程度地稀釋，因此其攜氧能力已經大大 降低，同時體外循環過程中適當降低的病人體溫，也會影響其血液的攜氧釋氧能力，從而削 弱含血停跳保存液的心臟保護效力。(3)體外循環手術中，配製含血停跳保存液，需要分流 病人的血液，額外增加了外科醫生和轉機人員的工作。已經有使用含聚乙二醇_牛血紅蛋白的停搏液來保存離體心臟的報導(常昕，中 國胸心血管外科臨床雜誌2008年8月第15卷第4期，P277-280)，但是對體外循環外科手 術中停跳心臟的保護依然存在缺陷，如(1)該研究中選擇的離體心臟灌注模型，由於缺少 了全身免疫系統和體液的調節，並不能顯示體外循環手術中在體心臟對缺血再灌注損傷的 反應。(2)該研究僅僅是將聚乙二醇-牛血紅蛋白和St. Thomas液混合，並沒有加入抗氧 化劑以及調節PH等操作。發明人在研究中已經證實，單純將血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs) 與St. Thomas液混合，對離體心臟的確能發揮有效的保護作用，但是，對體外循環手術中在 體心臟的保護效果很差，因此，為了提高實施體外循環的安全性，改善病人的預後，減少醫 務人員的額外工作，將更多的精力用於術中操作，急需發展一種有攜氧能力的，對體外循環 手術中停跳心臟具有良好保護作用的心臟停跳保存液。

發明內容
為了克服現有技術的缺陷，更好地保護體外循環手術中的停跳心臟，本發明提供
3一種聯合用心臟停跳保存液，其包括St. Thomas液以及血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)，進 一步還包括抗氧化劑，其中所含HBOCs的濃度為0. lg/dL 0. 5g/dL，抗氧化劑的濃度為 0.lg/L 0. 5g/L。優選的，所述HBOCs包括共軛修飾血紅蛋白、聚合血紅蛋白，脂質體包囊血紅蛋 白，基因重組血紅蛋白；所述抗氧化劑為維生素C和/或穀胱甘肽。所述聯合用心臟停跳保存液的pH值為7. 0 7. 4。本發明的聯合用心臟停跳保存液可以直接由St. Thomas液、HBOCs以及抗氧化劑 製備成商品化的心臟停跳保存液成品，也可以將St. Thomas液、HBOCs以及抗氧化劑分別獨 立包裝，組成一個包，使用時可以按照說明書臨時混合而成。本發明的另一個方面是提供一種製備所述聯合用心臟停跳保存液的方法，它是由 以下步驟構成a、將 HBOCs 和 St. Thomas 液混合均勻；b、鼓泡式充氧氧合；C、加入抗氧化劑；d、調節混合液pH值7. 0 7. 4 ；優選的，步驟a 步驟d均在0 4°C低溫條件下操作；步驟b中鼓泡式充氧氣體 為95%氧氣+5%二氧化碳混合氣體或100%氧氣，氧合時間為10 30分鐘；步驟c中的 抗氧化劑包括維生素C和/或穀胱甘肽；步驟d中以不影響血紅蛋白攜氧能力的弱鹼性溶 液調節PH值，如0. IM碳酸氫鹽溶液。本發明聯合用心臟停跳保存液由主動脈根部，經冠狀動脈灌注體外循環手術病人 心肌組織，實現心臟停跳和心臟保護。實現心臟停跳和保護的灌注壓為60 70mmHg，灌注 速率200mL/min，灌注量為40mL/kg。發明人在前期研究基礎上，將HBOCs和St. Thomas液有機結合，製備新的體外循 環手術中使用的聯合用心臟停跳保存液。以人血，動物血以及基因重組血紅蛋白為來源的 HBOCs,主要分為如下幾大類共軛修飾血紅蛋白、聚合血紅蛋白，脂質體包囊血紅蛋白，基 因重組血紅蛋白等。由於其自身具有獨特的氧結合特性和正常的代謝途徑，符合人體生理 需要，有很好的臨床應用前景。將其應用於體外循環中心臟保護主要有如下優點(1)從形態上看，HBOCs粒徑遠小於正常的紅細胞，且黏度遠低於正常的血液，因 此，對心肌組織微循環血管灌注更加充分(見圖1)；(2)從功能上看，HBOCs具有良好的攜氧釋氧能力，其P5tl值，bohr係數，hill係數 等都與生理狀態下全血類似，且能夠通過2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的類似物調節其攜 氧釋氧能力，即使在低溫環境下，也能很好地滿足器官組織的氧供需平衡。(3)對體外循環手術病人，能保證其停跳心臟處於富氧環境，減少糖酵解的發生和 乳酸的生成，有效降低心臟復跳以後的再灌注損傷。(4)可以製備成商品化的產品，像手術中其它藥物一樣使用，減少外科醫生和轉機 人員的操作。本發明的聯合用心臟停跳保存液，安全有效，操作簡單，使用方便，主要用於體外 循環手術中停跳心臟的保護，可以提高對體外循環手術中停跳心臟缺血再灌注損傷的保護 效果，延長保存時間，從而降低圍術期心臟事件發生率，改善病人的預後。
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本發明的工作原理在於(1)正常的紅細胞粒徑約為7μπι，而HBOCs粒徑為 0. 08 0. 1 μ m,且去除了血液中的血漿等成分，黏度遠低於正常的血液，因此，在對體外循 環手術病人冠脈灌注時，能實現對心肌組織微循環血管更加充分的灌注，示意圖見圖1。(2) 在體外循環手術中，停跳心臟一般處在低於正常體溫的環境，如32°C。在低溫環境下，會影 響正常全血的攜氧釋氧能力，因此，若使用全血作為攜氧載體用於心臟保護，效果有限。相 反，HBOCs不僅具有良好的攜氧釋氧能力，其P5tl值，bohr係數，hill係數等還可以通過2， 3-DPG的類似物調節，視不同的應用環境優化其攜氧釋氧能力，即使在低溫環境下，也能很 好地滿足器官組織的氧供需平衡。(3)加入適量抗氧化劑，有助於減少缺血再灌注過程中產 生的大量氧自由基，進一步降低缺血再灌注對心臟造成的損傷。(4)對於體外循環手術病 人，本發明所製備的心臟停跳保存液，在完成心臟灌注停跳的同時，還帶入了大量的攜氧載 體進入心臟組織，使得停跳的心臟處於富氧環境，在減少糖酵解發生和乳酸生成的同時，有 效降低心臟復跳以後的再灌注損傷。應該指出的是，本發明選用經典停跳保存液St. Thomas液做為該聯合用心臟停跳 保存液的載體，而不是目前認為的最好的保存液——Uff液，主要考慮到以下2個因素(1) UW液對於肝臟、腎臟等離體器官的保護效果較好，但是對心臟的保護效果還不是太理想； (2)Uff液本身沒有心臟停跳功能，只能作為心臟保存液使用，如前所述，如果僅僅將HBOCs 作為保存液的成分使用，會限制其對心臟的保護效果；(3)UW液的成分中已經含有蛋白膠 體成分，現有研究還不確定這些蛋白成分是否會與HBOCs發生相互作用，因此本發明選擇 St. Thomas液做為該聯合用心臟停跳保存液的載體。本發明的優越性在於1、新型的心臟停跳保存液，具有攜氧功能，且攜氧能力可通 過2，3-DPG類似物調節，同時對微循環灌注充分，以發揮最大心肌保護效力。2、含有抗氧化 物質，可以有效減少缺血再灌注產生的大量氧自由基，從而進一步降低心臟缺血再灌注損 傷。3、效果顯著。與單純的St. Thomas液和含血心臟停跳保存液比較，本發明所涉的聯合 用心臟停跳保存液對心臟功能的恢復作用更為顯著。4、操作過程簡單，技術條件的難度和 要求很低，所需要的設備也相對簡單，完全可以在臨床廣泛應用。5、使用方便，可以製備成 商品化的攜氧心臟停跳保存液出售，或者HBOCs和St. Thomas液分別出售，臨用前將兩者混 合。該新型停跳保存液的使用，可以取消現有體外循環手術中，分流病人血液配製含血心臟 停跳保存液等繁瑣的操作，同時可避免為製備含血停跳保存液而對惡性腫瘤病人、血液病 病人等的血液實施血液保護處理。下面通過具體實施方式
對本發明做進一步詳細說明，但是並不是對本發明的限 制，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述 基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。


圖1為本發明所涉血紅蛋白類攜氧載體改善微循環灌注圖。圖2為本發明所涉聯合用心臟停跳保存液改善體外循環手術中Beagle犬心臟的 心排量。圖3為本發明所涉聯合用心臟停跳保存液提高體外循環手術中Beagle犬心臟的
耗氧量。
圖4為本發明所涉聯合用心臟停跳保存液減少體外循環手術中Beagle犬心臟的 心肌酶釋放，圖4A為各組CK-MB釋放量、圖4B為各組LDH釋放量，圖4C為各組Troponin-I
釋放量。圖5為本發明所涉含不同濃度血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)的心臟停跳保存液對 體外循環手術中Beagle犬心臟心排量的改善作用。圖6為本發明所涉含不同濃度血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)的心臟停跳保存液提 高體外循環手術中Beagle犬心臟耗氧量。圖7為本發明所涉含不同濃度血紅蛋白類攜氧載體(HBOCs)的心臟停跳保存液減 少Beagle犬心臟的Troponin-Ι釋放。圖8為本發明所涉聯合用心臟停跳保存液中加入抗氧化劑及調節pH值對體外循 環手術中Beagle犬心臟心排量的影響。圖9為本發明所涉聯合用心臟停跳保存液中加入抗氧化劑及調節pH值對體外循 環手術中Beagle犬心臟耗氧量的作用。圖10為本發明所涉聯合用心臟停跳保存液中加入抗氧化劑及調節pH值對體外循 環手術中Beagle犬心臟Troponin-Ι釋放的影響。
具體實施例方式實施例1 本發明聯合用心臟停跳保存液的製備和應用在4°C低溫條件下，將HBOCs的一種——聚合血紅蛋白和經典心臟停跳保存液 St. Thomas液，按照血紅蛋白濃度0. lg/dL混合均勻，並以100%氧氣鼓泡式充氧氧合上述 混合液15分鐘，再按重量/體積比0. lg/L加入適量維生素c，最後以0. IM碳酸氫鈉溶液調 節混合液pH值7. 0 7. 4。上述心臟停跳保存液在體外循環中Beagle犬心臟保護中的應用實驗Beagle犬20隻，體重10 15公斤，隨機分為sham組、HBOCs組、自體血組 和St. Thomas液組，每組5隻。所有實驗Beagle犬術前肌肉注射嗎啡5mg，以枸櫞酸芬太 尼、咪唑安定、丙泊酚、維庫溴胺誘導麻醉，氣管插管後接呼吸機，麻醉以力月西、丙泊酚、枸 櫞酸芬太尼、維庫溴銨維持，根據需要靜脈注射維持至手術結束。左側股動脈穿刺置管監測 血壓、動脈血氣及血清電解質水平，股靜脈穿刺置管接三通延長管達下腔靜脈水平建立輸 液通道並監測中心靜脈壓。漂浮導管安放監測心排血量指標。前正中切口開胸，全身血液肝 素化，常規建立體外循環，轉流量為2. 0-2. 2L/m2/min，體外循環溫度為27°C _29°C，當鼻咽 部溫度降至30°C時依次阻斷上腔靜脈、下腔靜脈、升主動脈，分別灌註上述配製的含HBOCs 的心臟停跳保存液(HBOCs組)，含血心臟停跳保存液(自體血組，按臨床普遍使用的配製方 法，將自體血和St. Thomas液按1 4的比例混合均勻並充氧氧合)和單純的St. Thomas 液(St. Thomas液組)，心包腔內以冰屑局部降溫，灌注速率200mL/min，灌注量為40mL/kg 體重，心臟停跳在2分鐘內完成。主動脈阻斷120分鐘後復溫，鼻咽溫度升至32°C 35°C 時開放升主動脈，未自動復跳者電擊除顫，輔助循環30分鐘停機，開放復灌120分鐘後動物 實施安樂死。Sham組Beagle犬完成插管以後，不阻斷主動脈和實施心臟停跳，維持2小時 後實施安樂死。檢測指標包括(1)心臟功能指標心排血量用愛德華漂浮導管和EXcel210SE型麻醉機和監護儀採集。(2)血氣指標，如氧分壓(PO2),氧飽和度(SO2), 二氧化碳分壓 (PCO2), pH值，紅細胞比容(HCT)，血紅蛋白濃度，Ca2+濃度，K+濃度，Mg2+濃度等用i-STAT 可攜式血氣分析儀採集。心臟耗氧量通過以下公式以PO2和SO2計算得出耗氧量= [(PO2XSO2)停跳液-(PO2XSO2)相應流出液]/心臟溼重。(3)肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)， 乳酸脫氫酶(LDH)和肌鈣蛋白I(Troponin-I)的釋放用modelAU5400全自動分析儀檢測。統計分析心排量和心臟耗氧量的結果採用重複測量的方差分析，並用 Bonferroni檢驗比較兩兩差異。同時，CK-MB, LDHjP Troponin-〗釋放量採用單因素方差
分析，並用LSD檢驗比較兩兩差異。P <0.05被認為是有顯著性差異。數據以〒±SEM表
示(η = 5)。*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01 vs. St. Thomas 液組；卞 P < 0. 05vs.自體血組。實驗結果顯示1、阻斷前，各組心臟的心排量沒有顯著性差異，但是在復灌30分鐘、60分鐘、90 分鐘和120分鐘的時間點，HBOCs組心臟的心排量均顯著高於St. Thomas液組(分別為P < 0. 05,P < 0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01)；同時，在復灌30分鐘、90分鐘和120分鐘的時間 點，HBOCs組心臟的心排量也顯著高於自體血組(分別為P < 0. 05,P < 0. 05和P < 0. 05) (見圖2)。2、阻斷前，各組心臟的耗氧量沒有顯著性差異，但是在復灌30分鐘、60分鐘、90分 鍾和120分鐘的時間點，HBOCs組心臟的耗氧量，與St. Thomas液組相比均有顯著提高(分 別為P < 0. 01、P < 0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01)；在復灌30分鐘、60分鐘和120分鐘的時 間點，HBOCs組心臟的耗氧量，與自體血組相比也有顯著增加(分別為P < 0. 05、P < 0. 05 和 P < 0. 05)(見圖 3)。3、阻斷前，各組心臟的CK-MB、LDH和Troponin-I釋放量均沒有顯著性差異，但是 在復灌120分鐘後，HBOCs組心臟的CK-MB、LDH和Troponin-〗釋放，與St. Thomas液組相比， 均有顯著降低(分另Ij P < 0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01)。同時，HBOCs組心臟的Troponin-I 釋放與自體血組相比，也有顯著下降(P < 0. 05)(見圖4A、圖4B、圖4C)。結論在體外循環手術中，本發明所涉的聯合用心臟停跳保存液對心臟的保護效果顯著 優於St. Thomas液，能明顯提高Beagle犬心臟缺血再灌注損傷後的心排量和心臟耗氧量， 減少心肌酶CK-MB、LDH和Troponin-I的釋放。同時，本發明所涉的聯合用心臟停跳保存液 對心臟的保護效果還顯著優於含血心臟停跳保存液，明顯提高了 Beagle犬心臟缺血再灌 注損傷後的心排量和心臟耗氧量，並減少了心肌酶Troponin-I的釋放。因此，本發明所涉 新型心臟停跳保存液對體外循環手術中停跳心臟有明顯的保護作用。實施例2 本發明心臟停跳保存液的製備及應用在4°C低溫條件下，將HBOCs的一種——聚合血紅蛋白和經典心臟停跳保存液 St. Thomas液，分別按照血紅蛋白濃度0. lg/dL、0. 3g/dL和0. 5g/dL混合均勻，並以95%氧 氣+5%二氧化碳混合氣體鼓泡式充氧氧合上述混合液15分鐘，再按重量/體積比0. lg/L 加入適量維生素c，最後以0. IM碳酸氫鈉溶液調節混合液pH值7. 0 7. 4。上述心臟停跳保存液在體外循環中Beagle犬心臟保護中的應用實驗Beagle犬20隻，體重10 15公斤，隨機分為St. Thomas液組、0. 1 % HBOCs 組、0.3% HBOCs組和0. 5% HBOCs組，每組5隻。所有實驗Beagle犬術前肌肉注射嗎啡
75mg，以枸櫞酸芬太尼、咪唑安定、丙泊酚、維庫溴胺誘導麻醉，氣管插管後接呼吸機，麻醉以 力月西、丙泊酚、枸櫞酸芬太尼、維庫溴銨維持，根據需要靜脈注射維持至手術結束。左側股 動脈穿刺置管監測血壓、動脈血氣及血清電解質水平，股靜脈穿刺置管接三通延長管達下 腔靜脈水平建立輸液通道並監測中心靜脈壓。漂浮導管安放監測心排血量指標。前正中切 口開胸，全身血液肝素化，常規建立體外循環，轉流量為2. 0-2. 2L/m7min，體外循環溫度為 27V -29°C，當鼻咽部溫度降至30°C時依次阻斷上腔靜脈、下腔靜脈、升主動脈，分別灌注 上述配製的含HBOCs的心臟停跳保存液(HBOCs組)和單純的St. Thomas液(St. Thomas液 組)，心包腔內以冰屑局部降溫，灌注速率200mL/min，灌注量為40mL/kg體重，心臟停跳在2 分鐘內完成。主動脈阻斷120分鐘後復溫，鼻咽溫度升至32°C 35°C時開放升主動脈，未 自動復跳者電擊除顫，輔助循環30分鐘停機，開放復灌120分鐘後動物實施安樂死。Sham 組Beagle犬完成插管以後，不阻斷主動脈和實施心臟停跳，維持2小時後實施安樂死。檢測指標包括(1)心臟功能指標心排血量用愛德華漂浮導管和EXcel210SE 型麻醉機和監護儀採集。(2)血氣指標，如氧分壓(PO2),氧飽和度(SO2), 二氧化碳分壓 (PCO2), pH值，紅細胞比容(HCT)，血紅蛋白濃度，Ca2+濃度，K+濃度，Mg2+濃度等用i-STAT 可攜式血氣分析儀採集。心臟耗氧量通過以下公式以PO2和SO2計算得出耗氧量= [(PO2XSO2)停跳液-(PO2XSO2)相應流出液]/心臟溼重。(3)肌鈣蛋白I(Troponin-I)的 釋放用model AU5400全自動分析儀檢測。統計分析心排量和心臟耗氧量的結果採用重複測量的方差分析，並用 Bonferroni檢驗比較兩兩差異。同時，Troponin-I釋放量採用單因素方差分析，並用LSD 檢驗比較兩兩差異。P <0.05被認為是有顯著性差異。數據以I±SEM表示(η = 5)。乍
<0. 05，**Ρ < 0. Olvs. St. Thomas 液組。實驗結果顯示1、阻斷前，各組心臟的心排量沒有顯著性差異，但是在復灌30分鐘、60分鐘、90分 鍾和120分鐘的時間點，0. 1% HBOCs組心臟的心排量均顯著高於St. Thomas液組(分別為 P < 0. 05、P < 0. 05、P < 0. 01 禾口 P < 0. 01)；在復灌 30 分鐘、60 分鐘、90 分鐘和 120 分鐘 的時間點，0. 3% HBOCs組心臟的心排量也顯著高於St. Thomas液組(分別為P < 0. 05、P
<0. 05,P < 0. 01和P < 0. 01)；同時，在復灌90分鐘和120分鐘的時間點，0. 5% HBOCs組 心臟的心排量與St. Thomas液組相比，也有顯著增高(分別為P < 0. 05和P < 0. 05)(見 圖5)。2、阻斷前，各組心臟的耗氧量沒有顯著性差異，但是在復灌30分鐘、60分鐘、90 分鐘和120分鐘的時間點，0. 1 % HBOCs組心臟的心臟耗氧量均顯著高於St. Thomas液組 (分別為P < 0. 01、P < 0. 05、P < 0. 01和P < 0. 01)；在復灌30分鐘、60分鐘、90分鐘和 120分鐘的時間點，0. 3% HBOCs組心臟的心臟耗氧量也顯著高於St. Thomas液組(分別為 P < 0. 01、P < 0. 05、P < 0. 05和P < 0. 05)；同時，在復灌90分鐘和120分鐘的時間點， 0. 5% HBOCs組心臟的耗氧量與St. Thomas液組相比，也有顯著增高(分別為P < 0. 05和 P < 0. 05)(見圖 6)。3、阻斷前，各組心臟的Troponin-I釋放量均沒有顯著性差異，但是在復灌120 分鐘後,0. 1 % HBOCs 組、0. 3 % HBOCs 組和 0. 5 % HBOCs 組心臟的 Troponin-Ι 釋放，與 St. Thomas液組相比，均有顯著降低(分別P < 0. 01、P < 0. 01和P < 0. 05)(見圖7)。
結論含有HBOCs濃度0. lg/dL、0. 3g/dL和0. 5g/dL的聯合用心臟停跳保存液，對體外 循環手術中Beagle犬心臟均有不同程度的保護作用，能顯著提高Beagle犬心臟的心排量 和心臟耗氧量，改善心功能，減少心肌酶的釋放，減輕缺血再灌注損傷。因此，本發明所涉的 含HBOCs濃度0. lg/dL 0. 5g/dL的聯合用心臟停跳保存液對體外循環手術中停跳心臟均 有明顯的保護作用。另外，從圖5 圖7可以看出，本發明的聯合用心臟停跳保存液中HBOCs的濃度並 非與其心臟保護作用成正比，0. 1 % HBOCs組和0. 3% HBOCs組Beagle犬心臟的心排量和 耗氧量均要高於0. 5% HBOCs組，減少心臟Troponin-I釋放的作用也是前者好於後者。因 此，在本發明所指出的HBOCs濃度範圍內，停跳保存液的心臟保護效果的趨勢是隨HBOCs濃 度降低而增強，而並不是HBOCs濃度越大越好。實施例3 本發明聯合用心臟停跳保存液的製備及應用在4°C低溫條件下，將HBOCs的一種——聚合血紅蛋白和經典心臟停跳保存液 St. Thomas液，按照血紅蛋白濃度0. 5g/dL混合均勻，並以95%氧氣+5% 二氧化碳混合氣 體鼓泡式充氧氧合上述混合液15分鐘，再按重量/體積比0. lg/L加入適量維生素c，最 後以0. IM碳酸氫鈉溶液調節混合液pH值7. 0 7. 4。對照組使用的心臟停跳保存液配 制方法為在4°C低溫條件下，將HBOCs的一種——聚合血紅蛋白和經典心臟停跳保存液 St. Thomas液，按照血紅蛋白濃度0. 5g/dL混合均勻，並以95 %氧氣+5 % 二氧化碳混合氣體 鼓泡式充氧氧合上述混合液15分鐘，pH值6. 0 6. 5，不加入抗氧化劑和調節pH值，直接 使用。上述聯合用心臟停跳保存液在體外循環中Beagle犬心臟保護中的應用對照組Beagle犬3隻，體重10 15公斤，術前肌肉注射嗎啡5mg，以枸櫞酸芬太 尼、咪唑安定、丙泊酚、維庫溴胺誘導麻醉，氣管插管後接呼吸機，麻醉以力月西、丙泊酚、枸 櫞酸芬太尼、維庫溴銨維持，根據需要靜脈注射維持至手術結束。左側股動脈穿刺置管監 測血壓、動脈血氣及血清電解質水平，股靜脈穿刺置管接三通延長管達下腔靜脈水平建立 輸液通道並監測中心靜脈壓。漂浮導管安放監測心排血量指標。前正中切口開胸，全身血 液肝素化，常規建立體外循環，轉流量為2. 0-2. 2L/m7min，體外循環溫度為27°C _29°C，當 鼻咽部溫度降至30°C時依次阻斷上腔靜脈、下腔靜脈、升主動脈，灌注對照心臟停跳保存液 (0. 5g/dL，未加入抗氧化劑和調節pH值)，心包腔內以冰屑局部降溫，灌注速率200mL/min， 灌注量為40mL/kg體重，心臟停跳在2分鐘內完成。主動脈阻斷120分鐘後復溫，鼻咽溫度 升至32°C 35°C時開放升主動脈，未自動復跳者電擊除顫，輔助循環30分鐘停機，開放復 灌120分鐘後動物實施安樂死。實驗組(0.58/孔，加入抗氧化劑並調節？!1值7.0 7.4) 數據採用實施例2中0. 5% HBOCs組數據。檢測指標包括(1)心臟功能指標心排量用愛德華漂浮導管和EXcel210SE型麻 醉機和監護儀採集。(2)血氣指標，如氧分壓(PO2),氧飽和度(SO2), 二氧化碳分壓(PCO2), PH值，紅細胞比容(HCT)，血紅蛋白濃度，Ca2+濃度，K+濃度，Mg2+濃度等用i_STAT可攜式血 氣分析儀採集。心臟耗氧量通過以下公式以PO2和SO2計算得出耗氧量=[(PO2XSO2)停 跳液-(PO2XSO2)相應流出液]/心臟溼重。(3)肌鈣蛋白I (Troponin-I)的釋放用model AU5400全自動分析儀檢測。
統計分析心排量和心臟耗氧量的結果採用重複測量的方差分析，並用 Bonferroni檢驗比較兩兩差異。同時Troponin-I釋放量採用單因素方差分析，並用LSD檢 驗比較兩兩差異。P <0.05被認為是有顯著性差異。數據以7士SEM表示(η = 3-5)。乍
<0. 05，**Ρ < 0. Olvs.對照組。實驗結果顯示1、阻斷前，實驗組和對照組心臟的心排量沒有顯著性差異，但是在復灌60分鐘、 90分鐘和120分鐘的時間點，實驗組心臟的心排量顯著高於對照組(分別為P < 0. 05、P
<0. 01 和 P < 0. 01)(見圖 8)。2、阻斷前，實驗組和對照組心臟的耗氧量沒有顯著性差異，但是在復灌90分鐘 和120分鐘的時間點，實驗組心臟的心臟耗氧量要顯著高於對照組(分別為P < 0. 05和P
<0. 05)(見圖 9)。3、阻斷前，實驗組和對照組心臟的Troponin-I釋放量均沒有顯著性差異，但是在 復灌120分鐘後，實驗組心臟的Troponin-I釋放，與對照組相比有顯著降低(P < 0. 05)(見 圖 10)。結論加入抗氧化劑並調節pH值到7. 0 7. 4，能顯著提高Beagle犬心臟的心排量和心 髒耗氧量，改善心功能，減少心肌酶的釋放，減輕缺血再灌注損傷。因此，本發明所涉的聯合 用心臟停跳保存液對體外循環手術中停跳心臟均有明顯的保護作用。從圖8 圖10可以看出，加入抗氧化劑及調節pH值後的心臟停跳保存液對心臟 的保護效果顯著優於未加入抗氧化劑及調節PH值的心臟停跳保存液。因此本發明所指出 的加入抗氧化劑及調節PH值對於提高停跳保存液的心臟保護效果是必不可少的，為體外 循環手術中心臟的保護提供了一種新的安全的保護途徑。
權利要求
一種聯合用心臟停跳保存液，包括St.Thomas液以及血紅蛋白類攜氧載體。
2.根據權利要求1所述的聯合用心臟停跳保存液，其特徵是還包括抗氧化劑。
3.根據權利要求1所述的聯合用心臟停跳保存液，其特徵是其中所含血紅蛋白類攜氧 載體的濃度為0. lg/dL 0. 5g/dL。
4.根據權利要求3所述的聯合用心臟停跳保存液，其特徵是所述血紅蛋白類攜氧載 體包括共軛修飾血紅蛋白、聚合血紅蛋白，脂質體包囊血紅蛋白，基因重組血紅蛋白。
5.根據權利要求2所述的聯合用心臟停跳保存液，其特徵是其中所含抗氧化劑的濃度 為 0.lg/L 0. 5g/L。
6.根據權利要求5所述的聯合用心臟停跳保存液，其特徵是所述抗氧化劑為維生素C 和/或穀胱甘肽。
7.根據權利要求1 6任一一項所述的聯合用心臟停跳保存液，其特徵是其pH值為 7. 0 7. 4。
8.根據權利要求7所述的聯合用心臟停跳保存液，其特徵是其由St.Thomas液、血紅 蛋白類攜氧載體以及抗氧化劑組成，或者St. Thomas液、血紅蛋白類攜氧載體以及抗氧化 劑分別獨立包裝，使用時再混合而成。
9.一種製備如權利要求1 8任一一項所述聯合用心臟停跳保存液的方法，其特徵在 於它是由以下步驟構成a、將血紅蛋白類攜氧載體和St.Thomas液混合均勻；b、鼓泡式充氧氧合；C、加入抗氧化劑；d、調節混合液pH值7. 0 7. 4。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於步驟a 步驟d均在0 4°C低溫條件 下操作；步驟b中鼓泡式充氧氣體為95%氧氣+5%二氧化碳混合氣體或100%氧氣，氧合 時間為10 30分鐘；步驟d中以不影響血紅蛋白攜氧能力的弱鹼性溶液調節pH值。
全文摘要
本發明公開了一種聯合用心臟停跳保存液，它包括St.Thomas液以及血紅蛋白類攜氧載體，既可以製備成商品化的心臟停跳保存液成品出售，也可以將St.Thomas液以及血紅蛋白類攜氧載體分別獨立包裝，臨用前配製。本發明的心臟停跳保存液安全有效，操作簡單，使用方便，主要用於體外循環手術中心臟的停跳和保護。
文檔編號A01N1/02GK101897329SQ20091005942
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者劉進, 周榮華, 李濤 申請人:四川大學華西醫院