主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的製備和使用方法
2023-09-22 17:11:15 1
主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的製備和使用方法
【專利摘要】本發明涉及基於化學發光技術平臺的主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的製備和使用方法。本發明的基因晶片可以用於檢測蚊媒傳播的病毒12種、寄生蟲7種。包含檢測蚊媒病毒的14條特異性引物和13條特異性寡核苷酸探針；檢測蚊媒寄生蟲的6條特異性引物和8條特異性寡核苷酸探針。病毒和寄生蟲探針分別分布在載體上。本發明包括了基因晶片的製備方法：1.引物探針設計合成晶片的製備。本發明還包括了基因晶片的使用方法：1.蚊媒病毒RNA和寄生蟲質粒的提取；2.多重RT-PCR/PCR擴增；3.晶片雜交；4.雜交後清洗；5.標記；6.晶片掃描；7.數據分析。本發明具有快速、高通量、高靈敏度、高特異性的特點。
【專利說明】主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的製備和使用方 法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的製備和使用方法，屬 生物晶片領域。
【背景技術】
[0002] 蚊媒病毒是一類通過節肢動物蚊類傳播給恆溫脊椎動物的病毒。各種病毒有著不 同的蚊類傳播載體。當這類節肢動物叮咬感染了該類病毒的宿主時，其本身就可能攜帶該 類病毒，並通過叮咬方式傳播給下一個病毒宿主。蚊類之間也可以通過交尾或繁殖而水平 或垂直傳播。蚊媒病毒主要分為三個科，分別是：披膜病毒科、黃病毒科、布尼亞病毒科。而 其中在全球範圍內影響最大的幾種病毒包括：黃病毒屬登革熱病毒（DENV)、日本腦炎病毒 (JEV)、黃熱病病毒（YFV)、西尼羅河病毒（WNV)、甲病毒屬基孔貢亞熱病毒（CHIKV)等。在 我國，蚊媒病原體是高溫、草地、叢林等戰區尤其是邊境地區重要的傳染病病原體，其引起 的多種傳染病嚴重影響部隊作戰能力和人民日常生活。
[0003] 目前已確定的黃病毒屬病毒超過70種。黃病毒屬的病毒均為小型的有包膜病毒， 病毒基因組大小約為Ilkb長的單股正鏈RNA。黃病毒基因組只有一個開放的讀碼框用來編 石馬 3 種結構蛋白（capsid protein、premembrane/membrane protein、envelope protein) 和7種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。這些多聚蛋白是在共同翻譯 後由宿主的蛋白酶和病毒的絲氨酸蛋白酶經過翻譯後切割而形成獨立蛋白。三種結構蛋 白中衣殼蛋白（capsid protein)形成病毒RNA的核衣殼；病毒的外殼則由前膜/膜蛋白 (premembrane/membrane protein)和夕卜膜蛋白(envelope protein)共同形成。夕卜膜蛋白 為黃病毒屬抗原蛋白，與病毒侵入和攻擊宿主細胞有關。前膜蛋白（premembrane protein) 是使外膜蛋白摺疊為適當結構的關鍵蛋白，病毒在宿主細胞中成熟前由成對鹼性胺基酸蛋 白酶切割而形成膜蛋白（membrane protein)。
[0004] 甲病毒屬病毒屬於披膜病毒科家族，包含28種病毒。甲病毒屬病毒為單股正鏈 RNA病毒，基因組長度約為11. 5kb，包含兩個開放讀碼框編碼4種非結構蛋白和5種結構蛋 白。上遊的開放讀碼框編碼4種非結構蛋白（nspl-4)，而下遊的開發讀碼框編碼病毒結構 蛋白（capsid)和糖蛋白（E3、E2、6K、E1)。非結構蛋白由正鏈基因組RNA翻譯，發揮轉錄全 長負鏈RNA的作用。翻譯的nspl-3多聚蛋白由位於nsp3和nsp4之間的終止子終止；當翻 譯通過nsp3和nsp4連接位置時產生nspl-4多聚蛋白。值得注意的是，甲病毒屬的一些病 毒如西門利克森林病毒、Sindbis等的終止子由正鏈的密碼子替代。負鏈RNA對於26S亞 基因組mRNA等附加的基因組RNA來說是一種臨時的狀態。26S啟動子位於負鏈RNA兩個開 放讀碼框之間由非結構蛋白識別並轉錄為亞基因組mRNA，隨後由這些亞基因組mRNA翻譯 成結構蛋白的多聚蛋白。26S mRNA的產量為基因組的10倍。隨後，多聚的結構蛋白經過翻 譯後切割形成capsid protein和2種成熟的envelope糖蛋白（El和E2)。
[0005] 隨著氣候變暖、人口流動性增加、城市化等因素的影響，經常導致蚊媒病毒流行範 圍的擴大和突然爆發。1999年美國紐約爆發的WNV導致大量的烏鴉等鳥類的死亡。2012 年美國德克薩斯爆發的WNV造成1868人感染病例，其中89人死亡，共帶來4700萬美元的 經濟損失。2010年，中國廣東東莞爆發CHIKV，導致173人感染 [15]。2005-2006年間，印度 共有130萬人感染CHIKV。WHO每年記錄的DENV感染病例數約90萬人。而據估計，每年實 際感染DENV的病例高達3. 9億人，而其中約9600萬感染患者出現或接近出現DENV感染臨 床症狀，每年超過2萬人因嚴重的DENV感染而死亡。
[0006] 除了傳播上述這些常見的病毒外，蚊類攜帶和傳播的瘧原蟲和淋巴系統絲蟲也是 目前全球範圍內最為重要的寄生蟲疾病。由於廣泛的流行和危害，瘧疾和淋巴系統絲蟲病 被列為全球最優先控制和消除的疾病。在許多熱帶地區，這兩種疾病可以共用相同的傳 播宿主也可能共同感染人體。痕原蟲（malaria parasite)是痕疾（malaria)的病原體， 屬於頂端複合物門，痕原蟲科（Plasmodiidae) _原蟲屬（Plasmodium)。痕原蟲的生活史 的特點包括：宿主交替（脊椎動物與吸血昆蟲）與世代交替（無性生殖與有性生殖）。在 人體和其他脊椎動物的內臟組織細胞和紅細胞內進行無性生殖（裂體增殖）；在吸血昆蟲 體內進行有性的配子生殖和無性的孢子增殖。蚊類傳播導致人瘧疾的瘧原蟲有四種，分別 是：間日痕原蟲（Plasmodium vivax)、三日痕原蟲（Plasmodium malariae)、惡性痕原蟲 (Plasmodium falciparum)和卵形痕原蟲（Plasmodium ovale)。痕疾在非洲、亞洲和拉丁 美洲的109個國家肆虐。據報導，全球一半的人口生活在有瘧疾感染風險的地區，每年有大 約2. 5億人感染。瘧疾感染每年大約導致1百萬人死亡，特別是5歲以下兒童和妊娠期婦 女。絲蟲屬於線形動物門絲蟲總科（Filarioidea)，成蟲寄生於人或動物的淋巴系統、皮下 組織、體腔或心血管等部位。蚊類傳播的導致淋巴系統絲蟲病的絲蟲有3種，分別是：班氏 絲蟲（Wuchereria bancrofti)、馬來絲蟲（Brugia malayi)、帝漢絲蟲（Brugia timori)。 全球大約有13億人生活在有感染淋巴系統絲蟲病風險的地區。僅次於瘧疾，淋巴系統絲蟲 病為全球範圍內影響第二大的節肢動物傳播疾病，每年約導致亞洲、非洲、西太平洋、部分 美洲等地區超過78個國家的1. 28億人感染。
[0007] 蚊媒病原體這種具有從其存在地區突然傳播入新地區的能力使得持續監測這類 病毒具有重要的意義。"診"、"防"、"治"三個關鍵環節構成了完整的疾病預防控制鏈，其中 "診"不僅是疾控鏈中不可缺少的關鍵一環，而且也是有效防治的前提，只有快速、準確的診 斷，才能有效的預防和治療。因此，準確有效檢測蚊媒病原體是控制蚊媒傳染病的關鍵。很 多基因診斷的方法，如real-time PCR、等溫擴增、基因晶片、基因測序等技術都曾經被用於 蚊媒病毒和寄生蟲的檢測。上述的幾種方法都有著各自的優點，但是這些方法要麼只能檢 測少數1-2種病原體，檢測範圍有限；要麼步驟繁瑣、成本高，不利於推廣應用。此外，可以 同時檢測常見的蚊媒病毒和寄生蟲的基因晶片方法也沒有被報導過。
[0008] 基因晶片又稱DNA微陣列（DNA microarray)，是最早出現的生物晶片技術。基因 晶片是基於核酸互補雜交原理建立起來的，將cDNA或寡核苷酸分子固定於載體表面。最早 的"cDNA晶片"是由史丹福大學的Patrick Brown實驗室發明的，他們利用機械臂把經過 純化的cDNA克隆點制在玻璃載體上。晶片與螢光標記的RNA樣品雜交，通過樣本中被標記 的RNA與玻片上的eDNA特異性的結合，可以判斷相應的基因表達水平。點制在晶片上的 DNA片段通常稱為探針（Probe)，被標記並檢測的RNA混合物被稱為靶基因。基因晶片技術 具有快速、高通量、可靠性高、檢測效率高、低成本等特點被廣泛應用於表達譜分析[62]，單 核苷酸多態性分析（SNP)，疾病診斷，病原微生物檢測等方面。本文目的為研發主要蚊媒病 毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片試劑盒。基於化學發光檢測方法，用於檢測蚊媒傳播的病毒 12種：登革熱病毒1-4 (DENV1-4)、日本腦炎病毒（JEV)、黃熱病病毒（YFV)、聖路易士腦炎病 毒（SLEV)、西尼羅河病毒（WNV)、東方馬腦炎病毒（EEEV)、西方馬腦炎病毒（WEEV)、委內瑞 拉馬腦炎病毒（VEEV)、基孔貢亞熱病毒（CHIKV);寄生蟲7種：間日瘧原蟲（P.V)、三日瘧原 蟲（P. M)、惡性瘧原蟲（P. F)、卵形瘧原蟲（P. 0)、班氏絲蟲（W. B)、馬來絲蟲（B. M)、帝汶絲蟲 (B. T)。
【發明內容】
[0009] 本文目的為研發一種主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片。用於檢測蚊媒 傳播的病毒12種：登革熱病毒1-4 (DENV1-4)、日本腦炎病毒（JEV)、黃熱病病毒（YFV)、聖 路易士腦炎病毒（SLEV)、西尼羅河病毒（WNV)、東方馬腦炎病毒（EEEV)、西方馬腦炎病毒 (WEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒（VEEV)、基孔貢亞熱病毒（CHIKV);寄生蟲7種：間日瘧原蟲 (P. V)、三日瘧原蟲（P. M)、惡性瘧原蟲（P. F)、卵形瘧原蟲（P. 0)、班氏絲蟲（W. B)、馬來絲蟲 ?^、帝汶絲蟲?.!')。
[0010] 本發明採用了以下技術方案：一種主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片，包 含對蚊媒病毒檢測的13條特異性寡核苷酸探針（表1)、對蚊媒寄生蟲檢測的8條特異性寡 核苷酸探針（表2)、一條質控探針（表3)和載體，蚊媒病毒探針和寄生蟲探針分別分布在 載體上。此外，在靶基因上下遊保守位置設計用於蚊媒病毒和蚊媒寄生蟲靶基因序列擴增 的特異性引物20條（表4、表5)。
[0011] 表1對蚊媒病毒檢測的特異性寡核苷酸探針序列
[0012]
【權利要求】
1. 一種主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片，本發明的基因晶片可以用於檢測蚊 媒傳播的病毒12種（登革熱病毒1-4、日本腦炎病毒、黃熱病病毒、聖路易士腦炎病毒、西尼 羅河病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、基孔貢亞熱病毒）、寄 生蟲7種（間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲、班氏絲蟲、馬來絲蟲、帝汶絲 蟲）。其特徵是包含檢測蚊媒病毒的14條特異性引物和13條特異性寡核苷酸探針；檢測 蚊媒寄生蟲的6條特異性引物和8條特異性寡核苷酸探針；1條質控探針和載體。蚊媒病 毒探針和寄生蟲探針分別分布在載體上。 對蚊媒病毒檢測的特異性寡核苷酸探針序列
對蚊媒寄生蟲檢測的特異性寡核苷酸探針序列
質控探針
蚊媒病毒靶基因特異引物
蚊媒寄生蟲靶基因特異引物
2. 根據權利1所述的主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片，其特徵是所述的載體 為醛基化修飾的玻璃片、矽片、聚苯乙稀基片、尼龍基片。
3. -種主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的製備方法，包括以下步驟： 步驟一，探針的設計：首先從NCBI基因資料庫中下載相應的病原體基因序列，由於黃 病毒屬和甲病毒屬病原體的基因組長度約為ll-12kb，因此下載了黃病毒屬和甲病毒屬病 毒的全基因組序列進行比對分析，而瘧原蟲屬和絲蟲屬的7種寄生蟲則分別下載了 4種瘧 原蟲的18s rRNA基因、班氏絲蟲特有Ssp I基因、馬來絲蟲和帝汶絲蟲特有Hha I基因進行 比對分析。序列下載完成後，使用Vector NTI AdvancelO(invitrogen)軟體包中的AlignX 程序按照默認的參數設置對各病原體基因序列進行全局比對。根據比對結果在基因序列的 保守位置設計特異性寡核苷酸探針、1條片基質控探針、特異性引物。 步驟二，探針的合成，每條探針的3'端加入12個鹼基T且3'末端T氨基修飾作為連 接臂，以使其能固定在醛基化修飾玻璃基片上；質控探針除3'末端T進行氨基修飾外，5'端 同時標記生物素標記； 步驟三，晶片的製備：將合成後的探針用去離子水稀釋成100 U M，分別取10 y L探針溶 液，和10 U L體積晶片點樣液混勻，使探針點樣終濃度為50 i! M，裝於384孔板，將晶片表面 貼上10樣品孔陣列膜，用pixsys5000晶片製備儀（Cartesian Technologies)，採用接觸式 點樣方式，將探針點制在載體上，點樣過程中保持一定溼度，點樣完成後將晶片置於乾燥器 中避光常溫靜置48h，使探針和晶片表面醛基脫去1分子水後共價結合，點制好的晶片常溫 乾燥保存。
4. 根據權利要求3所述的主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的製備方法，其特 徵是步驟一中21條特異性寡核苷酸探針以及1條片基質控探針，探針長度在18-45nt。
5. 根據權利要求3所述的主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的製備方法，其特 徵是步驟三種所述的載體為醛基化玻璃片基或矽片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。
6. -種主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的使用方法，其特徵是包括以下步 驟： 步驟一，蚊媒病原體核酸的提取，使用市售商品化病毒基因組RNA提取試劑盒和寄生 在基因組DNA提取試劑盒提取病毒RNA和寄生蟲DNA ; 步驟二，RT-PCR/PCR擴增：蚊媒病毒擴增使用TaKaRa的一步法RT-PCR試劑，以兩組多 重RT-PCR擴增體系分別擴增蚊媒黃病毒屬和甲病毒屬靶基因，使用引物見表4 ;RT-PCR按 以下循環參數進行擴增：50°C反轉錄30min，94°C預變性2min，45個循環為94°C變性20S、 55°C退火20S、72°C延伸20S，最後72°C延伸反應5min，4°C保存或進行下一步實驗。蚊媒寄 生蟲擴增使用TaKaRa的PCR試劑，以一組多重PCR體系擴增蚊媒寄生蟲靶基因，使用引物 見表5。PCR按以下循環參數進行擴增：95°C預變性2min，45個循環為94°C變性20S、55°C 退火20S、72°C延伸20S，最後72°C延伸反應5min，4°C保存或進行下一步實驗。 步驟三，晶片雜交：將基因晶片分別置0. 2% SDS和去離子水中分別清洗30S，離心幹 燥；將步驟二得到的RT-PCR產物/PCR產物在95°C變性5min後立即置於冰浴中5min，分別 取同一蚊媒病毒模版RT-PCR擴增體系一和擴增體系二產物各2. 5 ii L與5 ii L雜交液混勻， 使用加樣器加於晶片加樣孔使其均勻覆蓋於陣列表面，將基因晶片放入雜交盒內在45°C雜 交lh。蚊媒寄生蟲PCR擴增產物取5 ii L與5 ii L雜交液混勻，操作步驟同蚊媒病毒。 步驟四，雜交後清洗基因晶片：基因晶片雜交完成後，從雜交盒中取出晶片，並立即依 次在洗液1XSSC+0. 2% SDS、0. 2XSSC和0. IXSSC中各清洗30S，最後將基因晶片表明液 體離心乾燥。 步驟五，樣品標記：向晶片加入15 y 1標記液，用移液器塗勾後將晶片放回雜受盒中直 37°C水浴中反應30min，取出晶片以PBST清洗10s，離心乾燥。 步驟六，掃描：向晶片反應區加入剛剛I : 1混合的發光液A和B的混合溶液，用移液器 塗勻後立即置化學發光成像儀中掃描，成像模式為觸發模式，曝光參數511，增益參數300， 曝光時間10s，觸發次數1次。 步驟六，數據分析：成像結束後使用化學發光分析軟體進行晶片探針信號分析。每條 探針的信號取其三個重複點的平均值，根據探針Cutoff值，探針信號值>該探針Cutoff?值 的判讀為該探針信號陽性。本發明使用方法的步驟二中RT-PCR使用的反向引物修飾分子 為生物素。本發明使用方法步驟三中使用的雜交液組分為8XSSC，0. 6% SDS，10%甲醯胺， 10XDenhardt。
7. 根據權利要求6所述的主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的使用方法，其特 徵是步驟二中使用的用於擴增蚊媒病毒和寄生蟲靶基因的反相引物5'端進行修飾。
8. 根據權利要求7所述的反向引物5'端修飾分子可以是CY3、CY5、生物素。
9. 根據權利要求6所述的主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的使用方法，其特 徵是步驟三中使用的雜交液組分為8 X SSC，0. 6 % SDS，10 %甲醯胺，10 X Denhardt。
10. 根據權利要求6所述的主要蚊媒病毒和寄生蟲甄別檢測基因晶片的使用方法，其 特徵是步驟六中使用的掃描方法，根據權利要求8中反向引物修飾分子的不同，掃描方法 包括螢光掃描，可視化掃描，化學發光掃描。
【文檔編號】C12Q1/68GK104212913SQ201410336755
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月16日
【發明者】王升啟, 張英傑, 劉琪琦, 陳蘇紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所