乙基丙二醯基取代水飛薊賓及其製備方法和藥物用途的製作方法
2023-09-22 11:33:05
專利名稱：乙基丙二醯基取代水飛薊賓及其製備方法和藥物用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體而言，本發明涉及一個23位乙基丙二醯 基取代的水飛薊賓衍生物即化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二 氫-3,5,7-三羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯並二氧六環-2]-甲基乙酯的 製備方法和醫藥用途。該化合物被發現具有抑制II型單純皰疹病毒HSV-2復 制的功能，因此該化合物或其可藥用鹽可以預期用於製備治療由II型單純皰疹 病毒HSV-2引發的生殖器皰疹和/或生殖器炎症的藥物。
背景技術：
單純皰疹病毒直徑約為120-150微米，含有DNA的核位於中間，向外依 次由包膜、體被、衣殼三種同心結構組成，衣殼表面為162個殼微粒組成的3:3:2 軸對稱的20面體，在低溫下可生存數月，溼熱5(TC及乾燥90°C 30分鐘處理 可滅活。單純皰疹病毒可分為I型和II型二種，I型皰疹病毒(HSV-1)主要 感染腰以上部位的皮膚黏膜和器官，HSV-1主要通過呼吸道、皮膚和黏膜密切 接觸傳播，99%的口唇黏膜、鼻前庭、眼結膜、咽喉部的炎症及皰疹，口和口 周圍發生的皰疹都是由I型皰疹病毒感染引起的。II型皰疹病毒(HSV-2)主 要存在於女性宮頸、陰道、外陰皮膚及男性的陰莖、尿道等處，是引起生殖器 發炎和皰疹的罪魁禍首。
HSV-2病毒經性器官接觸後，潛伏約2-20天(平均6天)，HSV-2感染引 起的生殖器皰疹臨床表現中可分為原發和復發兩種，患病部位先有燒灼感，很 快在紅斑基礎上發生3-10個成群的紅色丘疹，伴有瘙癢，丘疹很快變成小水 皰，3-5天後變為膿皰，破潰後形成大片的糜爛和潰瘍，自覺疼痛，最後結痂 癒合。整個病程可持續20天左右。男性好發於龜頭、冠狀溝、尿道口、陰莖、 陰囊、大腿和臂部等處。女性好發於陰唇、陰阜、陰蒂、肛周或陰道。約90% 的病人，病毒可同時侵犯子宮頸，出現陰道分泌物增多或下腹痛，並可並發宮 頸炎和子宮炎。大多數男女病人雙側腹股溝淋巴結腫大。後期炎症波及尿道、 膀胱時，可出現排尿困難、尿痛、尿頻、嚴重者可發生尿瀦留等現象。此外， 被感染者還可能有其它症狀同時出現，如發熱、全身不適、頭痛、頸項強直、腦膜炎和骶部神經系統功能不全。
生殖器皰疹病毒與生殖器惡性腫瘤關係密切，引起生殖器皰疹的II型皰疹 病毒可能是宮頸癌的潛在致癌因子。研究發現，患過生殖器皰疹的婦女比未患
過者得宮頸癌的危險性大5~10倍，並且，在宮頸癌組織、剝脫細胞或癌前期 細胞中發現了 II型皰疹病毒特異抗原，從而表明II型皰疹病毒在宮頸癌的發 生過程中起了重要作用。另外，從陰莖癌病人的活檢材料中也觀察到單純皰疹 病毒樣顆粒。此外，近年來人們也注意到孕婦與II型皰疹感染的嚴重性。對妊 娠的患者或無症狀攜帶者來說，最嚴重的是傳染給新生兒，孕婦患生殖器皰疹 可導致胎兒畸形、流產、死產。
對HSV-2感染引起的病毒性疾病目前尚無特效治療方法，臨床上主要的 治療措施為採用阿昔洛韋等抗病毒藥物。此外，人白細胞幹擾素也可抑制病毒 繁殖，減少生殖器皰疹的復發率。然而，使用此類激素類藥品、抗菌素類藥品 存在較大的毒副作用和易使病人產生耐藥性以及菌群失調等不足之處。
中醫將II型單純性皰疹病毒感染疾病稱為"陰瘡"，其病性早期屬熱證、 實證，為溼熱、毒火阻滯肝脈；後期則伴有肝腎不足。中藥外用藥可用包括外 用1%氯鋅油，紫草油等方法，但治療效果不十分理想；常用方藥為清毒神聖 湯加減、牛黃解毒丸、六味地黃丸加減和龍膽瀉肝湯等，但對本病症無顯著的 針對性。
因此，應用現代病毒藥理學技術、利用現代藥物化學之設計、合成、分離、 純化手段，尋找創新性的先導化合物骨架，開發出新的能夠避開核苷類抗病毒 藥物的副作用並能有效治療II型單純皰疹病毒感染暨防治生殖器皰疹的藥物 是十分必要的。
黃酮木脂素化合物屬於雜木質素類，是由一分子苯丙素和一分子黃酮結合 而成的一類含有C6-C3-C6-C3-C6結構單元的天然產物。其代表性化合物當屬 存在於菊科植物水飛薊的種子中的木質素二氫黃酮醇水飛薊賓。水飛薊已在臨 床上廣泛應用，在市場上其商品名為Legalon11^ (利肝隆)或Flavobion^。三 十多年的臨床實驗證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱FloraK.等人，Am. J. Gastroenterol, 1998， 93， 139-143; Sailer R.等人，Drugs, 2001， 61(14)， 2035-2063)。因此，以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素類化合物引起了越來越 多的關注，如本發明人製備出的一系列水飛薊賓類衍生物也具有強效的抗氧化 活性(楊雷香，趙昱等，"Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of Novel Silybin Analogue", Jow/7 a/ o/五"2^附e MWc/"a/ C7 e附z's^y, 2006，21(4), 399-404.)。
水飛薊賓類化合物具有以上所述的多種確切療效，然而其於抗病毒方面包括抑制單純皰疹病毒的新用途尚未得到有效開發，故此我們設計並製備出了 23位以乙二酸酯取代的水飛薊賓類新的酯類衍生物，並測試了其抑制II型單純皰疹病毒HSV-2複製的藥理活性，以期最終獲取能夠有效抑制該病毒感染之自主智慧財產權的新藥。試驗結果發現合成得到的木質素二氫黃酮醇類化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3- 二氫-3,5,7-三羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2,3-二氫-1,4-苯並二氧六環-2]-甲基乙酯對118￥-2病毒株具有確切的抑制活性，可以作為防治II型單純性皰疹病毒感染疾病之藥物先導化合物繼續開發，從而完成本發明。
發明內容
本發明的目的在於提供一種具有抑制II型單純皰疹病毒HSV-2複製、防
治生殖器皰疹病毒感染疾病的活性化合物。具體而言，本發明提供了一種具有
式(1)所示結構的水飛薊賓23-酯類衍生物及其可藥用鹽。
formula see original document page 6
其中OEt是指乙氧基(OCH2CH3)
formula see original document page 6 式(1)
B環上所聯之二氧六環上10， ll位之取
代基互為反式構型，也即C-10和C-l 1位構型同時是R構型或同時是S構型。
本發明的又一個目的是提供了式(i)化合物用於製備防治由n型單純皰
疹病毒HSV-2引發的生殖器皰疹和/或生殖器炎症藥物的用途。
本發明的另一個目的是提供了一種用於防治由II型單純皰疹病毒HSV-2引發的生殖器皰疹和/或生殖器炎症的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(1)化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。根據本發明，該藥物組合物中可加入各種藥學上可接受的藥用賦形劑，添加劑及載體。
本發明的再一個目的是提供一種合成該水飛薊賓23-酯類衍生物的製備方法，該化合物的製備是通過如下反應式實現formula see original document page 7水飛薊賓
偶氮二甲酸二 酯，三苯基膦
溶劑
HO
乙基丙二酸
OEt
HO
OEt
OCH
OH O
式(1)
其中，偶氮二甲酸二酯選自二甲酯，二乙酯，二丙酯，二異丙酯或二丁酯中的 一種或多種，溶劑選自四氫呋喃，二甲亞碸，二甲基甲醯胺中的一種或多種， 反應溫度為室溫至回流，水飛薊賓:乙基丙二酸:偶氮二甲酸二酯:三苯基膦的摩 爾比=1:1~3:1~3:1~3，反應時間0.5~20小時。
本發明的有益之處在於半合成製備了 23位乙基丙二醯基取代的水飛薊 賓化合物，並通過藥理實驗證明其在開發防治HSV-2病毒感染藥物領域中的 潛力，對於開發抗生殖器皰疹創新型藥物提供了新的物質基礎，具有潛在的社 會效益和經濟效益。本發明再一特點為該化合物來源於天然藥物的半合成改 造，原料來源方便易得，製備步驟簡便，成本低，汙染小，利於節能減排條件 下的大規模開發。
具體實施例方式
下面通過實施例進一步說明本發明。實施例給出了丙二酸[3-(4-羥基-3-甲 氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3,5,7-三羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯並二氧 六環-2]-甲基乙酯的製備方法及其相關結構鑑定的數據，其中OEt是指乙氧基 (OCH2CH3)。必須說明，實施例中所述的製備方法是用於對本發明的說明而 不是對本發明的限制。
實施例l:式(1)化合物丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3， 羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2,3-二氫-l，4-苯並二氧六環-2]-甲基乙酯的製備
7formula see original document page 8 式(1)
在乾燥的反應瓶中加入1克水飛薊賓，0.56克乙基丙二酸和1.6克三苯基 膦，用20毫升無水四氫呋喃溶解，加入1克偶氮二甲酸二乙酯，加完後於室 溫攪拌10小時，減壓蒸餾除去溶劑，加入5毫升氯仿，過濾除去白色固體， 母液經柱層析，得淺黃色粉末0.46克，收率37%。 Rf (氯仿醋酸乙酯乙 酸=50:1:0.25): 0.11;核磁共振氫譜'H NMR (400 MHz,氖代氯仿)&1.28 (三重峰，J = 7.2 Hz， 3H, C//3), 3.41 (單峰，2H, COC/f2CO), 3.76 (單峰，3H， OC//3), 4.08 (多重峰，1H， H-23a), 4.22 (多重峰，2H， H-3， 10), 4.36 (多重峰，1H， H隱23b), 4.90 (雙峰,J =7.6 Hz, 1H, H-ll)， 4.98 (雙峰,J =10.8 Hz， 1H， H-2)， 5.99 (單峰，1H， H-6), 6.07 (單峰，1H， H-8)， 6.82-8.25 (多重峰，9H,芳香環Ar-H), 11.19 (單峰，1H, 5-OH);電噴霧質譜ESI-MS: 595 (M—1)+。
實施例2:式(1)化合物的製備
在乾燥的反應瓶中加入1克水飛薊賓，0.56克乙基丙二酸和1.8克三苯基 膦，用20毫升無水二甲基甲醯胺溶解，加入1.2克偶氮二甲酸二甲酯，加完 後回流4小時，減壓蒸餾除去溶劑，加入5毫升氯仿，過濾除去白色固體，母 液經柱層析，得淺黃色粉末0.42克，收率34%。
其Rf值、核磁共振氫譜及電噴霧質譜數據與實施例1中產物所測得值相同。
本發明的又一特點是，經藥理實驗證明半合成得到的式(1)化合物對 II型單純皰疹病毒HSV-2複製有確切的抑制作用，其半數抑制濃度IC5o值為 55.74微克/毫升。說明該化合物有望發展為防治由II型單純皰疹病毒HSV-2 引發的生殖器皰疹病毒感染之先導化合物及藥物。
本發明中製備得到的式(1)化合物或其可藥用鹽用製藥領域中的常規方 法，結合中、西藥製藥中常規的可藥用輔料，可以製成各種藥物組合物，如注 射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑，或控釋或緩釋劑型或納米製劑。這些藥物組合物可以用於防治由II型單純皰疹病毒HSV-2 引發的生殖器皰疹和/或生殖器炎症。
本發明的式(1)化合物或其可藥用鹽還可以與現已上市的治療單純皰疹 病毒HSV-2感染常用藥物聯合或交叉使用，製備得到具有治療單純皰疹病毒 HSV-2感染和生殖器皰疹或炎症的藥物組合物或複方製劑。可組合的藥劑例子 包括阿昔絡韋ACV、人白細胞幹擾素等。此外，其還可以與神經痛鎮痛藥物 以及解熱鎮痛藥物合併用藥。上述各類藥物組合物或者複方製劑同樣可以採用 片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑等劑型，包括採用現已 公認的藥劑學常識經由常規製備而得的各種緩釋、控釋劑型或納米製劑。
為了更好地理解本發明的實質，本發明還通過下列藥理相關實施例的方式 說明式(1)化合物對單純皰疹病毒HSV-2抑制作用的藥理實驗結果。實驗結 果說明該化合物在抗單純皰疹病毒HSV-2的藥物研究領域中的用途；本發明 人還測試了其對Vero細胞的半數細胞毒活性數據TD5，用以說明該化合物的 毒性，從而評價其治療指數(TI)。同樣必須說明，本發明的藥理相關實施例 仍是用於說明本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行 的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。
實施例3:微量細胞病變抑制(CPE)法研究式(1)化合物對單純皰疹病毒 HSV-2的抑制作用 3.1實驗目的
以HSV-2病毒感染的Vero細胞為模型，篩選抗HSV藥物，其中樣品來 自實施例1中製得的式(1)化合物樣品。 3.2材料
3.2.1病毒和細胞
3.2丄1病毒HSV-2病毒由浙江大學藥學院中藥與天然藥物研究室提供； 3.2丄2細胞Vero細胞購自中科院上海細胞生物學研究所。 3.2.2試齊IJ
3.2.2.1 RPMI 1640培養基Gibco公司產品；
3.2.2.2 L-谷胺醯氨AMRESCO產品，上海生工生物工程技術服務有限公司 分裝；
3.2.2.3 MTT: AMRESCO產品，上海生工生物工程技術服務有限公司分裝； 3.2.2.4胎牛血清Gibco公司產品；3.2.2.5青黴素鈉江西東風藥業股份有限公司產品； 3.2.2.6硫酸鏈黴素華北製藥股份有限公司產品；
3.2.2.7陽性對照藥阿昔洛韋(ACV)，湖北科益藥業股份有限公司，0.25g/ 支。
3.2.3儀器
3.2.3.1 C02培養箱美國Shellab公司產品；
3.2.3.2 XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司產品； 3.2.3.3生物安全櫃美國LABCONCO公司產品；
3.2.3.4 Synergy HT酶標儀美國BIO-TEK公司產品；
3.2.3.5 LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠產 3.3方法
3.3.1病毒毒力測定在長成單層的細胞中加入10倍連續倍比稀釋的病毒液， 從10"到10一等共9個濃度，在37"C， 5%二氧化碳，100%相對溼度條件下培 養48小時，然後用MTT法比色，測定病毒的毒力，以TCID5Q表示。 3.3.2樣品毒性測定用培養基將藥物連續稀釋成4個濃度(100微克/毫升， 10微克/毫升，l微克/毫升)，分別加入細胞已長成單層的96孔培養板中， 每孔200微升，置於37'C, 5%二氧化碳，100%相對溼度的培養箱中培養，培 養72小時後用MTT法測定樣品對細胞的毒性，計算半數中毒濃度(TD5)。 3.3.3細胞病變抑制法測定樣品對病毒生長抑制作用
細胞接種96孔培養板，37°C， 5%二氧化碳，100%相對溼度培養24小時， 加入2X100 TCID5。的病毒IOO微升，吸附2小時，傾出病毒，分別加入最大 濃度為無毒濃度的不同濃度樣品，每濃度3孔，同時設正常細胞對照和病毒感 染對照，37°C， 5%二氧化碳，100%相對溼度培養72小時後在倒置顯微鏡下 觀察細胞病變。以五級標準作為判斷細胞病變的標準_:細胞無變化，分值 為8分；+: 25%以下細胞出現病變，分值為6分；+ + : 25。％ 50%細胞出 現病變，分值為4分；+ + + : 50% 75%細胞出現病變，分值為2分；+ + + + : 75%以上細胞出現病變，分值為O分。
3.4實驗結果結果如表一顯示，丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫 -3，5,7-三羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯並二氧六環-2]-甲基乙酯能顯 著抑制HSV-2病毒的複製，其對HSV-2病毒複製的半數抑制濃度和治療指數如表所示。
表一.式(1)化合物對HSV-2的抑制作用
樣品TD50 (微克/毫升)ic50 (微克/毫升)TI (治療指數)
式(1)化合物 陽性對照藥(阿昔洛韋)>400 〉40055.74 0.21>7.2 >1867
注TD5o:樣品對細胞生長的半數抑制濃度(微克/毫升)；IC5Q:樣品對病毒復 制的半數抑制濃度(微克/毫升)；TI:治療指數，TI=TD50/IC5。
3.5結論
上述試驗結果說明，式(1)化合物即丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯 基)-6-(2，3-二氫-3，5,7-三羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2，3-二氫-l,4-苯並二氧六環 -2]-甲基乙酯對II型單純皰疹病毒HSV-2有確切的抑制作用，雖然其對HSV-2 的抑制強度低於陽性對照藥阿昔洛韋，仍可以預期其進一步完善開發成為治療 生殖器皰疹疾病的天然藥物，或與已上市之治療HSV-2病毒感染藥物聯合使 用。
在上述說明書闡述本發明時，同時提供了實施例和藥理實施例的目的是舉 例說明本發明的實際操作過程和本發明的意義。在進入本發明權利要求和其等 同物範圍內時，本發明的實際應用包括所有一般變化、配合，或改進。
權利要求
1. 一種具有式(1)所示結構的23位乙基丙二醯基取代的水飛薊賓衍生物或其可藥用鹽；式(1)化合物的名稱為丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯並二氧六環-2]-甲基乙酯；式(1)其中OEt是指乙氧基；B環上所聯之二氧六環上10，11位之取代基互為反式構型，也即C-10和C-11位構型同時是R構型或同時是S構型。
2.權利要求1中所述式(1)化合物的製備方法，其特徵為式(1)所示之化 合物是由水飛薊賓與乙基丙二酸在三苯基膦和偶氮二甲酸二酯存在下反應得 到；其中OEt是指乙氧基。formula see original document page 2偶氮二甲酸二 酯，三苯基膦 式(1)
3.根據權利要求2的製備方法，其中偶氮二甲酸二酯選自二甲酯，二乙酯， :丙酯，二異丙酯或二丁酯中的一種或多種；溶劑選自四氫呋喃，二甲亞碸，二甲基甲醯胺中的一種或多種；反應溫度為室溫至回流；水飛薊賓:乙基丙二 酸:偶氮二甲酸二酯:三苯基膦的摩爾比=1:1 3:1~3:1~3;反應時間0.5~20小時。
4. 式(1)所示化合物或其可藥用鹽用於製備治療由II型單純皰疹病毒HSV—2 引發的生殖器皰疹和/或生殖器炎症藥物的用途。
5. —種用於防治由II型單純皰疹病毒HSV-2引發的生殖器皰疹和/或生殖器 炎症的藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2,3-二氫-3,5,7-三羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2，3-二氫-l,4-苯並二 氧六環-2]-甲基乙酯或其可藥用鹽和可藥用輔料。
全文摘要
本發明涉及一個乙基丙二醯基取代水飛薊賓及其製備方法和藥物用途。具體而言，本發明涉及23位乙基丙二醯基取代的水飛薊賓酯類衍生物，以及該化合物的製備方法和該化合物在製備抗病毒藥物的中的應用。該化合物名稱為丙二酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯並吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯並二氧六環-2]-甲基乙酯；該化合物由化學方法半合成製備而得，經藥理實驗證明，其對II型單純皰疹病毒HSV-2有確切的抑制作用。因此該化合物或其可藥用鹽可以預期用於製備治療由HSV-2病毒引發的生殖器皰疹和/或生殖器炎症藥物的用途。
文檔編號C07D407/00GK101475566SQ200910096040
公開日2009年7月8日 申請日期2009年2月2日 優先權日2009年2月2日
發明者皞 姜, 巫秀美, 李校堃, 李海波, 峰 汪, 佳 瞿, 昱 趙, 鄒宏斌, 郝小江, 黃可新, 龔景旭 申請人:溫州醫學院;李校堃