肝炎病毒體外培養模型及其構建方法與應用的製作方法

2023-09-22 11:49:00 1

專利名稱：肝炎病毒體外培養模型及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及體外培養模型及其構建方法與應用，尤其是肝炎病毒體外培養模型及 其構建方法與應用。
背景技術：
眾所周知，B型肝炎病毒(HBV)是引起肝臟疾病的最主要原因之一，全球大約有 3. 5億人是慢性HBV攜帶者，嚴重的可導致肝硬化、原發性肝癌。病毒性B型肝炎流行面廣， 傳染性強，是世界上最常見的感染性疾病之一，人一旦被B肝病毒感染，肝臟就會發生炎性 病變，肝細胞受損，對人體造成極大的危害，因此研究HBV的發病機制及其防治方法具有重 要的意義。研究HBV生物學特性、B型肝炎發病機制、體外抗HBV藥物篩選及其防治方法的重 要環節之一就是要建立方便有效的HBV體內外培養模型。現在用於研究HBV的動物培養體 內模型，主要有靈長類、樹駒、鴨和應用最多的轉基因小鼠模型及人鼠嵌合肝模型；建立模 型的細胞包括成人肝細胞、胎肝細胞、HepRG細胞系及以H印G-2為基礎的轉基因細胞。動 物模型雖然能模擬體內HBV感染過程，但是仍存在HBV複製表達水平不高，種間差異及免 疫缺陷等問題。而建立的細胞培養體外模型，由於均存在不同程度的局限性，因而仍然沒 有合適理想的模型，如成人肝細胞是一類終末分化的細胞，不能傳代培養，且在肝細胞鋪板 後，成熟肝細胞的功能如白蛋白產生能力下降、失去典型多角形態，對病毒敏感性也逐漸下 降，因此限制其實際應用；胎肝細胞也終究因為不能傳代培養而在應用中受到制約；HepRG 細胞系模型不僅不能獲得完整的HBV顆粒，而且難以去除添加物對HBV感染過程的可能 影響；而在目前應用最廣的以H印G-2為基礎的H印G2. 2. 15轉基因細胞中，由於HBV整合 在宿主細胞染色體上且不能被清除，因而其複製方式與自然感染不同，細胞培養中不產生 cccDNA(複製中間體)，病毒複製水平低，另外，HBV與轉染肝癌細胞長期穩定的整合狀態難 以用於研究細胞的轉化機制。此夕卜，人們還探討了 HBV感染的非肝源性細胞，並且，越來越多的研究表明，HBV不 僅感染肝源性細胞，也可以感染其它如骨髓幹細胞、內皮祖細胞、胎盤滋養層細胞等具幹細 胞特性的細胞，但是，由於HBV不能或很難在這些細胞中複製繁殖，且這些細胞為非肝臟源 細胞，HBV感染機制可能不同，因此仍然不能用於建立理想的細胞培養模型。C型肝炎病毒(HCV)也呈全球性流行，根據世界衛生組織的統計，HCV在人群中的 感染率約為3%，全球約有1. 7億人感染HCV，每年新發病型肝炎病例約3. 5萬例。我國進 行的全國HCV血清流行病學調查顯示，我國一般人群抗HCV陽性率為3. 2%，約有4000萬人 感染HCV。HCV是引起人類慢性肝炎和輸血後肝炎的主要病原體之一，約60%的急性丙型肝 炎患者轉化為慢性，而慢性患者中分別有8-46%和11-19%發展成肝硬化和肝細胞癌。由於HCV在被感染組織和血清中濃度較低，HCV的高度變異，缺乏穩定的HCV體外 細胞培養系統及理想的實驗動物模型等問題，阻礙了對HCV的進一步研究。除人之外，黑猩 猩是目前報導的唯一可以感染HCV的實驗動物，由於來源不便，耗資巨大，使其應用受到限
3制。到目前為止，以幹擾素為主的抗病毒治療只能使30%左右的患者得到根治，尚未 發現令人滿意的治療藥物和有效疫苗。因此，迫切需要尋找預防和治療HCV感染的有效方 法。而其關鍵是建立穩定的維持病毒複製和傳代的細胞模型，以深入了解C肝病毒的生命 周期和發病機理。HCV體外細胞培養模型研究現狀是1肝源細胞模型，即包括原代肝細胞、胎肝細 胞，但因為其複製水平低，也不穩定，不能滿足藥物篩選研究的要求；肝癌細胞系則不能用 於感染機制的研究。2HCV基因組轉染模型包括Huh-7細胞轉染HCV JFH-I RNA、胎肝細胞 轉染無適應性突變的HCV RNA但缺陷在於僅HCV 2a、Ia型可傳代培養，細胞培養所分泌的 病毒顆粒較之動物實驗高同質性和低感染性。3肝外細胞模型包括人淋巴細胞、纖維母細 胞、單核白血病細胞、膽管癌細胞、T細胞系、PBMC但病毒感染非肝細胞的方式和途徑是否 與體內感染肝細胞相似，且在非肝細胞中長期培養的HCV，其生物學特性是否發生改變迄今 尚不清楚。胎肝幹細胞(h印atic stem cell, HSC)是胎兒體內存在的一種具有自我增殖能 力和多向分化潛能的肝源性幹細胞，既可以向膽管細胞分化，又可向肝細胞分化。它並非 特指某一種類的細胞，而是由與肝臟胚胎發育及再生有關的各類具有幹細胞特性的細胞組 成，如肝臟在胚胎期出現的胎肝幹細胞及成肝細胞(哺乳動物胚胎發育早期階段肝內的幹 細胞，它同時表達肝細胞表型和膽管細胞表型，後兩者又可進一步分化成為成熟肝細胞和 膽管細胞)、成年肝臟內存在的兼性肝細胞及其子代細胞卵圓細胞等。肝幹細胞作為治療肝 髒相關疾病的一種細胞來源，對肝的細胞移植，組織工程和基因治療等有很重要的作用。截至目前，尚未見利用人胎肝幹細胞構建HBV、HCV體外培養模型的報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供肝炎病毒體外培養模型。本發明所要解決的另一技術問題在於提供上述肝炎病毒體外培養模型的構建方 法。本發明所要解決的另一技術問題在於提供上述肝炎病毒體外培養模型的應用。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是肝炎病毒體外培養模型，是採用人胎肝幹細胞構建而成的，包括分離培養人胎肝 幹細胞、免疫組化鑑定人胎肝幹細胞、肝炎病毒血清感染人胎肝幹細胞、驗證肝炎病毒已感 染人胎肝幹細胞且病毒已繁殖。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型，所述肝炎病毒為B肝病毒或C肝病毒或丁 型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型，所述人胎肝幹細胞是與肝臟胚胎發育及再 生有關的各類具有幹細胞特性的細胞。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型，所述人胎肝幹細胞包括卵圓細胞、成肝細 胞、兼性肝細胞、小肝細胞、肝側群細胞或肝前體細胞。肝炎病毒體外培養模型的構建方法，採用人胎肝幹細胞用於構建肝炎病毒體外培 養模型，包括人胎肝幹細胞的分離培養、鑑定人胎肝幹細胞、肝炎病毒血清感染人胎肝幹細胞、驗證肝炎病毒已感染細胞且病毒已繁殖並持續性分泌到細胞外。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型的構建方法，具體步驟為I.分離培養人胎肝幹細胞(1).胎肝幹細胞的分離培養將膠原酶原位灌注肝臟_剝離肝細胞懸液_過 濾_充分散開細胞_離心細胞懸液_棄掉上清液_沉澱的細胞用培養基懸浮_將細胞放入 離心管中_置於冰上沉澱_利用肝幹細胞黏附作用使細胞沉澱_去除細胞懸液_離心沉 澱細胞_細胞用PBS液懸浮-用PBS液將Percoll按體積分數配成30% -90%的濃度梯 度_離心並吸取位於不同Percoll之間細胞層懸浮沉澱的細胞-接種於塑料培養瓶中，培 養基為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液-並在37°C、5% CO2孵箱中培養過夜，新分離 的細胞用0. 25%臺盼藍染色觀察細胞活力；(2).胎肝幹細胞的培養與傳代細胞接種18h後首次更換培養液，棄去未貼壁細 胞，以後每3-5天換液1次。兩周後細胞數量成對數生長，形成小細胞克隆，四周後，小克隆 逐漸增多，鋪滿瓶底，質量分數0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1 2比例傳代。II.免疫組化鑑定人胎肝幹細胞採用SP免疫組化試劑盒檢測AFP、0V_6、CK19、 CD34、CK18表面標誌，以PBS代替各表面標誌的一抗作為陰性對照，步驟如下消化細胞後 低速離心，PBS懸起細胞-接種於蓋玻片上-通風晾乾-PBS充分洗滌-抗原熱修復-PBS洗 滌多次後呈紅棕色染色為陽性_蘇木素復染；III.肝炎病毒高拷貝陽性血清感染人胎肝幹細胞將肝炎病毒血清接種到無血 清培養液的六孔板胎肝幹細胞中；孵育後，吸取上清液，採用培養液培養細胞，每隔48h取 上清即可獲得肝炎病毒。IV.採用以下一種或幾種方法驗證肝炎病毒已感染人胎肝幹細胞且繁殖(1).螢光定量PCR檢測不同時間細胞上清的病毒滴度；(2). ELISA檢測不同時間細胞上清中病毒抗原分泌情況採用肝炎病毒抗原檢測 試劑盒對不同時間細胞上清進行病毒表面抗原或核心抗原的檢測；(3).原位雜交檢測細胞內病毒將感染病毒的細胞，於病毒洗去後第三天和第七 天進行生物素(POD)和螢光探針標記原位雜交。操作時可採用上述三種方法反覆驗證肝炎病毒已感染人胎肝幹細胞且繁殖並持 續性分泌到細胞外。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型的構建方法，所述肝炎病毒為B肝病毒或丙 肝病毒或丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型的構建方法，所述人胎肝幹細胞是與肝臟胚 胎發育及再生有關的各類具有幹細胞特性的細胞。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型的構建方法，所述人胎肝幹細胞包括卵圓細 胞、成肝細胞、兼性肝細胞、小肝細胞、肝側群細胞或肝前體細胞。肝炎病毒體外培養模型的應用，採用上述肝炎病毒體外培養模型用於體外抗肝炎 病毒藥物的篩選與效果評價。具體操作為將穩定生長的人胎肝幹細胞接種六孔板中24h後，將其與上述肝炎病 毒體外培養模型的肝炎病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗後液待檢；分別加 入200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml的抗病毒藥物，與不加抗肝炎病毒藥物組做陽性對照，不加病毒及抗肝炎病毒藥物組作陰性對照，每組重複三孔，37°C孵育，3天後取上 清，螢光定量PCR和電泳檢測肝炎病毒的繁殖抑制情況。也可以將穩定生長的人胎肝幹細胞與上述肝炎病毒體外培養模型的子代肝炎病 毒進行孵育，其他步驟同上，從而進行體外抗肝炎病毒藥物的篩選與效果評價。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型的應用，所述模型中人胎肝幹細胞是與肝臟 胚胎發育及再生有關的各類具有幹細胞特性的細胞。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型的應用，所述模型中人胎肝幹細胞包括卵圓 細胞、成肝細胞、兼性肝細胞、小肝細胞、肝側群細胞或肝前體細胞。優選的，上述肝炎病毒體外培養模型的應用，所述體外抗肝炎病毒藥物包括化學 藥物、中草藥、生物工程藥或幹擾素。本發明的有益效果是所述肝炎病毒體外培養模型，人胎肝幹細胞可感染肝炎病毒並持續性的分泌肝炎 病毒，因而該模型可用於體外抗肝炎病毒藥物的篩選與效果評價且方法簡便，重複性好 』人 胎肝幹細胞可以傳代培養，因而大大擴大其應用。


圖1是本發明實施例1的方法流程示意圖；圖2是人胎肝幹細胞不同培養時間細胞形態示意圖；其中A為剛分離胎肝幹細胞(40 X)示意圖；B為剛分離胎肝幹細胞(100X)示意圖；C為臺盼藍染色(40 X)示意圖；D為HE染色(200 X)示意圖；E為培養1周後胎肝幹細胞(100X)示意圖；F為培養1周後胎肝幹細胞(200X)示意圖；G為分離培養2周後胎肝幹細胞(100X)示意圖；H為分離培養4周後胎肝幹細胞(100X)示意圖；I為傳代培養5天細胞(100X)示意圖；J為傳代2周後細胞(100X)示意圖；圖3是人胎肝幹細胞不同表面標誌物的免疫細胞化學染色(X200)示意圖。其中A 為 AFP ；B 為 0V-6 ；C 為 CD34 ；D 為 CK18 ；E 為 CK19 ；F為陰性對照。圖4是檢測細胞內HBV DNA的原位雜交(200 X)示意圖。其中A、B為感染3d後的細胞；C、D為感染7d後細胞；E、F為陰性對照；A、C、E為生物素標記；B、D、F為螢光標記。圖5是不同濃度幹擾素(IFN)作用HBV後HBV DNA的PCR產物電泳示意圖。其中，1. 200IU IFN ；2. 500IU IFN ；3. 1000IU IFN ；4. 2000IU IFN ；5.感染組對照組；6.陰性對照；M. DL2000Markero
6
圖6是本發明實施例3的方法流程示意圖。
具體實施例方式為了使本領域的技術人員更好的理解本發明的技術方案，下面結合具體實施方式
及附圖對本發明所述技術方案作進一步的詳細說明。實施例1構建肝炎病毒體外培養模型如圖1-圖4所示I.分離培養人胎肝幹細胞(1).胎肝幹細胞的分離培養將膠原酶原位灌注肝臟，待肝臟呈灰白色時停止灌 注，小刮刀小心剝離肝細胞懸液，經100目篩網過濾，吸管吹打使細胞充分散開。細胞懸液 經D-Hank，s液2000r/min，4°C離心5min。棄掉上清液，沉澱的細胞用2ml DMEM培養基懸 浮，加入 50ml 含 0. Pronase E 和 0.005% DNaseI 的 DMEM 培養基，37°C、5% C02 培養 30min。然後將細胞轉移至離心管中，置於冰上沉澱20min，利用肝幹細胞黏附作用使細胞 沉澱。去除細胞懸液，沉澱細胞經4°C、2000r/min離心lOmin。細胞用PBS液懸浮。用PBS 液將Percoll按體積分數配成30% -90%的濃度梯度，經4°C、10000r/min離心30min，吸取 位於50%與70% Percoll之間細胞層。2ml DMEM/F12懸浮沉澱的細胞，接種於0. 25%明 膠處理塑料培養瓶中，培養基為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，並在37°C、5%C02孵 箱中培養過夜。細胞接種18h後首次更換含10%FBS、10ng/ml SCFUOng/ml HGF、20ng/ml EGFUOng/ml LIFf及1 μ g/ml胰島素的DMEM/F12培養液，棄去未貼壁細胞。以後每3_5天 換液1次。新分離的幹細胞用0. 25%臺盼藍染色觀察細胞活力。顯微鏡下可見細胞大小均 勻，光亮而透明，細胞核質比大，細胞直徑為10-15 μ m,核為圓形或卵圓形，呈鵝卵石形態 (如圖2A，B所示)，Trypanblue染色細胞平均活性率為90% (如圖2C所示)，常規HE染 色核較大(如圖2D所示)，胞漿少，細胞形態均一。繼續培養發現該細胞生長相對緩慢，接 種培養瓶24h後半貼壁狀態，培養3-10d後細胞體積才有所增大(如圖2E，F所示)，細胞 增殖明顯活躍，原代連續培養兩周後細胞呈集落樣生長，排列成葡萄狀(如圖2G所示)；培 養一個月後，細胞的克隆增大，克隆數逐漸增多(如圖2H所示)，胰酶消化1 2傳代，傳代 後細胞成克隆生長(如圖21，J所示)，隨著傳代，細胞逐漸脫落，但仍然可見小克隆。(2).胎肝幹細胞的培養與傳代細胞接種18h後首次更換含10% FBSUOng/ml SCF(人幹細胞生長因子)、10ng/ml HGF(人肝細胞生長因子)、20ng/ml EGF(表皮生長因 子)、10ng/ml LIF(人白血病抑制因子)及1 μ g/ml胰島素的DMEM/F12培養液，棄去未貼 壁細胞。以後每3-5d換液1次。兩周後細胞數量成對數生長，形成小細胞克隆，四周後，小 克隆逐漸增多，鋪滿瓶底。質量分數0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1 2比例傳代。II.免疫組化鑑定人胎肝幹細胞採用SP免疫組化試劑盒檢測AFP、0V_6、CK19、 ⑶34、CK18表面標誌，以PBS代替一抗作為陰性對照，操作步驟如下(1).消化細胞後低速離心，PBS懸起細胞，取100 μ 1接種於蓋玻片上，通風晾乾， 95%酒精室溫固定15min ；(2). PBS充分洗滌後，以30ml/L過氧化氫溶液浸泡IOmin滅活內源性過氧化物 酶；(3).抗原熱修復後，PBS洗三次，5min/次，以正常山羊血清室溫封閉30min ；
(4).甩幹，加第一抗體(AFP、CK19、CD34、0V-6)PBS 1 100 稀釋 4°C過夜;(5). PBS洗三次，5min/次，加生物素標記的第二抗體37°C 45min ；(6). PBS洗三次，5min/次，加結合過氧化物酶鏈黴親和素37°C 45min ；(7). PBS洗三次，5min/次，加新鮮配製的DAB，顯微鏡下觀察5-lOmin紅棕色染色 為陽性；(8).蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯色結果表明，新分離的人胎肝幹細胞AFP、CK19、CK18、0V_6、⑶34均為陽性染 色，其中胎肝細胞標誌AFP和肝卵圓細胞標誌0V-6、CK18表達較強，陽性細胞胞漿呈棕紅 色，⑶34也有表達，胞漿紅棕色染色相對較少，CK19陽性細胞染色較弱(如圖3A-F所示)。III. HBV高拷貝陽性血清感染人胎肝幹細胞將HBV(107-108CopieS)血清IOOul 接種到Iml DMEM/F12培養液(無血清)的六孔板細胞中；37°C孵育24h後，吸取上清液，採 用DMEM/F12培養液(10% FBS)培養細胞，每隔48h取上清即可獲得HBV，可連續取樣5次。IV.驗證B肝病毒已感染人胎肝幹細胞且繁殖並持續性分泌到細胞外採用螢光定量PCR檢測不同時間細胞上清的病毒滴度。(1). DNA提取採用B肝病毒核酸定量檢測試劑盒提取DNA並保存於-20°C，陰陽 性質控樣品經同樣處理後備用。(2).螢光定量PCR擴增利用PCR-螢光探針法，採用B肝病毒核酸定量檢測試劑 盒進行螢光定量PCR擴增(杭州博日公司)，具體使用方法參見產品說明書。PCR反應體系PCR反應液37. 7 μ 1 ；Taq酶0. 3 μ 1 ；UDG酶0. 1 μ 1 ；標本液或對照 品或標準品2 μ 1。PCR 反應條件37°C 5min ；93°C 2min ；以下 40 個循環95°C 5s ；60 °C 40s。結果表明各取樣時間點的PBS洗後液中未檢測到病毒；HBV高拷貝血清可感染人 胎肝幹細胞並能在細胞內繁殖，且細胞可持續分泌病毒DNA至上清達10天，且HBV DNA含 量在IO2-IO5Copies之間，第二天最高能達8. 9X 104copies。採用ELISA檢測不同時間細胞上清中病毒HBsAg分泌情況和原位雜交檢測細胞內 病毒分布。採用B肝病毒s抗原檢測試劑盒(英科新創科技有限公司)進行ELISA檢測 (按照試劑盒說明書操作)的結果表明，在細胞上清液中能持續檢測到HBsAg ；採用人HBVDNA生物素標記(POD)和螢光原位雜交雙染色試劑盒(天津灝洋生物 技術公司)於病毒洗去後第三天和第七天進行原位雜交檢測(按照試劑盒說明書操作)的 結果表明，在感染病毒的細胞孔中顯示棕紅色顆粒或綠色螢光信號，未接病毒的細胞孔均 為陰性結果，說明B肝病毒細胞內存在病毒顆粒(如圖4A-F所示)。V.驗證本模型子代HBV肝炎病毒具有感染性本模型子代HBV肝炎病毒感染人胎肝幹細胞感染人胎肝幹細胞將本模型子代 HBV肝炎病毒(IO4-IO5Copies)接種到Iml DMEM/F12培養液(無血清)的六孔板細胞中； 37°C孵育24h後，吸取上清液，採用DMEM/F12培養液(10% FBS)培養細胞，每隔48h取上清 即可獲得HBV，可連續取樣5次。利用上述子代HBV體外感染模型，採用螢光定量PCR檢測不同時間細胞上清的病 毒滴度，結果表明，子代HBV肝炎病毒可感染人胎肝幹細胞並能在細胞內繁殖，且細胞可持DNA檢測值均在102-105COpieS之間，ELISA方法檢 測細胞分泌的HBsAg均呈陽性。採用上述三種方法反覆驗證B肝病毒(包括HBV高拷貝陽性血清和本模型子代 HBV肝炎病毒)已感染人胎肝幹細胞且繁殖並持續性分泌到細胞外。實施例2I. HCV高拷貝陽性血清感染人胎肝幹細胞將HCV(105-107COpieS)血清IOOul接 種到Iml DMEM/F12培養液(無血清)的六孔板細胞中；37°C孵育24h後，吸取上清液，採用 DMEM/F12培養液(10% FBS)培養細胞，每隔48h取上清即可獲得HCV，可連續取樣5次。II.驗證C肝病毒已感染人胎肝幹細胞且繁殖並持續性分泌到細胞外採用螢光定量PCR檢測不同時間細胞上清的病毒滴度法(1). RNA提取採用C肝病毒核酸定量檢測試劑盒提取RNA並保存於-20°C，陰陽 性質控樣品經同樣處理後備用。(2).螢光定量PCR擴增利用PCR-螢光探針法，採用C肝病毒核酸定量檢測試劑 盒進行螢光定量PCR擴增(杭州博日公司)，具體使用方法參見產品說明書。PCR 反應體系RT-PCR MIX 25ul ；Mn2+2. 5ul ；HCV Pribe MIXl. 5ul ；internal Control Iul ；標本液或對照品或標準品20 μ 1。PCR 反應條件90 "C 30S ；61 V 20min ；95 V Imin ；以下 50 個循環95 V 15s ； 600C 60s。結果表明各取樣時間點的PBS洗後液中未檢測到病毒；HCV高拷貝血清可感染人 胎肝幹細胞並能在細胞內繁殖，且細胞可持續分泌病毒RNA至上清達10天，且HCV RNA含 量在IO2-IO5Copies之間，第八天最高能達5. 3X 105copies。ELISA方法檢測細胞分泌的HCeAg均呈陽性。III.驗證本模型子代HCV肝炎病毒具有感染性本模型子代HCV肝炎病毒感染人胎肝幹細胞將本模型子代HCV肝炎病毒 (IO5Copies) IOOul接種到Iml DMEM/F12培養液(無血清)的六孔板細胞中；37°C孵育24h 後，吸取上清液，採用DMEM/F12培養液(10%FBS)培養細胞，每隔48h取上清即可獲得HCV， 可連續取樣5次。利用上述子代HCV體外感染模型，採用螢光定量PCR檢測不同時間細胞上清的病 毒滴度，結果表明，子代HCV肝炎病毒可感染人胎肝幹細胞並能在細胞內繁殖，且細胞可持 續分泌病毒RNA，HCV RNA含量在IO2-IO4Copies之間。其他步驟同實施例1。實施例3如圖6所示，與實施例1的不同點如下I.分離培養人胎肝幹細胞中胎肝幹細胞的分離培養將膠原酶原位灌注肝臟，待 肝臟呈灰白色時停止灌注，小刮刀小心剝離肝細胞懸液，經100目篩網過濾，吸管吹打使細 胞充分散開。細胞懸液經D-Hank’s液2000r/min，4°C離心5min。棄掉上清液，沉澱的細胞 用 2ml DMEM 培養基懸浮，加入 50ml 含 0. 1 % Pronase E 和 0. 005% DNase I 的 DMEM 培養 基，37°C、5% C02培養30min。然後將細胞轉移至離心管中，置於冰上沉澱20min，利用肝幹 細胞黏附作用使細胞沉澱。去除細胞懸液，沉澱細胞經4°C、2000r/min離心lOmin。細胞用 PBS液懸浮。用PBS液將Percoll按體積分數配成30% -90%的濃度梯度，經4°C、IOOOOr/
9min離心30min，吸取位於70%與90% Percoll之間細胞層。2ml DMEM/F12懸浮沉澱的細 胞，接種於0. 25%明膠處理塑料培養瓶中，培養基為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液， 並在37°C、5% C02孵箱中培養過夜。細胞接種18h後首次更換含10% FBSUOng/ml SCF、 10ng/ml HGF、20ng/ml EGFUOng/ml LIFf 及 1 μ g/ml 胰島素的 DMEM/F12 培養液，棄去未貼 壁細胞。以後每3-5天換液1次，而分離出幹細胞。其它各步驟的內容均與實施例1相同。實施例4以幹擾素IFN藥物為準進行體外抗HBV藥物的篩選與效果評價試驗如圖5所示，應用實施例1所述HBV體外培養模型，採用人胎肝幹細胞用於體外抗 HBV藥物的篩選與效果評價是將穩定生長的人胎肝幹細胞接種六孔板中24h後，將其與HBV 病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗後液待檢；分別加入200IU/ml、500IU/ml、 1000IU/ml、2000IU/ml的幹擾素IFN，不加幹擾素組做陽性對照，不加病毒及幹擾素組作陰 性對照，做陽性對照，不加病毒及抗HBV藥物組作陰性對照，每組重複三孔，37°C孵育，3天 後取上清，螢光定量PCR和電泳方法檢測HBV的繁殖抑制情況。結果表明如圖5中1_6，M所示幹擾素可以抑制HBV病毒顆粒在細胞內的複製，且 不同濃度的幹擾素作用顯示不同的抑制效果。這說明成功構建了 HBV體外培養模型並可用 於抗HBV藥物篩選和效果評價。實施例5以幹擾素IFN藥物為準進行體外抗HCV藥物的篩選與效果評價試驗應用實施例2所述HCV體外培養模型，採用人胎肝幹細胞用於體外抗HCV藥物的 篩選與效果評價是將穩定生長的人胎肝幹細胞接種六孔板中24h後，將其與HCV病毒血清 孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗後液待檢；分別加入200IU/ml、500IU/ml、IOOOIU/ ml、2000IU/ml的幹擾素IFN，不加幹擾素組做陽性對照，不加病毒及幹擾素組作陰性對照， 做陽性對照，不加病毒及抗HCV藥物組作陰性對照，每組重複三孔，37°C孵育，3天後取上 清，螢光定量PCR和電泳方法檢測HCV的繁殖抑制情況。結果表明幹擾素可以抑制病毒顆粒在細胞內的複製。這說明成功構建了 HCV體 外培養模型並可用於抗HBV藥物篩選和效果評價。此外，實施例4和實施例5中除採用幹擾素IFN藥物還可以是化學藥物或中草藥 或生物工程藥等。綜上所述，所述肝炎病毒體外培養模型中採用的人胎肝幹細胞可感染乙型、丙型 肝炎病毒並持續性的分泌乙型、C型肝炎病毒；且人胎肝幹細胞可以傳代培養；方法簡便； 重複性好。上述參照具體實施方式
對該肝炎病毒體外培養模型及其構建方法與應用進行的 詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定範圍列舉出若干個實施例，因此在不 脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護範圍之內。
權利要求
肝炎病毒體外培養模型，其特徵在於是採用人胎肝幹細胞構建而成的，包括分離培養人胎肝幹細胞、免疫組化鑑定人胎肝幹細胞、肝炎病毒血清感染人胎肝幹細胞、驗證肝炎病毒已感染人胎肝幹細胞且病毒已繁殖並持續性分泌到細胞外。
2.根據權利要求1所述的肝炎病毒體外培養模型，其特徵在於所述肝炎病毒為B肝 病毒或C肝病毒或丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
3.根據權利要求1所述的肝炎病毒體外培養模型，其特徵在於所述人胎肝幹細胞是 與肝臟胚胎發育及再生有關的各類具有幹細胞特性的細胞。
4.根據權利要求3所述的肝炎病毒體外培養模型，其特徵在於所述人胎肝幹細胞包 括卵圓細胞、成肝細胞、兼性肝細胞、小肝細胞、肝側群細胞或肝前體細胞。
5.權利要求1所述的肝炎病毒體外培養模型的構建方法，其特徵在於採用人胎肝幹 細胞用於構建肝炎病毒體外培養模型，包括人胎肝幹細胞的分離培養、鑑定人胎肝幹細胞、 肝炎病毒血清感染人胎肝幹細胞、驗證肝炎病毒已感染細胞且病毒已繁殖並持續性分泌到 細胞外。
6.根據權利要求5所述的肝炎病毒體外培養模型的構建方法，其特徵在於所述肝炎 病毒為B肝病毒或C肝病毒或丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
7.根據權利要求5所述的肝炎病毒體外培養模型的構建方法，其特徵在於所述人胎 肝幹細胞包括卵圓細胞、成肝細胞、兼性肝細胞、小肝細胞、肝側群細胞或肝前體細胞。
8.權利要求1所述的肝炎病毒體外培養模型的應用，其特徵在於採用上述肝炎病毒 體外培養模型用於體外抗肝炎病毒藥物的篩選與效果評價。
9.根據權利要求8所述的肝炎病毒體外培養模型的應用，其特徵在於所述模型中人 胎肝幹細胞包括卵圓細胞、成肝細胞、兼性肝細胞、小肝細胞、肝側群細胞或肝前體細胞。
10.根據權利要求8所述的肝炎病毒體外培養模型的應用，其特徵在於所述體外抗肝 炎病毒藥物包括化學藥物、中草藥、生物工程藥或幹擾素。
全文摘要
本發明涉及肝炎病毒體外培養模型及其構建方法與應用，所述肝炎病毒體外培養模型採用人胎肝幹細胞構建而成，包括分離培養人胎肝幹細胞、免疫組化鑑定人胎肝幹細胞、肝炎病毒血清感染人胎肝幹細胞、驗證肝炎病毒已感染人胎肝幹細胞且病毒已繁殖並持續性分泌到細胞外，該模型可用於體外抗肝炎病毒藥物的篩選與效果評價，所述肝炎病毒體外培養模型採用的人胎肝幹細胞可感染肝炎病毒並持續性的分泌肝炎病毒；人胎肝幹細胞可以傳代培養；方法簡便；重複性好。
文檔編號C12N5/0735GK101914489SQ20101024584
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月5日 優先權日2009年10月27日
發明者李君文, 王姝, 王新為, 王景峰, 諶志強, 邱志剛, 郭向飛, 金敏, 陳照立 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所