櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法及其試劑盒的製作方法

2023-09-22 04:54:10 3

專利名稱：櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法及其用於該法的試劑盒。
背景技術：
扇貝(scallop)養殖是主導我國貝類養殖甚或整個海水養殖的重要支柱產業，櫛孔扇(Chlamys farrei)又是我國重要的海水養殖扇貝品種，但自1995年以來，櫛孔扇貝連續出現大規模死亡，尤其是1997～1999年期間，扇貝的死亡率達90％以上，有的海區100％死亡，1997年北方養殖櫛孔扇貝死亡面積達33萬畝，造成經濟損失15億元。經查明類立克次氏體(rickettsia-like prokaryote，或稱rickettsia-like organism)是引起它發病的病原，目前，最常規的檢測方法就是採用組織切片光學顯微鏡觀察和超薄切片電子顯微鏡觀察，但這些傳統的方法不僅費時、費力，且最大的缺陷是不能把組織切片中光學顯微鏡觀察到的類立克次氏體的包涵體同超薄切片中電子顯微鏡觀察到的類立克次氏體直觀的對應起來，因而缺乏靈敏度、可信度。血清學檢測方法需要大量純的病原以製備足夠的血清這對尚無法人工培養的類立克次體而言操作煩瑣，而且靈敏度不夠高。最近，在國際上有少量文獻報導利用PCR方法檢測水產養殖動物類立克次氏體感染，這些報導是包括對大扇貝(Pecten maximus)的類立克次氏體和鮑類立克次氏體的PCR檢測，PCR方法雖然操作快速簡單、靈敏度很高、成本低、特異性強，但PCR方法仍然不能直觀的觀察和證明類立克次氏體的包涵體，而且易於因操作中的模板汙染出現假陽性(參考文獻見1.Kellner-Cousin K，Le Gall G，DespresB，et al.Genomic DNA cloning of rickettsia-like organisms(RLO)of Saint-Jacquesscallop Pecten maximusEvaluation of prokaryote diagnosis by hybridization with anon-isotopically labeled probe and by polymerase chain reaction.Diseases of AquaticOrganisms，1993，(15)145-152；2.Andree K B，Friedman C S，Moore J D，et al.A polymerase chain reaction assay for the detection of genomic DNA of arickettsiales-like prokaryote associated with withering syndrome in Californiaabalone.Journal of Shellfish Research，2000，19213-218.)。原位雜交假陽性率更低，從直觀性、準確度和靈敏度綜合考慮是一種其它任何方法都無法替代的檢測方法，但至今未見櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法。

發明內容
本發明的目的在於提供一種高靈敏度、高可信度同時又非常直觀的櫛孔扇貝類立克次體病原的早期檢測方法，並證明通過PCR，克隆、序列分析獲得的16S rDNA序列是來自引起扇貝大規模死亡的細胞內寄生物類立克次氏體；本發明的另一目的是提供用於該檢測方法的試劑盒。
利用本發明作者已完成的櫛孔扇貝類立克次氏體在細菌分類學上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列設計合成了三條寡核苷酸特異探針，建立了櫛孔扇貝類立克次氏體病原的原位雜交檢測方法，能直觀地將檢測的病原類立克次氏體與其引起的病理變化結合起來，從而確定該病原的感染部位，感染程度與其引起的病理變化，確定其致病力，因而直觀性、準確度和靈敏度都優於現有的檢測方法，實現了本發明的目的。
本發明提供一種櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法，其技術方案包括如下步驟(1)用地高辛標記的特異的探針與櫛孔扇貝組織切片中類立克次氏體16s rRNA雜交結合；(2)進行原位雜交檢測a.通過進一步的免疫學抗原抗體反應擴大信號所述的地高辛標記的探針結合生物素化鼠抗地高辛，再結合鏈黴親合素-生物素-過氧化物酶複合物，最後再結合生物素化過氧化物酶；b.經酶反應顯色；所述的特異的探針是根據櫛孔扇貝類立克次氏體在細菌分類學上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列設計合成的三條寡核苷酸探針，合成後於每一探針的3』末段標記地高辛；所述的三條寡核苷酸探針序列為(1)5』-CCAACACCGAATCCGAAGACCCGACGTGGTTTA-3』；(2)5』-GGTCCTTCTTATCCTGTTACTGTCATCATCC-3』；(3)5』-ACTAGAATACACCTCCGAAGAAGTGCATCTCGT-3』。
本發明櫛孔扇貝組織樣品和通常的原位雜交檢測一樣需要固定、切片、滅活樣品內源性的過氧化物酶和消化蛋白以暴露DNA等處理，可以採用通常的方法；用生物素或地高辛標記的探針的原位雜交檢測通常採用免疫學的抗原抗體反應擴大反應信號、酶反應顯色，本發明原位雜交檢測可以採用通常的方法，例如可以採用博士德公司敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒I和二甲基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒；本發明在採用免疫學的抗原抗體反應擴大反應信號方面有一定改進。
本發明優選的技術方案見實施例。
本發明提供一種用於櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法的試劑盒，該試劑盒包括上述特異探針和原位雜交試劑。
本發明與現有技術相比具有如下優點(1)能直觀地將檢測的類立克次氏體病原與其引起的病理變化結合起來；(2)在高效、準確檢測類立克次氏體的同時可由樣本切片上分析感染率和感染強度，這是其它分子生物學檢測方法所不具有的特點；(3)由於在雜交過程中探針與16s rRNA的雜交是特異的，且信號經過了逐級放大，所以遠較常規的染色觀察檢測靈敏、精確；(4)本發明的結果雜交顯色後的切片可長期保存。


圖1發病櫛孔扇貝消化腺原位雜交檢測結果，箭頭示黃褐色包涵體(×1330)。
圖2發病櫛孔扇貝外套膜原位雜交檢測結果，箭頭示黃褐色包涵體(×1330)。
具體實施例方式
下列實驗及操作實例是進一步對本發明的說明，不應該當作對本發明的限制。
實施例1櫛孔扇貝樣品發病櫛孔扇貝幼貝於2002年6～8月取自山東青島和長島發生嚴重死亡的養殖場，平均大小為3.2cm×2.8cm×0.7cm(樣本量n＝26)。健康櫛孔扇貝幼貝於2002年8月取自大連扇貝養殖場，平均大小為3.6cm×3.1cm×0.9cm(樣本量n＝16)。
健康扇貝做常規切片光鏡觀察、電鏡觀察和PCR檢測確定是無類立克次氏體感染的非疫區扇貝做為陰性對照，疫區扇貝經常規切片光鏡觀察、電鏡觀察和PCR檢測確定是有類立克次氏體感染的扇貝作為陽性對照。
使用的原位雜交主要試劑、材料(1)敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒I，博士德公司(武漢市武珞路650號武漢市博士德生物工程有限公司)；(2)DAB顯色試劑盒，博士德公司；(3)多聚賴氨酸(poly-L-lysine)，Sigma，美國；(4)焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)，Sigma，美國；(5)原位雜交專用蓋玻片，Sigma，美國；(6)含DEPC的多聚甲醛固定液1000mL蒸餾水中加Na2HPO4·12H2O 36g，多聚甲醛乾粉40g，加熱攪拌溶解後加NaH2PO4·2H2O 3g，pH 7.0～7.5；趁熱加DEPC至終濃度0.1％；(7)含DEPC的1％的多聚賴氨酸(PLL)取PLL稀釋成1％，加DEPC成終濃度0.1％；(8)載玻片用前需泡於1％的多聚賴氨酸(PLL)中5分鐘後分幹，4℃保存備用；
(9)2×SSC1000mL蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3·2H2O)8.8g；(10)0.5×SSC300mL蒸餾水加100mL 2×SSC；(11)0.2×SSC270mL蒸餾水加30mL 2×SSC。
櫛孔扇貝樣品固定及切片製備(1)取扇貝易感組織消化腺於含0.1％的DEPC的4％的多聚甲醛固定2小時後用PBS洗滌3次，每次30分鐘，然後常規脫水、透明、石蠟包埋、切片(6μm厚)；(2)切片(必須平行做一個陽性和陰性對照)經常規石蠟脫水後加3％的H2O2室溫處理10分鐘，以滅活樣品內源性的過氧化物酶，然後用蒸餾水洗2次。
合成特異探針根據本發明作者已完成的櫛孔扇貝類立克次氏體在細菌分類學上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列設計合成的三條寡核苷酸探針，合成後於每一探針的3』末段標記8～12個地高辛，探針序列為(1)5』-CCAACACCGAATCCGAAGACCCGACGTGGTTTA-3』(2)5』-GGTCCTTCTTATCCTGTTACTGTCATCATCC-3』(3)5』-ACTAGAATACACCTCCGAAGAAGTGCATCTCGT-3』原位雜交(1)切片滴加3％的檸檬酸稀釋的胃蛋白酶(1mL 3％的檸檬酸加2滴濃縮的胃蛋白酶，混勻)，37℃消化蛋白10分鐘，然後用0.5mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS)洗3次，每次5分鐘，再用蒸餾水洗1次；(2)預雜交在幹的雜交盒底部加20％甘油20mL保持溼度，每張切片加20μL預雜交液，在38℃反應3小時，吸取多餘液體，不洗；(3)雜交用雜交液稀釋地高辛標記的探針，濃度為每條探針0.5μg/mL，每張切片加20μL雜交液，蓋上蓋玻片，39℃雜交過夜；(4)雜交後洗滌揭去蓋玻片，30～37℃溫水的2×SSC(檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液)洗滌2次，每次5分鐘；0.5×SSC(檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液)洗滌15分鐘；0.2×SSC(檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液)洗滌15分鐘；(5)滴加封閉液，37℃30分鐘，甩去多餘液體，不洗；(6)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃60分鐘，0.5mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS)洗4次，每次5分鐘；(7)滴加SABC-POD(鏈黴親合素-生物素-過氧化物酶複合物)，37℃20分鐘，0.5mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS)洗3次，每次5分鐘；(8)滴加生物素化過氧化物酶，37℃20分鐘，0.5mol/L PBS洗4次，每次5分鐘；
(9)顯色使用二甲基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(博士德公司產)，即1mL蒸餾水加顯色試劑A、B、C各一滴，混勻，加至標本片上，鏡下控制顯色，一般30分鐘內顯色完畢，充分水洗；(10)蘇木精(安氏)染色30秒後充分水洗，酒精脫水、二甲苯透明，封片。
結果觀察地高辛標記的寡核苷酸探針與細胞內寄生的類立克次氏體包涵體特異性地結合，包涵體DAB顯色後呈黃褐色，宿主細胞核由蘇木精染成蘭色。
原位雜交探針特異地結合在發病櫛孔扇貝的細胞內寄生的類立克次氏體包涵體，表明克隆的16S rDNA片段來源於櫛孔扇貝類立克次氏體。原位雜交結果與普通HE染色一致，所檢測的健康扇貝原位雜交結果呈陰性反應無黃褐色包涵體，而所檢測的病貝呈陽性反應，且原位雜交信號較HE染色強。原位雜交較常規HE染色靈敏度高。由於原位雜交是建立在特異性分子雜交的基礎上的，較常規HE染色準確、特異(見圖1和圖2)。
權利要求
1.一種櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法，其包括如下步驟(1)用地高辛標記的特異的探針與櫛孔扇貝組織切片中類立克次氏體16s rRNA雜交結合；(2)進行原位雜交檢測a.通過進一步的免疫學抗原抗體反應擴大信號所述的地高辛標記的探針結合生物素化鼠抗地高辛，再結合鏈黴親合素-生物素-過氧化物酶複合物，最後再結合生物素化過氧化物酶；b.經酶反應顯色；所述的特異的探針是根據櫛孔扇貝類立克次氏體在細菌分類學上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列設計合成的三條寡核苷酸探針，合成後於每一探針的3』末段標記地高辛；所述的三條寡核苷酸探針的序列為(1)5』-CCAACACCGAATCCGAAGACCCGACGTGGTTTA-3』；(2)5』-GGTCCTTCTTATCCTGTTACTGTCATCATCC-3』；(3)5』-ACTAGAATACACCTCCGAAGAAGTGCATCTCGT-3』。
2.根據權利要求1所述的一種櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法，其特徵在於，所述的櫛孔扇貝組織切片製備方法如下(1)取扇貝易感組織消化腺於含0.1％焦碳酸二乙酯的4％的多聚甲醛固定2小時後用磷酸鹽緩衝液洗滌3次，每次30分鐘，然後脫水、透明、石蠟包埋、切片，載玻片用前需泡於1％的多聚賴氨酸中5分鐘後分幹，4℃保存備用；(2)切片平行做一個陽性和陰性對照，經常規石蠟脫水後加3％的H2O2室溫處理10分鐘，然後用蒸餾水洗2次；所述的特異探針的3』末段標記8～12個地高辛；所述的特異的探針與櫛孔扇貝組織切片中類立克次氏體16s rRNA雜交結合併通過進一步的免疫學抗原抗體反應擴大信號的方法包括如下步驟(1)1mL 3％的檸檬酸加2滴濃縮的胃蛋白酶，混勻，滴加於切片，37℃消化蛋白10分鐘，然後用0.5mol/L磷酸鹽緩衝液洗3次，每次5分鐘，再用蒸餾水洗1次；(2)預雜交在幹的雜交盒底部加20％甘油20mL保持溼度，每張切片加20μL預雜交液，在38℃反應3小時，吸取多餘液體，不洗；(3)雜交用雜交液稀釋地高辛標記的探針，濃度為每條探針0.5μg/mL，每張切片加20μL雜交液，蓋上蓋玻片，39℃雜交過夜；(4)雜交後洗滌揭去蓋玻片，30～37℃溫水的2×檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液洗滌2次，每次5分鐘；0.5×檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液洗滌15分鐘；0.2×檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液洗滌15分鐘；所述的2×檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液為1000mL蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉8.8g；所述的0.5×檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液為300mL蒸餾水加100mL 2×檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液；所述的0.2×檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液為270mL蒸餾水加30mL 2×檸檬酸三鈉-NaCl緩衝液；(5)滴加封閉液，37℃ 30分鐘，甩去多餘液體，不洗；(6)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60分鐘，0.5mol/L磷酸鹽緩衝液洗4次，每次5分鐘；(7)滴加鏈黴親合素-生物素-過氧化物酶複合物，37℃ 20分鐘，0.5mol/L磷酸鹽緩衝液洗3次，每次5分鐘；(8)滴加生物素化過氧化物酶，37℃ 20分鐘，0.5mol/L磷酸鹽緩衝液洗4次，每次5分鐘。
3.一種用於櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法的試劑盒，其包括權利要求1所述的特異探針和原位雜交試劑。
全文摘要
本發明涉及一種櫛孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法及用於該法的試劑盒。該法包括如下步驟根據櫛孔扇貝類立克次氏體在細菌分類學上具有保守功能的16S rDNA序列中的三段特有的DNA序列設計合成了地高辛標記的三條寡核苷酸探針，該特異探針與櫛孔扇貝組織切片中類立克次氏體16s rRNA雜交結合後通過免疫學的抗原抗體反應擴大信號，然後經酶反應顯色。該檢測方法能直觀地將病原檢測與其病理變化結合起來；在高效、準確檢測類立克次氏體的同時可由樣本切片上分析感染率和感染強度；由於探針與16s rRNA的雜交是特異的，且信號經過了逐級放大，所以遠較常規的染色觀察檢測靈敏、精確；而且檢測結果雜交顯色後的切片可長期保存。
文檔編號C12Q1/68GK1769485SQ20041005201
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月2日 優先權日2004年11月2日
發明者李登峰, 吳信忠 申請人:中國科學院南海海洋研究所, 浙江大學