具有類甾族化合物結構的物質、其製造方法和含有該物質的抗腫瘤劑的製作方法

2023-09-22 16:28:55 2

專利名稱：具有類甾族化合物結構的物質、其製造方法和含有該物質的抗腫瘤劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及從冬蟲夏草中分離具有抗腫瘤活性的活性餾分和其中所含活性成分的方法以及該活性成分的化學結構。並且涉及含有該活性餾分或活性成分的抗腫瘤劑。
背景技術：
冬蟲夏草是一種子實體，它寄生於蝶蛾類鱗翅目和鞘翅目的昆蟲或其幼蟲體內，在它們的體內形成菌核，然後在夏季形成於作為宿主的昆蟲或其幼蟲的蟲體表面上。已知在世界上的冬蟲夏草約有350種，自古已知，冬蟲夏草對人體完全沒有毒性並且顯示各種各樣的效果，因此它是一種可作為中藥經口服用的物質，今日在中國已將冬蟲夏草錄載於作為與中藥有關的書刊的「中草藥學」或「中藥大辭典」等書刊中，即使在日本也已將冬蟲夏草記載入「新訂和漢藥」及其他許多中文書籍中。
作為記載於各種書籍中的藥理作用，冬蟲夏草具有增強精力、滋養強壯、治療循環器官系統疾病(日本藥理學會志，67卷，213頁，1995年)、糖尿病[Biol．Pharm．Bull16卷，1291-1293頁(1993)；同一雜誌，19卷，294-296頁(1996)]、肝病[Prog．Med12卷，1172-1174(1992)]等效果。另外，通過近年來的藥理學研究證實，冬蟲夏草真菌在許多方面具有活性和藥理作用，還報導了它的抗腫瘤和免疫增強作用等[《日本免疫學會學術記錄》18卷，665頁(1988年)；《日本細菌學會志》45卷，763頁(1990年)；J．Kanazawa《Med．Univ》17卷，330-335頁(1992)]。
然而，對完全純化的冬蟲夏草的活性成分進行的研究和在臨床上應用的例子卻很少[J．Am．Pharm．Ass46，114-118(1957)；特開平8-81386號公報]，因此，在把未經純化的提取物用於投藥時，必須使用較多量的冬蟲夏草原未或錠劑，這是存在的問題，另外，在藥理作用的均一性和可靠性方面也存在問題。另外，關於從冬蟲夏草提取的活性物質的分類或限定以及其藥理作用的機制方面的研究幾乎未見報導，即使在已被確認具有最多種類冬蟲夏草生長的以中國為首的亞洲諸國中，冬蟲夏草也是被作為葛根湯等湯劑處方中的藥草煎湯服用，只是根據不同地區的習慣和信仰有不同的服用方式，這是目前的現狀，在此情況下不能達到確實地維持穩定的藥理效果的目的。
因此，為了能夠確實而且有效地利用冬蟲夏草的藥理作用，特別是其抗腫瘤和增強免疫力等藥理效果，人們強烈地希望開發一種用於從冬蟲夏草的成分中分離出具有上述活性的活性成分的分離方法。

發明內容
本發明著眼於冬蟲夏草所具有的抗腫瘤效果，其目的是提供一種能夠以純品狀態獲得具有上述效果的化合物的分離方法。另外，本發明的另一個目的是提供一種具有上述抗腫瘤效果的化合物。進而，本發明的再一個目的是提供一種含有上述化合物的抗腫瘤劑。
對附圖的簡單說明

圖1A是本發明用於從冬蟲夏草中提取活性餾分和活性成分的一般流程圖。
圖1B是在實施例1中使用的本發明從冬蟲夏草中提取活性餾分和活性成分的流程圖。
圖2是色譜圖，其中示出了在實施列1中獲得的按本發明分離純化的化合物(Ⅱ)的反相色譜。箭頭所指處是化合物(Ⅱ)的峰。其中示出的保持時間是以樣品注入時間作為0分測得的時間。
圖3是質譜圖，其中示出了在實施例1中獲得的作為本發明活性成分的化合物(Ⅱ)的質譜數據。
圖4是表示本發明的活性餾分(圖1B的C5餾分)對細胞增殖的抑制作用(濃度相關性)的曲線圖。圖中分別示出了在使用纖維芽細胞(以○表示)和Hela細胞(以●表示)時的結果。
圖5表示按照本發明方法分離、提取的各餾分(圖1B的C1～C10餾分)對Vero細胞所起的細胞增殖抑制作用。
圖6表示按照本發明方法分離、提取的各餾分(圖1B的C1～C10餾分)對Hela細胞所起的細胞增殖抑制作用。
圖7是照片，其中示出了DNA碎裂的結果和Hela細胞內的染色質凝聚(24小時)的情況。
圖8是照片，其中示出了DNA碎裂的結果和Hela細胞內的染色質凝聚(72小時)的情況。
圖9是表示Hela細胞DNA的電泳結果的照片。其中，泳道1～4表示在24小時之後的結果，泳道5～8表示在48小時後的結果，泳道9～12表示在72小時後的結果。M和數字分別表示分子量標記和標記用分子量。
用於實施發明的最佳實施方案A．本發明是一種用於分離冬蟲夏草中所含的抗腫瘤活性餾分和活性成分的方法，其特徵在於，將冬蟲夏草的子實體部分乾燥，再將該已乾燥的子實體部分粉碎以製成乾燥的粉碎試料，將該試料用水溶性溶劑提取以製成提取液，將該提取液濃縮以製成粗提取物，將該粗提取物用矽膠柱色譜法至少處理1次以分離出具有腫瘤細胞增殖抑制作用的洗脫餾分，以此作為活性餾分，然後將該活性餾分用色譜法分離純化，獲得具有腫瘤細胞增殖抑制作用的活性成分(圖1A)。
對於作為適用於本發明中的提取原料的冬蟲夏草的子實體，沒有特別限制，只要是能夠寄生於一般公知的蝶蛾類鱗翅目和鞘翅目的昆蟲及其幼蟲體內並在其中形成菌核，到夏季時就形成於作為宿主的昆蟲及其幼蟲的軀體表面上的子實體即可。在本發明中，作為特別適用的冬蟲夏草，可以舉出那些能夠寄生在蝙蝠蛾科的幼蟲(Hepialus armoricanusOber)體內並在其中形成菌核，到夏季時就從該昆蟲頭部形成根棒狀的子實體的冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)。另外，在Cordyceps sinensis以外的冬蟲夏草中，作為生藥具有藥效的冬蟲夏草已知的還有Cordyceps sobolifera B和蛹蟲草(Cordyceps militaris Link)和Cordyceps nutans Pat等，這些冬蟲夏草也很適用於本發明中。只要這些冬蟲夏草能夠產生具有如下所述的抗腫瘤效果，就可以利用本發明的方法從其中提取(分離)出這些活性成分。另外，使用本發明的方法，可以無區別地對子實體或被子體進行提取，但是為了獲得特別高的產率，優選是從冬蟲夏草的子實體中提取。
作為從該原料中提取分離具有抗腫瘤活性的活性餾分或活性成分的方法，可以使用通常用於從植物中提取物質的方法，對此沒有特別限制，但是本發明在下文示出了特別好的提取分離方法。另外，在分離這些具有抗腫瘤活性的活性餾分或活性成分時使用的對該活性的判定方法也沒有特別限制，可以容易地選擇使用通常公知的方法。具體地說，可以選擇特定的腫瘤細胞，然後根據對該細胞的增殖所起的抑制效果來進行判定。
如圖1A所示，本發明的方法一般由以下的工序構成。
(1)對作為原料的冬蟲夏草的子實體部分進行乾燥的工序，使用該工序的原因是在作為原料的冬蟲夏草的含水量非常高的情況下，在後續的提取工序中極性物質也一起被提取出來，因此在多數情況下都會對利用色譜法的分離純化處理產生不良影響。對該乾燥方法沒有特別限制，但是優選使用適當大的乾燥箱。另外，對乾燥溫度也沒有特別限制，但優選是在35～60℃左右的溫度範圍內。在必要時優選進行送風乾燥。另外，為了防止不必要的光分解，優選是在黑暗場所進行乾燥。
(2)通過把工序(1)中乾燥了的子實體部分粉碎來製備乾燥粉碎試料的工序，通過該工序可以提高後續的提取效果。對粉碎的方法沒有特別限制，可以使用通常的研磨機或粉碎機進行研磨或粉碎。
(3)使用溶劑來浸取在工序(2)中獲得的乾燥粉碎試料的工序，通過該工序可以在除去溶劑後獲得粗提取物。作為適用於本發明中的提取溶劑，可以是水溶性溶劑或非水溶性溶劑。作為水溶性溶劑，具體地可以舉出甲醇或其他低級醇，它們可以單獨使用或者與緩衝液、水組合使用。另外，作為非水溶性溶劑，具體地可以舉出乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等。特別優選是甲醇或乙酸乙酯，用這兩種溶劑進行提取可以獲得最高的回收率與提取率。
(4)通過除去提取溶劑和濃縮來製備粗提取物的工序，對該工序沒有特別限制，例如可以在減壓下除去溶劑。另外，在必要時也可以在減壓下將粗提取物乾燥。
(5)利用柱色譜法處理在工序(4)中獲得的粗提取物以便從其中分離出具有腫瘤細胞增殖抑制作用的成分的分離工序，通過該工序可以獲得含有該成分的洗脫餾分。如有必要優選將該工序重複操作2次以上。這時，為了判別具有抗腫瘤活性的活性餾分，可以順次地測定洗脫的各級餾分的抗腫瘤活性。
對於柱色譜法來說，可以使用公知的各種性質的柱材料，但是在本發明中，優選使用矽膠柱色譜法。另外，技術人員可以根據上述粗提取物的量、雜質的含量、所希望的分離程度(純度)等適宜地選擇可供使用的矽膠的種類、粒徑、填充量、柱子長度等條件。另外，通過將矽膠柱色譜法重複操作兩次以上，可以獲得具有更高純度的活性餾分。
作為最初(第1次)的矽膠柱色譜法的洗脫溶劑，沒有特別的限制，可以是非極性溶劑、非極性溶劑與極性溶劑的組合或者僅僅是極性溶劑，它們可以單獨使用或者組合使用。在本發明中特別優選使用正己烷-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇等的溶劑混合液，技術人員可以容易地在適宜調節這些溶劑混合物的混合比之後再加以使用。對洗脫的餾分級數沒有特別限制，只要達到可以區別出各級餾分活性變化的程度即可(具體地在實施例1中如圖1B所示，為5級左右)。在洗脫的各級餾分中，取得了活性(對腫瘤細胞具有特異增殖抑制作用的活性)最高的餾分(具體地是實施例1的圖1B中示出的F4)。
在為了取得具有更高純度的活性餾分或者為了單獨分離出活性成分的情況下，可以將該餾分再用矽膠柱色譜法處理。在此情況下優選使用一種非極性程度更高的溶劑作為洗脫溶劑，具體地是利用二氯甲烷與甲醇的混合液，通過逐漸調節溶劑的混合比，可以獲得具有更高純度的活性餾分(具體地是實施例1的圖1B中示出的C5)。對洗脫的餾分級數沒有特別限制，只要達到可以區別出各級餾分活性變化的程度即可(具體地在實施例1中如圖1B所示為10級左右)。
(6)用色譜法從工序(5)獲得的活性餾分中單獨分離出活性成分的工序，利用該工序可以從冬蟲夏草中分離出其中所含的具有抗腫瘤活性的活性成分的化合物(1)。為了達到這一目的，可以使用各種具有高分離能力的色譜法，其中特別優選使用薄層色譜法(以下稱為TLC)和／或高效液相色譜法(以下稱為HPLC)。作為這些色譜法中的載體，可以是順相載體或反相載體，其中特別優選是反相載體。通過該色譜法處理，可以獲得一種在HPLC上顯示單一峰的完全純化的活性成分[化合物(Ⅰ)](圖2)。可以利用在該條件下在HPLC上呈現的峰的位置(例如保持時間)或在TLC上的斑點的位置(例如Rf值)來比較並確認本發明的化合物(Ⅰ)。對於TLC載體的種類、展開溶劑或HPLC載體的種類、柱子的長度、洗脫溶劑的種類、溶劑的流量等條件，技術人員可以容易地根據通常公知的方法來選擇。
使用本發明的方法，可以從100g冬蟲夏草的子實體中獲得100mg至10mg的上述化合物(Ⅰ)，但是也可以根據需要改變提取方法，這樣也可能獲得更高的產量和更高的收率。
B．如上所述，用本發明的方法分離純化的在冬蟲夏草中所含的作為抗腫瘤活性成分的化合物(Ⅰ)，根據各種物理化學的測定結果(根據其性狀、各種化學特性試驗、元素分析、分子量測定、質量分析、紅外線共振吸收光譜、紫外可見光吸收光譜、核磁共振吸收光譜及其他化學結構分析方法等)，表明它是一種一般具有由以下通式(Ⅰ)表示的類甾族結構的物質。 其中，R通常是由-CO(CH2)nCH3表示的醯基(n是0～5的整數)。更具體地說，R是乙醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、己醯基、庚醯基。在實施例1中分離出的化合物是一種具有n=0的醯基的化合物(式(Ⅱ))。根據該結構可以認為，它是一種迄今為止尚未被人們所知的具有全新的類甾族骨架的化合物。應予說明，該化合物也包含其異構體(含幾何異構體和光學異構體)。
這些化合物也可以按照上文說明的本發明的方法獲得，但對此沒有限定。根據這些化學結構式，利用以往公知的類甾體的化學合成方法可以較容易地設計一種合成線路並根據該線路合成出上述化合物。
C．本發明的抗腫瘤劑的特徵在於，其中含有在上文A．和B．中說明的冬蟲夏草中含有的具有抗腫瘤活性的活性餾分或活性成分。也就是說，按照上述方法獲得的化合物(Ⅰ)對腫瘤細胞具有特異顯著的增殖抑制效果。作為其作用機制，可以預料，這是由於化合物(Ⅰ)能夠直接或間接地切斷腫瘤細胞的DNA的緣故。也就是說，化合物(Ⅰ)儘管對正常細胞完全不顯示增殖抑制作用，但是對腫瘤細胞卻具有特異的增殖抑制效果，因此可作為抗腫瘤劑使用。
在將化合物(Ⅰ)作為醫藥品製劑使用時，可以將其單獨使用或者與公知的抗癌劑、甾類等的治療藥組合使用，可以將其直接使用或者與公知的賦形劑一起製成錠劑、膠囊劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、霜劑、凝膠劑、洗劑、氣霧劑、口腔劑、硬膏劑、敷劑、點眼劑等適宜的藥物劑型使用。
通常可以按全身的或局部的、經口的或非經口的方式投藥。投藥量可以根據患者的症狀、年齡、性別等適宜地決定，通常在對成人投藥時，可以將式(Ⅰ)的化合物按照每次投藥量10～500mg左右和每天約1至數次的用量投藥。
下面示出本發明的實施例，但本發明不受下面實施例中記載的內容的任何限制。
(實施例1)抗腫瘤活性成分的提取按照圖1B的流程進行。將100g冬蟲夏草的子實體部分置於乾燥箱(溫度為45～50℃的暗處)中加熱乾燥，用粉碎機粉碎後用10倍量的甲醇(W／V)浸泡24小時，將浸出液減壓濃縮。然後將粗提取物吸附於第1階段的矽膠色譜柱(35×300mm，Silica gel 60，63～100μm，Merck公司制)中，使用正己烷、1∶1的正己烷／乙酸乙酯、乙酸乙酯、1∶1的乙酸乙酯／甲醇、甲醇作為溶劑，這些溶劑的極性依次逐漸增加，分離出被1∶1的乙酸乙酯／甲醇洗脫的部分(F4層)。
然後，將F4層吸附於第2階段的矽膠色譜柱(35×300mm，Silicagel60，63～100μm，Merck)中，使用二氯甲烷與甲醇的混合液作為提取溶劑，在逐漸提高甲醇的混合比的條件下進行洗脫，獲得了C5層的洗脫部分。進而為了獲得活性成分，用正己烷／乙酸乙酯(1∶1V／V)作為展開液，使矽凝膠薄層色譜(TLC Plate Silica gel 60，F254，Merck公司制)展開2次以除去C5層的雜質，回收Rf值在0．5～0．7範圍內的試料。
然後把回收的試料添加入反相式高效液相色譜儀中，該色譜儀使用含有1％(V／V)甲醇的二氯甲烷作為洗脫溶劑，以二氧化矽柱(3．9×150mm，Nova-Pak C18，Nova Biochemicals公司制)作為柱子固定相，將洗脫溶劑的流速設定為1ml／min，將紫外光譜測定器的波長設定為254nm，獲得了完全純化的活性成分50mg。用反相色譜法對該完全純化的化合物進行分析，結果示於圖2中，在該條件下顯示出單一的峰。另外，所獲的活性成分化合物具有下述物理化學性質(1)性狀茶褐色，油狀(室溫)(2)分子式C31H58O6(3)碎片質譜法(FAB)(m／z)512(基峰，下同)、482、437、393、349、305、261、217、175、149、133(圖3)(4)紅外吸收光譜(cm-1)3300(OH)、1725(C=O)、1645(C=C)、1430(CH3)、1370(CH3CO)、1172(C-CO)、1138(C-O)(5)紫外吸收光譜(λmax；nm)225由這些結果可以推斷，上述獲得的化合物的化學結構式符合以下的式(Ⅱ)。 (試驗例1)為了證明含有從冬蟲夏草提取的活性化合物的活性餾分對腫瘤細胞的增殖具有特異的抑制作用，使用Vero和Hela細胞進行了增殖抑制作用的研究。此處，Vero是由小猴子的腎臟獲得的腫瘤細胞系統，Hela是由人的子宮頸獲得的腫瘤細胞系統。
將這些細胞用FCS-MEM培養基培養，用胰蛋白酶處理各細胞，然後用不含FCS的RPMI培養液洗滌3次。將試驗前的細胞密度調整為50000個／ml。向一塊具有96個凹孔的平底凹孔板上滴下含有各種細胞的懸浮液，每一個凹孔中滴下200μl懸浮液。
一天以後，吸取培養液，向試驗孔中滴下活性成分溶液200μl，向對照孔中滴下DMSO溶液200μl，在5％的CO2氣氛中和在37℃的溫度下培養3天。向每個凹孔中添加10μl作為染色試劑的Alarmer Blue試劑，進而培養3小時，然後根據分光學的測定(570nm和600nm)按照以下公式決定腫瘤細胞增殖抑制作用。
公式增殖抑制作用=100％-[(試驗孔的吸光度／對照孔的吸光度)×100％]另外，使用同樣的實驗對纖維芽細胞進行評價。結果示於圖4～圖6中。
圖4示出了活性餾分C5對腫瘤增殖細胞的抑制作用與濃度的依賴關係，可以看出，對於各種細胞都可看到與提取物用量有關的抑制作用。圖5示出了各餾分C1～C5(以及作為對照物添加的DMSO)對Vero細胞增殖的抑制作用(以細胞存活率表示)，可以看出，與對照物相比，本發明所有餾分都具有顯著的抑制作用。另外，圖6示出了各餾分C1～C5(以及作為對照物添加的DMSO)對Hela細胞增殖的抑制作用(以細胞存活率表示)，可以看出，與對照物相比，特別是C5餾分具有十分顯著的抑制作用。
從這些結果可以看出，本發明的活性餾分和活性成分對腫瘤細胞顯示特別顯著的增殖抑制作用。
(試驗例2)為了證明從冬蟲夏草提取的活性餾分對腫瘤細胞的DNA顯示特異的切斷作用和具有抗腫瘤作用，研究了該活性餾分對Hela細胞中的DNA的切斷作用。在一個φ10cm的培養皿中配製一種細胞密度為1×106個／ml的Hela細胞懸浮液，將其培養，然後向其中滴下200μl活性餾分溶液。然後分別在24、48、72小時之後各取50μl細胞，將其置於400μl的培養液(含有Tris-EDTA、SDS、Proteinase K)中，在5％CO2氣氛中於37℃下培養一夜。將其添加到鹽中，離心分離分解的蛋白質，將上清液加入乙醇中以進行沉澱。
將該沉澱物懸浮於一種含有RNase A的Tris-EDTA緩衝溶液中，2小時後將其在瓊膠上展開，在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色後將其進行電泳，在紫外光的照射下進行觀察。結果如圖7和圖8所示，可以確認在細胞核內有染色質凝集，另外，如圖9所示，電泳的結果也表明DNA已發生低分子量化，因此可以看出，由於活性化合物的作用，使得在腫瘤細胞內產生了細胞凋亡。
工業實用性本發明可用於分離冬蟲夏草中所含的抗腫瘤活性餾分或活性成分。另外還查明了具有該活性的成分的化學結構。並且可以提供一種含有在冬蟲夏草中所含的抗腫瘤活性餾分或活性成分的抗腫瘤劑。
權利要求
1．冬蟲夏草中的抗腫瘤活性餾分和活性成分的分離方法，其特徵在於，將冬蟲夏草的子實體部分乾燥，再將該已乾燥的子實體部分粉碎以製成乾燥的粉碎試料，將該試料用水溶性溶劑提取以製成提取液，將該提取液濃縮以製成粗提取物，將該粗提取物用矽膠柱色譜法至少處理1次以分離出具有腫瘤細胞增殖抑制作用的洗脫餾分，以此作為活性餾分，然後將該活性餾分用色譜法分離純化，獲得具有腫瘤細胞增殖抑制作用的活性成分。
2．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，上述的活性成分是一類滿足下述(1)～(5)的特性的化合物，所說特性是(1)性狀茶褐色，油狀(室溫)(2)分子式C13H58O6(3)碎片質譜法(FAB)(m／z)512(基峰)、482、437、393、349、305、261、217、175、149、133(4)紅外吸收光譜(cm-1)3300、1725、1645、1430、1370、1172、1138(5)紫外吸收光譜(λmax；nm)225
3．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，上述活性成分是由下述式(1)表示的化合物 式中，R是由-CO(CH2)nCH3表示的醯基，式中的n是0～5的整數。
4．含有權利要求1所述活性餾分的抗腫瘤劑。
5．含有權利要求1所述活性成分的抗腫瘤劑。
6．含有權利要求2所述化合物的抗腫瘤劑。
7．含有權利要求3所述化合物的抗腫瘤劑。
全文摘要
本發明提供一種能夠以純品狀態從冬蟲夏草中分離出具有抗腫瘤效果的化合物。進而,本發明查清了上述具有抗腫瘤效果的化合物的化學結構。另外,本發明的目的是提供含有該化合物的抗腫瘤劑。
文檔編號A61P35/00GK1291989SQ9980332
公開日2001年4月18日 申請日期1999年2月25日 優先權日1998年2月27日
發明者潘臺龍, 後藤茂, 陳肇隆 申請人:久光製藥株式會社