Phlp1變應原衍生物的製作方法

2023-09-22 18:09:00 2

專利名稱：：Phlp1變應原衍生物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及野生型蛋白質變應原Phlp1的衍生物及其製備方法。
背景技術：
：變態反應是遺傳性的或獲得性的對通常是無害的外源性(即非己)物質("變應原")的反應能力的特異性改變。變態反應與受累器官系統(皮膚、結膜、鼻、咽、支氣管黏膜和胃腸道)的炎性反應，速發疾病症狀，如變態反應性鼻炎、結膜炎、皮炎、過敏性休克和哮喘，和慢性疾病現象，如哮喘和特應性皮炎的遲發期反應有關。I型變態反應代表了一種遺傳決定的影響到約20%的世界工業化人口的超敏反應性疾病。I型變態反應的病理生理學標誌是抗別的無害抗原(變應原)的免疫球蛋白E(IgE)抗體的產生。目前，治療變態反應的唯一病因形式是變應原特異性免疫治療，其中增加給予患者的變應原劑量以誘導變應原特異性的無應答性。雖然一些研究已經顯示了變應原特異性免疫治療的臨床有效性，但並沒有充分理解其根本機制。變應原特異性免疫治療的主要缺點是依賴於使用天然變應原提取物，而天然變應原提取物如果不是因為無法標準化而難以得到，也至少因為難以達到工業化生產水平而難以得到。這些天然變應原提取物由不同的變應原和非變應原複合物構成，並且由於這一事實，有可能在給藥提取物中不存在某些變應原或甚至更糟糕的是在治療過程中患者對其成分形成新的IgE特異性。基於提取物的治療的另一個缺點來自於給予生物活性變應原製劑能夠引起過敏反應副作用這一事實。分子生物學技術在變應原鑑定領域中的應用使編碼所有相關7的環境中的變應原的cDNA得以分離，並得以製備重組變應原。使用這種重組變應原使得通過體外診斷方、法(即撿測血清中的變應原特異性IgE抗體)或者通過體內試驗確定個體患者的反應性譜成為可能。基於這一技術，有可能開發新的基於成分的抗變態反應的疫苗接種策略，尤其是抗患者致敏譜明確的I型變態反應的疫苗接種策略。然而，由於重組變應原與它們對應的天然物質的相似性，重組變應原也表現出顯著的變應原活性。由於重組變應原與野生型變應原的變應原活性非常接近，所以在使用天然變應原進行免疫治療時出現的與此變應原活性有關的缺點在使用重組變應原時也同樣存在。為了改進免疫治療，不得不降低重組變應原的變應原活性以便能增加變應原的給藥劑量而僅有很低的過敏反應副作用的風險。建議通過給予僅包含T細胞表位的多肽完全影響變應原特異性T細胞的活性。T細胞表位代表完整變應原經抗原呈遞細胞的蛋白水解消化產生的小分子多肽。這種T細胞表位能通過多肽的合成而製備。然而，迄今為止用T細胞表位所做的試驗僅顯示出差的結果和低的有效性。考慮以下因素可以解釋一些基於T細胞表位多肽的免疫治療的有效性低的原因第一，很難給予為T細胞所耐受而不使之激活的最佳劑量。第二，小的T細胞表位多肽在體內的半衰期很短。第三，有相當多的證據表明，特應性個體IgE的產生代表了不需重新類型轉換從而不能被T細胞來源的細胞因子所調控的記憶性免疫應答。完全基於T細胞表位的給藥的治療形式可因此調製變應原特異性T細胞的活性，但可幾乎不影響已經轉換的記憶性B細胞產生變應原特異性IgE抗體。另一個建議就是通過重組DNA技術或多肽合成技術製備低變應原性變應原衍生物或片段。這種衍生物或片段帶有T細胞表位並能誘導IgG抗體與IgE競爭天然變應原的識別位點。在20多年前證明變應原的蛋白質水解消化作用產生小的變應原片段，這些片段部分保留了其IgE結合能力但不能引起速髮型反應。雖然變應原的蛋白水解過程難以控制和標準化，但分子生物學研究開闢了新的製備IgE結合半抗原的途徑。這種IgE結合半抗原因其發生過敏性反應的風險低已經建議用於主動免疫接種，並且建議用於被動治療使效應細胞結合的IgE在接觸變應原之前飽和從而阻斷變應原誘導的介質釋放。基於變應原可天然出現只有少數幾個胺基酸殘基有區別和/或在具有低IgE結合能力的構象上有區別的的同分異構體這一認識，另一個建議是可通過基因工程製備低變應原性變應原。例如，主要樺樹花粉變應原，Betvl，通過基因工程方法使其發生寡聚化得到變應原活性大大降低的重組三聚體。另外，建議引入點突變使變應原結構發生構象變化從而破壞IgE構象表位或直接影響IgE結合能力(Valenta等人，Biol.Chem.380(1999)，815-824)。文獻還表明，變應原分成幾個部分(如分成兩部分)後由於喪失了近似天然的摺疊結構，因而導致變應原幾乎完全喪失其IgE結合能力和變應原活性(Betv1，Vrtala等人，J.Clin.Invest.99(1997)，1673-1681;Betv4，Twardosz等人，BBRC239(1997),197-204;Alng4，Hayek等人，J.Immunol.161(1998)，7031-7039;牛毛髮皮屑變態反應變應原，Zeiler等人，J.AllergyClin.Immunol.100(1997),721-727;L印d2，Elfman，Int.Arch.AllergyImmunol.117(1998),167-173;Phlp7，Westritschnig，J.Immunol.172(2004)，5684-5692))。將主要含有不連續或構象IgE表位的蛋白質分段導致變應原的IgE結合能力實質上地下降。基於這一知識，在在先技術中研究了這種低變應原性變應原片段能否在體外誘導保護性免疫應答(Westritschnig等人，(Curr.OpinioninAllergyandClin.Immunol.3(2003,495-500))。Ball等人的文獻(EurJImmunol1999,29:2026-2036)描述了在免疫治療過程中使用氫氧化鋁吸附的牧草花粉提取物給藥。專利US2002/0052490A1公開了編碼包含至少一種Phip1表位的多肽的重組DNA分子。FlickerS等人的文章(JAllergyClinImmunol2006,117:1336-1343)公開了PWp1變應原的C末端包含整個Phlp1分子的絕大部分變應原潛力。LinhartB等人的文章(FASEBJ2002,16:1301-1303)描述了包含幾種貓尾草變應原的雜合分子的製備。專利DE10351471A1涉及由變應原的幾種免疫顯性T細胞表位構成的不會發生交叉反應的雜合多肽。
發明內容本發明的目標是提供基於上面提到的知識的改進變態反應免疫治療的手段和方法。這種方法和手段應該是有效、過敏性休克的風險低、易於應用、可調整以滿足個體患者的需要和易於轉化為工業化規模。因此，本發明涉及與野生型變應原相比變應原活性下降的野生型蛋白質變應原Phlpl(主要貓尾草花粉變應原)衍生物的製備方法，該方法包括以下步驟-產生野生型蛋白質變應原Phlp1，-將所述野生型蛋白質變應原至少分成三個片段，其中所述至少三個片段中至少有一個片段包含至少一個T細胞表位，並且所述至少三個片段的變應原活性下降或者缺乏變應原活性，和-以區別於野生型變應原中片段順序的順序重新連接所述至少三個片段。當變應原與肥大細胞上預形成的結合在高親和力受體FceRI上的IgE發生交聯時，就激發了變態反應。肥大細胞排列在身體表面並能提醒免疫系統預防局部感染。一旦激活，肥大細胞通過分泌貯存在預形成囊泡中的化學介質並通過激活後合成白細胞介素和細胞因子誘導免疫應答。因此，野生型變應原由於其引發的副作用用於預防、治療或致敏患有變態反應的個體或存在患變態反應風險的個體的給藥是不利的。避免免疫治療中的變態反應的途徑是修飾野生型變應原以使所述修飾後的"變應原"與IgE結合的數量減少或不再結合IgE。因此這些分子無法激發強烈的變態反應。然而，應該注意的是，某些變應原片段的免疫原性不足以誘導產生保護性抗體應答(Westritschnig等人，(2004))。根據本發明的方法可以製備出與IgE的結合能力下降或缺失但同時保留了那些對於變應原誘導T細胞介導的免疫應答是必需的特徵的變應原衍生物。用根據本發明的方法可達到上述目的，因為上述負責誘導T細胞介導的免疫應答的結構性要素，例如野生型變應原上的T細胞表位，在根據本發明的變應原衍生物中實質上仍然保留。然而，變應原片段的轉換(分段和再連接)將導致IgE結合能力的顯著下降或者甚至是所述結合能力的完全喪失。當然，如果在變應原衍生物的產生過程中僅有一些胺基酸殘基丟失(刪除)或添加(插入)，或如果各個部分通過接頭連接而不是直接連接，那麼根據本發明的優勢仍然存在。變應原活性的下降或消失可通過將變應原分成特定片段的已知和一般原理而實現。根據本發明的變應原衍生物優選重組製備。當然，也可能化學合成單一變應原片段然後將它們連接起來。根據本發明的優選具體實施方式，測定變應原活性下降是根據與野生型變應原相比，變應原的IgE結合能力下降至少10。/。，優選至少20%，更優選至少30%，尤其是至少50%。測定變應原活性下降優選根據變應原敏感的患者血清中的IgE抗體不能結合到所述衍生物的斑點印跡上或根據嗜鹼性粒細胞釋放試驗。評價變應原活性的常規體外試驗包括RAST(Sampson和Albergo,J.AllergyClin.Immunol.74:26,1984)，ELISAs(Burks等人，N.Engl.J.Med.314:560,1986)，免疫印跡(Burks等人，J.AllergyClin.Immunol.81:1135,1988))，嗜鹼性粒細胞組胺釋放試驗(Nielsen,Dan.Med.Bull.42:455,1995和duBuske，AllergyPro"l小.243,1993)和其他試驗(Hoffmann等人,Allergy54:446,1999)。根據本發明的優選具體實施方式，至少三個片段包含Phip1的胺基酸殘基25至39、胺基酸殘基34至45、胺基酸殘基73至84、胺基酸殘基91至102、胺基酸殘基100至111、胺基酸殘基109至133、胺基酸殘基121至135、胺基酸殘基127至138、胺基酸殘基157至168、胺基酸殘基169至183和/或胺基酸殘基226至240。在根據本發明的方法中使用的該至少三個片段可包含至少一個上述鑑定了的T細胞表位(見如SchenkS,等人JAllergyClinImmunol.(1995)96:986-996)。根據本發明的另一優選具體實施方式，至少三個片段選自Phipli1的胺基酸殘基1至64(A)、胺基酸殘基65至125(B)、胺基酸殘基126至205(C)或胺基酸殘基206到240(D)。選擇本發明的片段是為了破壞IgE結合表位或B細胞表位和保留可誘導對所述表位產生適當免疫應答的T細胞表位。野生型變應原Phlp1中天然存在的B細胞表位的破壞或減少可使得所述衍生物在為個體患者給藥時主要激發T細胞介導應答而不誘導變態反應(與結合到介質釋放細胞上的IgE完全不結合或結合減少)。變應原衍生物中所述片段的順序是B-D-A-C。如果獲得的變應原衍生物與野生型變應原相比表現出下降的變應原活性，當然也有可能用另一種方式(D-B-A-C、B-A-D-C等)排列所述片段。根據本發明獲得的衍生物可易於與藥學上可接受的賦形劑聯合併製成藥物製品。優選地，衍生物與適合的疫苗佐劑聯合併製成藥學上可接受的疫苗製品。根據優選具體實施方式，根據本發明的衍生物與進一步變應原聯合製成聯合疫苗。這些變應原優選是野生型變應原，尤其是野生型變應原的混合物、重組野生型變應原、野生型蛋白質變應原衍生物或它們的混合物。這種混合物可應某個患者的需要(變應原譜)而特製。在優選具體實施方式中，這種藥物製品進一步包含變應原提取物。根據本發明的另一優選具體實施方式，所述進一步變應原選自主要樺樹花粉變應原，尤其是Betvl和Betv4，主要貓尾草花粉變應原，尤其是phlp2、Phlp5、Phlp6和Phlp7，主要屋塵蟎變應原，尤其是Derpl禾BDerp2，主要貓變應原Feldl，主要蜜蜂變應原，主要黃蜂變應原，肌動蛋白抑制蛋白，尤其是Phlp12或儲存塵蟎變應原，尤其是Lepd2。根據本發明的醫藥和疫苗製品可包含僅次於Phlpl衍生物的其它變應原或其衍生物和片段，變應原提取物等。本發明的另一方面涉及可通過本發明的方法獲得的變應原衍生物。本發明的另一方面涉及野生型蛋白質變應原Phlp1的變應原衍生物，其特徵在於所述衍生物包含至少三個以區別於野生型變應原中片段順序的順序彼此融合的所述野生型蛋白質變應原片段，其中所述至少三個野生型變應原片段表現出變應原活性下降或缺乏變應原活性並且其中所述至少三個片段中至少有一個片段包含一個或多個T細胞表位。根據本發明的優選具體實施方式，所述至少三個變應原片段包含至少六個胺基酸殘基，優選至少10個胺基酸殘基，尤其是至少15個胺基酸殘基。該至少三個片段優選包含Phlp1的胺基酸殘基25至39、胺基酸殘基34至45、胺基酸殘基73至84、胺基酸殘基91至102、胺基酸殘基100至111、胺基酸殘基109至133、胺基酸殘基121至135、胺基酸殘基127至138、胺基酸殘基157至168、胺基酸殘基169至183和胺基酸殘基226至240。根據本發明的另一優選具體實施方式，該至少三個片段選自Phlp1的胺基酸殘基1至64(A)、胺基酸殘基65至125(B)、胺基酸殘基126至205(C)或胺基酸殘基206至240(D)。變應原衍生物中所述片段的順序優選是B-D-A-C。本發明的變應原衍生物也可用於檢測和診斷對Phlp1的敏感性。例如，在體外，在適合血液成分(例如抗體、T細胞和B細胞)與該衍生物結合和適合確定該結合達到的程度的條件下，將具有PWp1活性的多肽與從進行敏感性評價的客體獲得的血液或血液製品聯合，可對Phlp1的敏感性進行檢測或診斷。可使用本發明的衍生物的過敏性疾病的其它診斷方法包括放射性變應性吸附試驗(RAST)、試紙放射免疫吸附試驗(PRIST)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射性免疫測定試驗(RIA)、免疫放射測定試驗(IRMA)、螢光免疫試驗(LIA)、組氨酸釋放試驗和IgE免疫印跡試驗。本發明的另一發麵涉及包含根據本發明的變應原衍生物(見上)和進一步變應原的變應原組合物，進一步變應原優選野生型變應原、尤其是野生型變應原的混合物、重組野生型變應原、野生型蛋白質變應原衍生物或它們的混合物。所述組合物優選進一步包含變應原提取物。根據本發明的優選具體實施方式，變應原組合物包含藥學上可接受的賦形劑。根據本發明另一優選具體實施方式，所述組合物進一步包含一種或多種選自主要樺樹花粉變應原，尤其是Betvl和Betv4，主要貓尾草花粉變應原，尤其是Phlp2、Phlp5、Phlp6和Phlp7，主要屋塵蟎變應原，尤其是Derpl和Derp2，主要貓變應原，尤其是Fddl，主要蜜蜂變應原，主要黃蜂變應原，肌動蛋白抑制蛋白，尤其是Phlpl2或儲存塵蟎變應原，尤其是Lepd2。本發明的另一方面涉及根據本發明的變應原衍生物或變應原組合物用於製備變應原特異性免疫治療藥劑的用途。本發明的另一方面涉及根據本發明的變應原衍生物或變應原組合物用於製備主動免疫接種藥劑的用途。本發明的另一方面涉及根據本發明的變應原衍生物或變應原組合物用於製備預防免疫接種藥劑的用途。所述藥劑優選進一步包含佐劑、稀釋劑、防腐劑或它們的混合物。根據本發明的優選具體實施方式，藥劑包含所述重組變應原衍生物10ng至lg,優選100ng至10mg,尤其0,5嗎至200嗎。優選給藥方式包括一般疫苗接種和特定變態反應免疫治療的疫苗接種所描述和建議的所有標準給藥體系(口服給藥、經皮給藥、靜脈給藥、鼻內給藥和經黏膜給藥等)。本發明包括通過給予有效劑量的根據本發明的醫藥製劑治療和預防變態反應的方法。本發明的另一方面涉及根據本發明的變應原衍生物的製備方法，其特徵在於通過以下步驟-產生編碼根據本發明的變應原衍生物的DNA分子，-用所述DNA分子轉化宿主細胞，和-在所述宿主細胞內表達所述衍生物和分離所述衍生物。根據本發明的優選具體實施方式，所述宿主是真核細胞，優選是酵母或植物細胞，或原核細胞，優選是大腸桿菌。優選地，所述宿主是具有高表達能力的宿主。正如此處所用的，"具有高表達能力的宿主"是該宿主目的蛋白質的表達量至少是1mg/l培養物，優選至少5mg/1，更優選至少10mg/1，最優選至少20mg/L當然，表達能力還依賴於選定的宿主和表達系統(如載體)。根據本發明的優選宿主是大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母、枯草桿菌、pant細胞(例如衍生形成菸草細胞)等。當然，根據本發明的變應原衍生物也可通過任何其它適合的方法製備，尤其是化學合成或半化學合成的方法。通過下列附圖和實施例進一步解釋本發明，然而並不限於此。圖lA顯示根據本發明的低變應原性Phlpl衍生物的構建。圖lB顯示根據本發明的Phlpl嵌合體蛋白質的胺基酸序列(序列號NO:1)。圖2A顯示HSA純化到90%純度以上的Plm的考馬斯染色的垸基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。圖2B顯示Plm的質譜分析。在電離飛行時間壓縮基質輔助雷射解析II質譜儀(TOFCompactMALDIII)(Kratos,UK)(piCHEM,Austria)上採用線性模式進行雷射解吸質譜。圖2C顯示Plm的圓二色性(CD)分析。室溫，Plm蛋白質終濃度是46pM，重組Phlp1蛋白質終濃度是12pM，分別用0.001cm禾口0.05cm徑長的石英杯，在JascoJ-810型分光旋光計(Jasco,EasternMD)上收集遠紫外圓二色性光譜。記錄三次獨立測量結果和平均每個光譜點。通過減去在同一條件下獲得的相應緩衝液的光譜對最終光譜進行基線校正。結果用在給定波長的平均殘基橢圓率[e]表示。圖3顯示IgE結合到膜結合的重組變應原rPhlp1、Plm和HSA上。49名牧草花粉過敏患者的血清和一份非特應性供體血清(11=50)與膜結合的重組變應原rPhlp1、Plm和HSA孵育。用1251標記的抗人IgE抗體測定結合型IgE。圖4顯示將五名Phip1過敏個體的樣品與rPhlp1和Plm接觸時CD203c表達的比較。圖5顯示小鼠接種rPhlp1和Plm誘導IgGl應答。具體實施例方式實施例低變應原性Phip1嵌合體(Plm)蛋白質的鑑定實施例l:低變應原性Phip1嵌合體(Plm)蛋白質的構建為構建重組低變應原性Phip1嵌合體，擴增編碼四種Phip1片段的cDNA。片段A(胺基酸1-64)、B(胺基酸65-125)、C(胺基酸126-205)和D(胺基酸206-240)見圖1A。按B-D-A-C的順序根據"基因重疊延伸拼接法"(Horton等人，1999)組裝所述cDNA片段。在第一次PCR反應中獲得片段A的cDNA(引物AJF:5'ATCCCCAAGGTTCCC3'禾口AR:5'CAGCTCGCCGGCGCTCTTGAAGATGGG3')、片段B的cDNA(引物BF:5'CTCCTCCCATATGTCCGGACGCGGC3'和BR:5'GGTGAAGGGGCCCGTGCGCAGCTTCTG3')、片段C的cDNA(引物CF:5'AGCGCCGGCGAGCTG3鄰CR:5'CGGGATCCTAATGATGATGATGATGATGGGCGGCGAGCTTGTCGGGAGTGTC3')禾口片段D的cDNA(引物DF:5'ACGGGCCCCTTCACC3'和DR:5'GGGAACCTTGGGGATCTTGGACTCGTA3')。在接下來的第一次重疊延伸拼接反應中，用凝膠純化的PCR產物作為模板以獲得編碼片段BD(用引物BF和DR)和AC(用引物AF和CR)的cDNA。在後續第二次重疊延伸拼接反應中，用凝膠純化的片段BD和AC作為模板，用引物BF和CR以獲得編碼BDAC的PCR產物(概圖見圖IA)。將所得編碼BDAC的cDNA構建體插入質粒pET17b(Novagen，Madison,WI)的Ndel/BamHI限制性酶切位點中。在BDAC構建體的C末端的兩個甘氨酸後面是使嵌合體蛋白質能通過N產親合色譜法純化的六組氨酸標籤(圖lB)。測序確定編碼Phlp1嵌合體(Plm)的cDNA的正確序列。所得分子保留完整的基本序列(Laffer等人，1994)和T細胞表位(Schenk等人，1995)。實施例2:Plm的生物化學鑑定Plm的表達和純化Plm構建體轉化入大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene,Australia)並在添加100mg/1氨苄青黴素的LB培養基中表達。轉化細胞在37'C生長到OD60(M).9時添加lmM異丙基-p-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導重組Plm的表達。在相同條件下繼續孵育4小時，之後離心收穫細胞。變性條件下從不溶的片狀沉澱物中純化重組Plm。在8M尿素、100mMNaH2P04，10mMTris，pH8.0條件下震蕩混合60分鐘使細胞裂解。14,000Xg離心30分鐘後，將上清液加入到Ni-NTA柱中。重組Plm在8M尿素、100mMNaH2P04、10mMTris、pH4.5條件下洗脫並通過梯度透析復性，每個梯度至少4小時，透析液為100mMNaH2P04、10mMTris、pH8.0，分別含6、4、3、2、1和0.5M尿素。蛋白質最終在10mMTris、100mMNaCl和pH8.0條件下被透析出來並用AmiconcentriconYM.-3濃縮器濃縮。通過烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確認蛋白質得到純化。純化了的樣品的蛋白質濃度通過在280nm處的紫外線吸光度來估計。蛋白質的摩爾吸光係數通過其酪氨酸和色氨酸含量而計算(Gill等人，1989)。Plm顯示出可與重組Phlp1相比的遷移模式(見圖2A)，該遷移模式與根據蛋白質推斷出的胺基酸序列計算出的分子量一致。Plm的分子量通過質譜確定是27082道爾頓，與該蛋白質的預測分子量一致(見圖2B)。純化了的Plm通過圓二色性分析法分析並與重組Phlp1比較以確定它們的二級結構內容(見圖2C)。意料之外的是，Plm是在207和215nm處具有最小值，在195nm處具有最大值的摺疊分子，提示了有大量P二級結構的存在。Plm，代表人工變應原蛋白質，表現出區別於在杆狀病毒感染的昆蟲細胞內表達的摺疊重組Phip1的CD光譜(Ball等人)。作為對比，大腸桿菌表達的重組PWpl表現出非摺疊蛋白質的光譜，事實最近被描述(Ball等人,2005)17實施例3:Plm的IgE結合能力下降Plm的IgE反應性在抗原過剩的條件下通過斑點實驗確定並與rPhlp1比較(Niederberger等人，1998)。將3嗎純化重組蛋白質點到硝酸纖維素試紙條上並與49名Phlp1過敏患者的血清孵育。結合型IgE抗體用1251標記的抗人IgE抗體檢測並用Y計數法定量(Wallac,Finland)(Ball等人，1999)。在非變性條件下確定的Plm的IgE反應性與rPhlpi的IgE結合能力相比明顯下降(圖3)。與rPhlpl(表1)相比，將Plm結合的IgE抗體定量，顯示出平均有86.5%的PlmIgE結合能力下降。圖3顯示IgE結合到膜結合型重組變應原rPhlp1、Plm和HSA上。49名牧草花粉過敏患者的血清和一份非特應性的供體(n=50)血清與膜結合型重組變應原rPhlp1、Plm和HSA孵育。結合型IgE用l25I標記的抗人IgE抗體檢測。表1rPhlp1和Plm的血清IgE反應性。將點上去的蛋白質與29名牧草花粉過敏患者的血清相接觸。結合型IgE抗體用1251標記的抗人IgE抗體檢測並用Y計數法定量。tableseeoriginaldocumentpage18tableseeoriginaldocumentpage19實施例4:Plm表現出變應原活性下降通過CD203c的表達測定嗜鹼性粒細胞的激活在給予知情同意書後，採集5名過敏症供體的外周血。用肝素化試管收集血液。等量血液(lOO(il)與Plm禾nrPhlp1(10-3至10(ig/ml)系歹ll禾希禾華f夜、f亢IgE抗體(1[xg/ml)(Immunotech,Marseille:France)或緩衝液(磷酸鹽緩衝液PBS)在37。C孵育15分鐘。孵育結束後，用含20mMEDTA的PBS衝洗細胞。然後將細胞與10^1結合PE的CD203c單抗(mAb)97A6(Immunotech,Marseille,France)在室溫(RT)孵育15分鐘。此後，樣品用2mlFACS裂解液(BectonDickinson,SanJose,CA)裂解紅細胞。用PBS衝洗並使細胞在PBS中重新懸浮並在FACScan儀(BectonDickinson)上用Paint-a-Gate軟體通過雙色流式細胞計數法對細胞進行分析。變應原誘導的CD203c的上調通過計算刺激細胞的平均螢光強度(MFI刺激細胞)和未刺激細胞的平均螢光強度(MFI未纖纖)而得到，並用刺激指數(MFI刺激細胞MFI未刺激細胞)表示。Plm的變應原活性通過測定5名Phip1過敏患者血嗜鹼性粒細胞CD203c的表達來分析。正如圖4所描述的那樣，與蛋白質濃度為l嗎/ml的rPhlpl孵育後，CD203c的表達顯著上調(p<0.05)，而與Plm孵育的則無CD203c的誘導表達。只有當Plm的濃度增加到10嗎/ml時，CD203c的表達才上調。因此，與Plm相比，PWpl表現出10倍於Plm的變應原活性。實施例5:免疫接種Plm誘導產生的IgG抗體抑制患者的IgE與rPWp1的結合家兔的免疫接種用CFA為家兔首次接種200嗎的Plm和rPhlp1，並用IFA加強注射100嗎免疫源(4周後第一次加強注射；7周後用不完全佐齊lj第二次加強注射)(CharlesRiverBreedingLaboratories,Kisslegg,Germany)。第一次免疫接種後8周，家兔被放血。Plm誘導的IgG抑制過敏患者的IgE與rPhlp1的結合Plm和rPWpl誘導的家兔IgG抑制過敏患者的IgE與rPhlp1的結合用ELISA競爭試驗法(Focke等人，2001)檢測。ELISA平皿(NuncMaxisorp,Denmark)用1pg/mlrPhlp1包被並與100倍稀釋的rPhlp1和Plm抗血清預孵育，並與相應免疫前血清預艘育作為對照。衝洗後，將平皿與10倍稀釋的43名Phip1致敏的牧草花粉過敏患者的血清孵育。用稀釋了2500倍的HRP-偶聯的山羊抗人IgE抗體(KPL，Ga池ersburg，MD)檢測結合型IgE抗體。與抗Phip1和抗Plm抗血清預孵育達到的抑制IgE結合的百分數計算如下抑制IgE結合的百分數400—ODt/ODpx100。OD!和ODp代表分別與家兔的免疫血清和相應免疫前血清預孵育的吸光度。表2中Plm抑制患者IgE與rPhlp1結合的能力用下降百分比表示。用抗Plm抗體可達到的對患者IgE與rPhlp1結合的最強抑制程度的變化範圍是O至89%(平均下降52%)而用抗Phlpl抗體達到的抑制程度的變化範圍是4至75%(平均43%)。表2。家兔抗rPhlp1和Plm抗血清抑制牧草花粉過敏患者IgE與rPhlp1結合。結合rPhlp1和Plm的ELISA平皿與家兔抗rPhlp1和抗Plm抗血清預孵育。43名牧草花粉過敏患者的IgE結合下降百分數列於此表。Plm誘導的家兔IgG使IgE與rPhlp1結合下降％患者OD值raPlraPlm137502446133249450705434644527557582738951551028011321312362413403614201415235116396017415618254119425520435822625623556824465026353227312428707729283830586531435732525633566634596636698037497038728139376140687841233742758943496844728145728547923平均值4352實施例6:Plm的免疫源性為研究Phlp1嵌合體蛋白質在體內能否誘導變應原特異性IgG應答，皮下免疫接種6周齡雌性BALB/c小鼠(CharlesRiverBreedingLaboratories)。5隻小鼠一組免疫接種5pgPlm、rPhlp1和作為對照的吸附到A1(OH)3(Alu-Gel-S,Serva,Germany)(Vrtala等人，1998)上的PBS。小鼠被免疫接種三次(第1天、第28天和第56天)，每間隔4周從尾靜脈抽血並將血清存放在-2(TC直到被分析。IgGl對rPhlpl的應答通過ELISA(Vrtala等人，1998)測定。ELISA平皿(NuncMaxisorp,Denmark)用5jJgPlm包!皮並與1000倍稀釋的小鼠血清孵育。結合型IgGl抗體用1000倍稀釋的單克隆大鼠抗小鼠IgGl(Pharmingen,CA)和200倍稀釋的HRP標記的綿羊抗大鼠抗血清(Amersham，UK)檢測。正如圖5所證明的那樣，Plm誘導的IgGl對rPhlp1的應答與免疫接種rPhlp1誘導的應答強度幾乎相等。圖5。Plm的免疫原性。用PBS、rPhlp1或Plm(x軸)免疫接種5隻小鼠，接種後4、8周或12周IgGl應答的平均值(以OD值表示，y軸)。參考文獻Ball,T"etal.(2005)FEBSJ.272:217-227.Ball,T.,etal.(1999)FASEBJ.13:1277.Focke，M.,etal.(2001)FASEBJ.15:2042.Gill,S.C,andP.H.Hippel.(1989)Anal.Biochem.182:319.Hauswirth，AW.,etal.(2002)JAllergyClinImmunol110:102.Horton,R.M.(1999)Mol.Biotechnol.2:93.Laffer,S.,etal.(1994)J.AllergyClin.Immunol.94:689.Niederberger,V"etal.(1998)J.AllergyClin.Immunol.101:258.Schenk，S.,etal.(1995)J.AllergyClin,Immunol.96:986.Vrtala,S.,etal.(1998)J.Immunol.160:6137.權利要求1、與野生型變應原相比變應原活性下降的野生型蛋白質變應原Phlp1衍生物的製備方法，其包含下列步驟-產生野生型蛋白質變應原Phlp1，-將所述野生型蛋白質變應原至少分成三個片段，其中所述至少三個片段中至少有一個片段包含至少一個T細胞表位，所述至少三個片段的變應原活性下降或缺乏變應原活性和-以區別於野生型變應原中的片段順序的順序重新連接所述至少三個片段。2、根據權利要求1的方法，其特徵在於通過與野生型變應原相比，IgE結合能力下降至少10%，優選至少20%，更優選至少30%，尤其是至少50%來測定變應原活性下降。3、根據權利要求1或2的方法，其特徵在於通過變應原致敏患者血清中的IgE抗體不能結合到所述衍生物的斑點印跡上或嗜鹼性粒細胞釋放試驗來測定變應原活性下降。4、根據權利要求1至3中任一項的方法，其特徵在於在將所述野生型蛋白質變應原至少分成三個片段之前確定所述變應原的T細胞表位。5、根據權利要求1至4中任一項的方法，其特徵在於至少三個片段包含PWp1的胺基酸殘基25至39、胺基酸殘基34至45、胺基酸殘基73至84、胺基酸殘基91至102、胺基酸殘基100至111、胺基酸殘基109至133、胺基酸殘基121至135、胺基酸殘基127至138、胺基酸殘基157至168、胺基酸殘基169至183或胺基酸殘基226至240。6、根據權利要求1至5中任一項的方法，其特徵在於至少三個片段選自Phip1的胺基酸殘基1至64(A)、胺基酸殘基65至125(B)、胺基酸殘基126至205(C)或胺基酸殘基206至240(D)。7、根據權利要求6的方法，其特徵在於變應原衍生物中所述片段的順序是B-D-A-C。8、根據權利要求1至7中任一項的方法，其特徵在於所述衍生物與藥學上可接受的賦形劑聯合併製成藥物製劑。9、根據權利要求1至7中任一項的方法，其特徵在於所述衍生物與適合的疫苗佐劑聯合併製成藥學上可接受的疫苗製劑。10、根據權利要求9的方法，其特徵在於所述衍生物與至少一種進一步變應原聯合製成聯合疫苗。11、根據權利要求10的方法，其特徵在於所述進一步變應原是野生型變應原，尤其是一種野生型變應原混合物、重組野生型變應原、野生型蛋白質變應原衍生物或它們的混合物。12、根據權利要求9至11中任一項的方法，其特徵在於所述製劑進一步包含變應原提取物。13、根據權利要求10至12中任一項的方法，其特徵在於所述進一步變應原選自主要樺樹花粉變應原，尤其是Betv1和Betv4，主要貓尾草花粉變應原，尤其是Phip2、Phip5、Phip6和Phip7，主要屋塵蟎變應原，尤其是Derpl和Derp2，主要貓變應原Feld1，主要蜜蜂變應原，主要黃蜂變應原，肌動蛋白抑制蛋白，尤其是Phlpl2或儲存塵蟎變應原，尤其是Lepd2。14、根據權利要求1至7中任一項的方法獲得的變應原衍生物。15、野生型蛋白質變應原Phlp1的變應原衍生物，其特徵在於所述衍生物包含所述野生型蛋白質變應原的至少三個以區別於野生型變應原中的片段順序的順序彼此融合的片段，其中所述至少三個野生型變應原片段表現出下降的變應原活性或缺乏變應原活性並且其中所述至少三個片段中至少有一個片段包含一個或多個T細胞表位。16、根據權利要求15的變應原衍生物，其特徵在於所述至少三個變應原片段包含至少6個胺基酸殘基，優選至少10個胺基酸殘基，尤其是至少15個胺基酸殘基。17、根據權利要求15或16的變應原衍生物，其特徵在於至少三個片段包含Phlp1的胺基酸殘基25至39、胺基酸殘基34至45、胺基酸殘基1至64、胺基酸殘基73至84、胺基酸殘基91至102、胺基酸殘基100至111、胺基酸殘基109至133、胺基酸殘基121至135、胺基酸殘基65至125、胺基酸殘基126至205、胺基酸殘基127至138、胺基酸殘基157至168、胺基酸殘基169至183、胺基酸殘基206至240或胺基酸殘基226至240。18、根據權利要求15至17中任一項的變應原衍生物，其特徵在於至少三個片段選自Phlp1的胺基酸殘基1至64(A)、胺基酸殘基65至125(B)、胺基酸殘基126至205(C)或胺基酸殘基206至240(D)。19、根據權利要求18的變應原衍生物，其特徵在於變應原衍生物中所述片段的順序是B-D-A-C。20、包含根據權利要求14至19中任一項的變應原衍生物和進一步變應原的變應原組合物，其中進一步變應原優選野生型變應原，尤其是野生型變應原的混合物、重組野生型變應原和野生型蛋白質變應原衍生物或它們的混合物。21、根據權利要求20的變應原組合物，其特徵在於所述組合物進一步包含變應原提取物。22、根據權利要求20或21的變應原組合物，其特徵在於所述組合物包含藥學上可接受的賦形劑。23、根據權利要求20至22中任一項的變應原組合物，其特徵在於所述組合物進一步包含一種或多種變應原，該變應原選自主要樺樹花粉變應原，尤其是Betvl和Betv4的，主要貓尾草花粉變應原，尤其是Phlpl、Phlp2、Phlp5、Phlp6和Phlp7，主要屋塵蟎變應原，尤其是Derpl和Derp2，主要貓變應原Feldl，主要蜜蜂變應原，主要黃蜂變應原，肌動蛋白抑制蛋白，尤其是Phlp12或儲存塵蟎變應原，尤其是Lepd2。24、根據權利要求14至23中任一項的變應原衍生物或變應原組合物製備變應原特異性免疫治療藥劑的用途。25、根據權利要求14至23中任一項的變應原衍生物或變應原組合物製備主動免疫接種藥劑的用途。26、根據權利要求14至23中任一項的變應原衍生物或變應原組合物製備預防免疫接種藥劑的用途。27、根據權利要求14至26中任一項的用途，其特徵在於所述藥劑進一步包含佐劑、稀釋劑和防腐劑或它們的混合物。28、根據權利要求24至27中任一項的用途，其特徵在於該用途包含10ng至1g，優選100ng至10mg,尤其是0，5嗎至200嗎的所述重組變應原衍生物。29、根據權利要求15至18中任一項的變應原衍生物的製備方法，其特徵在於採用下列步驟-產生編碼根據權利要求15至18中任一項的變應原衍生物的DNA分子，-將所述DNA分子轉化宿主細胞，和-在所述宿主細胞中表達所述衍生物和分離所述衍生物。30、根據權利要求29的方法，其特徵在於所述宿主是優選酵母或植物細胞的真核細胞或優選大腸桿菌的原核細胞。31、根據權利要求15至18中任一項的變應原衍生物的製備方法，其特徵在於變應原衍生物通過化學合成製備。全文摘要與野生型變應原相比變應原活性下降的野生型蛋白質變應原Phlp1衍生物的製備方法，其包含下列步驟產生野生型蛋白質變應原Phlp1，將所述野生型蛋白質變應原至少分成三個片段，其中所述至少三個片段中至少有一個片段包含至少一個T細胞表位，所述至少三個片段的變應原活性下降或缺乏變應原活性，和以區別於野生型變應原中的片段順序的順序重新連接所述至少三個片段。文檔編號A61K39/35GK101432298SQ200780015572公開日2009年5月13日申請日期2007年5月3日優先權日2006年5月3日發明者A·斯託克林戈,B·林哈特,C·盧品克,J·塔爾哈默,P·瓦林特,R·瓦林塔,T·鮑爾申請人:碧歐美公司;阿勒戈法曼約阿希姆甘澤爾兩合有限公司