長鏈非編碼rnaloc401317的表達載體、抑瘤試劑及其應用的製作方法
2023-09-22 10:29:20
長鏈非編碼rnaloc401317的表達載體、抑瘤試劑及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種長鏈非編碼RNA LOC401317的表達載體、抑瘤試劑及其應用，即用於製備抑制腫瘤細胞生長和增殖的製劑，根據該lncRNA序列，設計併合成了用於過表達LOC401317的真核表達載體，並將該載體負載到多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒上製成納米球，成功地在鼻咽癌細胞系中表達出LOC401317，抑制了鼻咽癌細胞的生長。本發明的多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒，可保護LOC401317載體免受核酸酶降解，延長作用時間，有更高的轉染效率，有利於進一步的開發和應用。
【專利說明】長鏈非編碼RNAL0C401317的表達載體、抑瘤試劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於腫瘤分子生物學領域，具體涉及長鏈非編碼RNAL0C401317的表達載 體、抑瘤試劑及其應用。
【背景技術】
[0002] 鼻咽癌是常見高發的頭頸部惡性腫瘤，容易發生頸部淋巴結轉移，預後較差。研究 表明，這種腫瘤的發生發展是多基因參與、多步驟、多階段的複雜過程，其中抑癌基因的失 活與癌基因的激活發揮了關鍵的作用。
[0003] TP53基因（編碼P53蛋白）自1979年被克隆以來，一直是腫瘤分子生物學研究領 域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的證據表明，TP53基因通過調控一系列信號轉導 通路廣泛參與了多種惡性腫瘤的發生發展。在細胞受到各種致癌因素的刺激時，P53蛋白 激活並通過轉錄調控下遊關鍵靶基因的表達，阻滯細胞周期、誘導細胞分化、啟動細胞衰老 及凋亡、參與DNA損傷修復維持基因組的穩定、調節能量代謝和抑制腫瘤血管生成，從而阻 止腫瘤的發生發展。已有的研究發現，TP53基因是包括鼻咽癌在內的多種惡性腫瘤中最常 見的突變基因之一，33%?76%的患者存在TP53基因異常。因此，恢復鼻咽癌中TP53基因 功能或逆轉其下遊信號通路，對鼻咽癌的治療具有重要的意義。
[0004]長鏈非編碼 RNAs (long non-coding RNAs, IncRNAs)是一類長度超過 200nt、缺少 特異完整的開放閱讀框、無或很少有蛋白編碼功能的RNAs分子。最近的研究表明，IncRNAs 通過在表觀遺傳、轉錄和轉錄後水平廣泛調節基因的表達，它們參與了生物體生長、發育、 衰老及死亡等重要生命活動的調控。越來越多的研究表明IncRNAs的異常表達或功能缺失 與腫瘤的發生發展密切相關。一些IncRNAs分子在腫瘤的診斷和治療方面具有重要的意 義，且可以作為腫瘤預後判斷新的分子標記。目前，已經克隆的人類IncRNAs基因已超過4 萬多個，但絕大部分IncRNA的功能未知。
[0005] 為了尋找鼻咽癌中TP53基因調控的下遊IncRNAs及其在鼻咽癌中的應用價值，我 們在鼻咽癌細胞系中轉染TP53基因，收集不同時間點的細胞用新一代IncRNAs晶片檢測了 已知IncRNA的表達水平。晶片檢測的結果顯示，IncRNA L0C401317的表達差異最顯著，其 表達明顯上調，提示L0C401317可能具有抑瘤基因的作用。
[0006] 我們構建了表達L0C401317的真核表達載體，轉染到鼻咽癌細胞株中，在體外培 養系統和裸鼠移殖瘤體內模型中均證實IncRNA L0C401317可明顯抑制鼻咽癌細胞的增殖， 抑制腫瘤細胞的生長，因此L0C401317是一個新的抑瘤性IncRNA。將L0C401317真核表達 載體負載到多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒上製成納米基因轉運體，多聚賴氨酸修飾的矽納 米顆粒，可保護L0C401317載體免受核酸酶降解，延長作用時間，且有更高的轉染效率。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供長鏈非編碼RNAL0C401317的表達載體、抑瘤試劑及其應用。 利用L0C401317序列得到的載體可以製備抑制鼻咽癌細胞的製劑。
[0008] 長鏈非編碼RNA L0C401317的應用方法，用於製備抑制鼻咽癌細胞的製劑，該長鏈 非編碼RNA L0C401317的序列見SEQ N0:1。
[0009] 抑制鼻咽癌細胞的製劑為長鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體。可以將所述的 表達載體負載到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒上製成納米球。
[0010] 具體是選擇Nhe I和EcoR I酶切位點用於酶切PCDNA3. 1載體，並將L0C401317 序列插入該位點，得到長鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體；將多聚賴氨酸修飾的矽納 米顆粒與長鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體混合靜置。
[0011] 構建長鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體步驟如下：
[0012] 1)以轉染TP53基因質粒的HNE2細胞的cDNA為模板，利用TaKaRa LA Taq?酶進 行PCR擴增全長L0C401317序列；
[0013] L0C401317全長序列擴增引物如下：
[0014]上遊引物：5' -atcgggggtgtgtgtttgcct-3，
[0015] 下遊引物：5' -tgacgtaatggacctgtatcc-3 ^
[0016] 在上、下遊引物的5'端分別加上限制性內切酶Nhe I和EcoR I識別位點及保護 鹼基後，引物序列如下：
[0017]上遊引物：5' -AGGAGCTAGCatcgggggtgtgtgtttgcc-3'
[0018]下遊引物：5，-ATGCGAATTC tgacgtaatggacctgtatcc-3';
[0019] 2)PCR反應條件如下：
【權利要求】
1. 長鏈非編碼RNA L0C401317的應用方法，其特徵在於，用於製備抑制鼻咽癌細胞的 製劑，該長鏈非編碼RNA L0C401317的序列見SEQ N0:1。
2. 根據權利要求1所述的應用方法，其特徵在於，抑制鼻咽癌細胞的製劑為長鏈非編 碼RNA L0C401317的表達載體。
3. 根據權利要求2所述的應用方法，其特徵在於，將所述的表達載體負載到多聚賴氨 酸修飾的娃納米顆粒上製成納米球。
4. 根據權利要求3所述的應用方法，其特徵在於， 選擇Nhe I和EcoR I酶切位點用於酶切pcDNA3. 1載體，並將L0C401317序列插入該 位點，得到長鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體；將多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒與長 鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體混合靜置。
5. 根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於， 構建長鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體步驟如下： 1) 以轉染TP53基因質粒的HNE2細胞的cDNA為模板，利用TaKaRa LA Taq?酶進行PCR 擴增全長L0C401317序列； L0C401317全長序列擴增引物如下： 上遊引物：5' -atcgggggtgtgtgtttgcct-3' 下遊引物：5, -tgacgtaatggacctgtatcc-3' 在上、下遊引物的5'端分別加上限制性內切酶Nhe I和EcoR I識別位點及保護鹼基 後，引物序列如下： 上遊引物：5' -AGGAGCTAGC atcgggggtgtgtgtttgcc-3' 下遊引物：5，-ATGCGAATTC tgacgtaatggacctgtatcc-3' ; 2. PCR反應條件如下： PCR反應步驟：
5返回到第2步，共進行39次反應循環 3) 將PCR產物電泳、膠回收目的片段後經Nhe I和EcoR I雙酶切後電泳，再次膠回收； 4. pcDNA3. 1質粒經Nhe I和EcoR I雙酶切後電泳膠回收目的片段； 5) 以T4DNA連接酶連接4)和5)步膠回收產物，即可得到用於真核表達 lncRNAL0C401317 的載體質粒； 6) 將第5)步得到的包含L0C401317全長序列的pcDNA3. 1真核表達質粒轉化感受態大 腸桿菌，以擴增質粒。
6. 根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於， 多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒是運用0P-10、環己烷、氨水的微乳液自組裝技術進行矽 納米顆粒的合成，並利用矽納米顆粒的表面能和離子靜電作用進行多聚賴氨酸表面修飾， 製備得到。
7. 根據權利要求6所述的應用方法，其特徵在於，製備多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒： 1) 將0P-10、環己烷和氨水混合，室溫攪拌均勻後加入正矽酸異酯，繼續攪拌至聚合完 成，加入等體積丙酮，超聲分散，離心，雙蒸水洗滌三次，離心收集沉澱於80°C乾燥，研細得 粒徑範圍10-50nm的矽納米顆粒；其中H 2O與0P-10及H2O與正矽酸異酯的摩爾比為2? 10、氨水濃度為1. 6?28%、正矽酸異酯在環己烷中的摩爾濃度為0. 1?3mol/L ; 2) 將矽納米顆粒按0. 1?10mg/ml重懸於0. 6M NaCO3溶液中，超聲分散，離心，棄上 清，再將沉澱物按〇. 1?l〇mg/ml重懸於pH 7. 4的PBS中，超聲分散，加多聚賴氨酸，終濃 度為4?15nmol/mL，充分混勻，室溫混搖；離心，棄上清，沉澱按0. 1?10mg/ml重懸於雙 蒸水中，得到多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒。
8. 根據權利要求3-7任一項所述的應用方法，其特徵在於，將多聚賴氨酸修飾的矽納 米顆粒超聲分散，每毫升納米顆粒懸液加入10?50ug長鏈非編碼RNA L0C401317的表達 載體，混合，室溫靜置使其結合。
9. 長鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體，其特徵在於， 構建長鏈非編碼RNA L0C401317的表達載體步驟如下： 1) 以轉染TP53基因質粒的HNE2細胞的cDNA為模板，利用TaKaRa LA Taq?酶進行PCR 擴增全長L0C401317序列； L0C401317全長序列擴增引物如下： 上遊引物：5' -atcgggggtgtgtgtttgcct-3' 下遊引物：5, -tgacgtaatggacctgtatcc-3' 在上、下遊引物的5'端分別加上限制性內切酶Nhe I和EcoR I識別位點及保護鹼基 後，引物序列如下： 上遊引物：5' -AGGAGCTAGC atcgggggtgtgtgtttgcc-3' 下遊引物：5，-ATGCGAATTC tgacgtaatggacctgtatcc-3' ; 2. PCR反應條件如下： PCR反應步驟：
3) 將PCR產物電泳、膠回收目的片段後經Nhe I和EcoR I雙酶切後電泳，再次膠回收； 4. pcDNA3. 1質粒經Nhe I和EcoR I雙酶切後電泳膠回收目的片段； 5) 以T4DNA連接酶連接4)和5)步膠回收產物，即可得到用於真核表達 lncRNAL0C401317 的載體質粒； 6) 將第5)步得到的包含L0C401317全長序列的pcDNA3. 1真核表達質粒轉化感受態大 腸桿菌，以擴增質粒。
10.基於長鏈非編碼RNAL0C401317的抑瘤試劑，其特徵在於，將權利要求9所述的長鏈 非編碼RNA L0C401317的表達載體與多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒混合靜置得到； 多聚賴氨酸修飾的矽納米顆粒是運用0P-10、環己烷、氨水的微乳液自組裝技術進行矽 納米顆粒的合成，並利用矽納米顆粒的表面能和離子靜電作用進行多聚賴氨酸表面修飾， 製備得到。
【文檔編號】C12N15/66GK104383559SQ201410584336
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】熊煒, 李桂源, 曾朝陽, 龔朝建, 李小玲, 廖前進, 陳攀, 曾勇, 張姍姍, 向娟娟, 周豔宏, 李徵 申請人:中南大學