一種酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法
2023-09-22 04:17:00 1
一種酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法
【專利摘要】本發明公開了一種酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法，包括以下步驟：(1)除去海鱸魚加工副產物中的雜蛋白及雜質，並打開膠原蛋白的三股螺旋結構；(2)加酸提取預處理後海鱸魚加工副產物中的膠原蛋白，冷凍乾燥後得到的膠原蛋白粉作為下一步酶解製備膠原蛋白肽的底物；(3)加水製成膠原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶進行酶解，將膠原蛋白轉化成膠原蛋白肽；(4)滅酶，冷卻；(5)脫腥脫色；(6)離心，取上清液；(7)通過膜分離截留上清液中分子量1000~3000Da的膠原蛋白肽組分；(8)將膜分離所得的膠原蛋白肽組分旋轉蒸發濃縮；(9)凍幹成粉末。該方法是由酶法結合膜分離技術從海鱸魚加工副產物中製備具有傷口癒合作用的高活性的生物活性肽。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生物活性肽的製備方法，尤其涉及一種酶法製備具有促進傷口愈 合活性的海洋膠原蛋白肽的方法。 一種酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的 方法
【背景技術】
[0002] 海S盧魚(學名又稱七星S盧、花S盧，為福鰭魚綱S盧形目真 鱸科花鱸屬，分布於西太平洋，是廣東省產量最大的海洋經濟魚。海鱸魚在加工過程中會 產生大量魚頭、魚骨和魚皮等副產物，通常丟棄或者加工成動物飼料，既汙染了環境又浪費 了資源。Nagai等發現海鱸的魚皮、魚骨和魚鰭中膠原蛋白的含量分別為51. 4%、40. 7%和 41.6% (以幹基計)。膠原蛋白由於其三股螺旋結構性質比較穩定，進入人體小腸後吸收率 很低；但是降解為膠原蛋白肽以後吸收率可高達90%。因此，從魚加工副產物中製備生物活 性肽已經成為研究熱點。已有報導採用木瓜蛋白酶水解魚皮明膠製備抗氧化肽，Zhuang等 採用鹼性蛋白酶水解海蜇膠原蛋白製備血管緊張素轉化酶抑制肽。然而，從魚加工副產物 中製備具有傷口癒合作用生物活性肽的研究還很少。
[0003] 目前，針對創傷患者專用型臨床營養品在市場上非常缺乏，急需開發有助於傷口 癒合的功能配料。成纖維細胞是非常重要的創傷修復細胞，在傷口癒合過程中參與肉芽組 織形成，合成並分泌膠原、纖維連接蛋白和透明質酸等細胞外基質來參與皮膚組織重塑過 程。
[0004]
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於提供一種酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽 的方法，該方法是由酶法結合膜分離技術從海鱸魚加工副產物中製備具有傷口癒合作用的 高活性的生物活性肽，可以解決現有海鱸魚加工副產物浪費得不到合理利用以及創傷患者 專用臨床營養品配料缺乏的問題。
[0006] 為達到上述發明目的，本發明採用以下技術方案：一種酶法製備具有促進傷口愈 合活性的海洋膠原蛋白肽的方法，包括以下步驟： (1) 預處理：將海鱸魚加工副產物洗淨絞碎，依次經鹼性溶液脫雜蛋白、酸脫鈣和脫脂 處理，除去雜蛋白及雜質，並打開膠原蛋白的三股螺旋結構，便於酶解； (2) 膠原蛋白的提取：加酸提取預處理後海鱸魚加工副產物中的膠原蛋白，冷凍乾燥 後得到的膠原蛋白粉作為下一步酶解製備膠原蛋白肽的底物； (3) 酶解：加水製成膠原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶進行酶解，將膠原蛋白轉化成膠 原蛋白膚； (4) 滅酶：對得到的酶解液進行滅酶，冷卻； (5) 脫腥脫色：向滅酶後的酶解液中加入適量活性炭，以脫腥脫色； (6) 離心：將脫腥脫色後的酶解液離心，取上清液； (7) 膜分離：通過膜分離截留上清液中分子量100(T3000Da的膠原蛋白肽組分； (8) 濃縮：將膜分離所得的膠原蛋白肽組分旋轉蒸發濃縮，便於凍幹； (9) 凍幹：將濃縮後上清液冷凍乾燥成粉末，即為成品，於乾燥條件下貯存起來。
[0007] 以海鱸魚加工副產物為原料，其中必存在雜蛋白、鈣、油脂等雜質，這必會影響膠 原蛋白的純度，因而在提取膠原蛋白前必須去除上述雜質。雜蛋白能溶解於鹼性溶液中，因 此在預處理中採用鹼性溶液對海鱸魚加工副產物進行處理，將雜蛋白溶解除去，然後在脫 鈣脫脂。在鹼性溶液對海鱸魚加工副產物溶解雜蛋白的同時，由於鹼性溶液的水解作用，使 得膠原蛋白的三股螺旋結構被打開，有利於提高後續酶解效果。
[0008] 進一步地，所述步驟（1)中具體處理步驟為：往海鱸魚加工副產物中添加其質量 15~20倍的0. lmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡15~30h，以去除雜蛋白；用蒸餾水洗至中性，再用 其質量15~20倍的0. 6mol/L的鹽酸浸泡15~30h以脫鈣；用蒸餾水洗至中性，最後用其質量 2?3倍的8?12%的乙醚浸泡15?30h，反覆兩次，共脫脂4(T48h。
[0009] 進一步地，所述步驟（2)中具體處理步驟為：脫脂完成後，海鱸魚加工副產物經蒸 餾水洗滌，浙幹，用等量的〇. 5mol/L的乙酸溶液浸泡2?3d，400(T4500r/min離心15?20min 後取上清，冷凍乾燥後，以海鱸魚加工副產物的乾重計，膠原蛋白得率為10-22%。
[0010] 進一步地，所述步驟⑶中膠原蛋白溶液的質量體積濃度為1〇%，所用蛋白酶為鹼 性蛋白酶。鹼性蛋白酶的酶解條件是：酶添加量為底物重量的2~3%、酶解溫度45飛0°C、酶 解時間2?4h和pH值8. 5?9. 5,在此條件下膠原蛋白肽提取率為4(Γ48. 6%。
[0011] 進一步地，所述步驟（4)中，滅酶操作是：9(T95°C水浴加熱l(Tl5min滅酶。
[0012] 進一步地，所述步驟（5)中脫腥脫色條件為：加入膠原蛋白重量4~6%的活性炭， 45°C 水浴加熱 40-50min。
[0013] 進一步地，所述步驟（6)中的具體操作為：4000?4500r/min離心15?20min。
[0014] 進一步地，所述步驟（7)中的具體操作為：依次採用3000Da和lOOODa的超濾膜截 留離心後的上清液，分離得到100(T3000Da的膠原蛋白肽組分。
[0015] 進一步地，所述步驟（8)中的具體操作為：將分離得到的膠原蛋白肽組分於50°C 旋轉蒸發20-30min。
[0016] 進一步地，所述步驟（9)中的具體操作為：-80至-20°C冷凍乾燥4(T48h即可得海 鱸魚膠原蛋白肽產品。
[0017] 本發明所得的海鱸魚膠原蛋白肽產品含苯丙氨酸20~50μ g/100mg，甘氨酸 30?50 μ g/100mg，賴氨酸 10?20 μ g/100mg。
[0018] 本發明與現有技術相比具有以下有益效果： (1)本發明以成纖維細胞增殖活性為評價指標，篩選採用鹼性蛋白酶結合膜分 離技術來製備具有傷口癒合作用的生物活性肽，分子量在1000-3000Da，含苯丙氨酸 20?50 μ g/100mg，甘氨酸30?50 μ g/100mg，賴氨酸10?20 μ g/100mg，通過動物實驗驗證該 生物活性肽可以增加傷口組織的羥脯氨酸含量和促進傷口癒合，因此可用作創傷患者專用 臨床營養品的配料。
[0019] 本發明製備的海鱸魚膠原蛋白肽促進傷口癒合的動物實驗結果： 1、試驗條件 1. 1樣品 本發明製備的海鱸魚膠原蛋白肽粉末（SBCP )。
[0020] 1.2實驗動物 KM小鼠，雄性，體重18-22g，SPF級，由南方醫科大學實驗動物中心提供。
[0021] 1.3分組及處理 (1)分組 KM小鼠72隻，適應性餵養1周後隨機分為4組，每組18隻，包括對照組（Control)和3 個SBCP劑量組。SBCP低劑量組（Low)給藥濃度為0. 2g/ kg*bw，SBCP中劑量組（Moderate) 給藥濃度為0.66 g/ kg*bw，高劑量組（High)給藥濃度為2.0 g/ kg*bw。
[0022] (2)處理 每日除了飼餵各組小鼠2 g/10g*bw基礎飼料，還需在上午11 :00灌胃相應的藥物，灌 胃體積為200yl/10g*bw。對照組給予等體積生理鹽水灌胃。分別在第5、9、15天各組隨機 挑選6隻小鼠拉頸處死。
[0023] 1. 4數據分析 採用SPSS進行數據分析。
[0024] 2、實驗結果 2. 1海鱸魚膠原蛋白肽對小鼠皮膚傷口癒合率的影響如表1和圖1所示：
【權利要求】
1. 一種酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法，其特徵在於，包括 以下步驟： (1) 預處理：將海鱸魚加工副產物洗淨絞碎，依次經鹼性溶液脫雜蛋白、酸脫鈣和脫脂 處理，除去雜蛋白及雜質，並打開膠原蛋白的三股螺旋結構，便於酶解； (2) 膠原蛋白的提取：加酸提取預處理後海鱸魚加工副產物中的膠原蛋白，冷凍乾燥 後得到的膠原蛋白粉作為下一步酶解製備膠原蛋白肽的底物； (3) 酶解：加水製成膠原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶進行酶解，將膠原蛋白轉化成膠 原蛋白膚； (4) 滅酶：對得到的酶解液進行滅酶，冷卻； (5) 脫腥脫色：向滅酶後的酶解液中加入適量活性炭，以脫腥脫色； (6) 離心：將脫腥脫色後的酶解液離心，取上清液； (7) 膜分離：通過膜分離截留上清液中分子量100(T3000Da的膠原蛋白肽組分； (8) 濃縮：將膜分離所得的膠原蛋白肽組分旋轉蒸發濃縮，便於凍幹； (9) 凍幹：將濃縮後上清液冷凍乾燥成粉末，即為成品，於乾燥條件下貯存起來。
2. 根據權利要求1所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特徵在於，所述步驟（1)中具體處理步驟為：往海鱸魚加工副產物中添加其質量15~20倍 的0. lmol/L的氫氧化鈉溶液浸泡15~30h，以去除雜蛋白；用蒸餾水洗至中性，再用其質量 15~20倍的0. 6mol/L的鹽酸浸泡15~30h以脫鈣；用蒸餾水洗至中性，最後用其質量2~3倍 的8?12%的乙醚浸泡15?30h，反覆兩次，共脫脂4(T48h。
3. 根據權利要求1所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特徵在於，所述步驟（2)中具體處理步驟為：脫脂完成後，海鱸魚加工副產物經蒸餾水洗 滌，浙幹，用等量的〇. 5mol/L的乙酸溶液浸泡2?3d，400(T4500r/min離心15?20min後取上 清，冷凍乾燥後，以海鱸魚加工副產物的乾重計，膠原蛋白得率為10-22%。
4. 根據權利要求1所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特徵在於，所述步驟（3)中膠原蛋白溶液的質量體積濃度為10%，所用蛋白酶為鹼性蛋白 酶。
5. 根據權利要求4所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方 法，其特徵在於，所述鹼性蛋白酶的酶解條件是：酶添加量為底物重量的2~3%，酶解溫度 45?50°C，酶解時間2?4h和pH值8. 5?9. 5,所得膠原蛋白肽提取率為4(Γ48. 6%。
6. 根據權利要求1所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特徵在於，所述步驟（4)中，滅酶操作是：9(T95°C水浴加熱l(Tl5min滅酶。
7. 根據權利要求1所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特徵在於，所述步驟（5)中脫腥脫色條件為：加入膠原蛋白重量4~6%的活性炭，45°C水浴 加熱 40_50min。
8. 根據權利要求1所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特徵在於，所述步驟（7)中的具體操作為：依次採用3000Da和lOOODa的超濾膜截留離心 後的上清液，分離得到l〇〇(T3000Da的膠原蛋白肽組分。
9. 根據權利要求1所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠原蛋白肽的方法， 其特徵在於，所述步驟（6)中的具體操作為：400(T4500r/min離心15?20min ;所述步驟（8) 中的具體操作為：將分離得到的膠原蛋白肽組分於50°C旋轉蒸發20-30min ;所述步驟（9) 中的具體操作為：_80至_20°C冷凍乾燥4(T48h即得海鱸魚膠原蛋白肽產品。
10.由上權利要求1、任一項所述的酶法製備具有促進傷口癒合活性的海洋膠 原蛋白肽的方法製備的海洋膠原蛋白肽，其特徵在於，所得的海鱸魚膠原蛋白肽的分 子量為100(T3000Da，含苯丙氨酸2(Γ50 μ g/100mg，甘氨酸3(Γ50 μ g/100mg，賴氨酸 10?20 μ g/100mg。
【文檔編號】C07K14/78GK104109705SQ201410274645
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】劉磊, 張名位, 魏振承, 張瑞芬, 鄧媛元, 唐小俊, 池建偉, 李健雄 申請人:廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所, 廣東寶桑園健康食品有限公司, 廣州力衡臨床營養品有限公司