蛋白質類泛素化修飾(sumo)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立方法

2023-09-22 14:49:20

專利名稱：蛋白質類泛素化修飾(sumo)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立 方法。
背景技術：
蛋白質類泛素化修飾(Small Ubiquitin-Related Modifier, SUMO)是一種與泛 素化修飾過程極其相似的小分子蛋白質翻譯後修飾。越來越多的蛋白質被發現存在SUMO 化修飾，它們涉及細胞生命活動的各個方面，如蛋白質穩定性、轉錄調控、蛋白質定位、信號 轉導、染色體分離、細胞周期調控和病毒感染應答等(Gill，G. (2005) Somethingabout SUMO inhibits transcription. Current opinion in genetics &development 15 :536-541)。 在許多人類疾病如癌症和神經退化性疾病中，SUMO化修飾作用對疾病的發生與發展起著極 為重要的作用。因此闡明SUMO化修飾的功能，將為疾病的治療開闢一條嶄新的思路。
蛋白質SUMO化修飾是一個多步驟酶促反應，El， E2， E3三類酶相繼參與此反應過 程，最終將SUMO分子共價結合於底物。SUMO激活酶(El)為Aos 1/Uba2， SUMO結合酶(E2)為 Ubc9，SUM0連接酶(E3)有PIAS，Pc2，RanBP2三類(Melchior，F. (2000) SUMO—nonclassical ubiquitin. Annual review of cell and developmentalbiology 16:591-626)。
SUMO化修飾途徑非常保守。哺乳動物體內存在四種亞型的SUMO :SUMOl、 SUM02、 SUM03和SUM04。 SUM01由101個胺基酸殘基組成，與SUM02、 SUM03和SUM04的同源性大 約為50%，與泛素分子有18%的同源性。SUM02、 SUM03和SUM04之間同源性更高(Guo，
D. ， Li， M. ， Zhang， Y. ， Yang， P. (2004)A f皿ctionalvariant of SUM04， a new I kappa B alpha modifier, is associated withtype 1 diabetes. Nature genetics 36:837-841)。 不同亞型的SUMO蛋白有各自的特異性，表現在亞細胞定位，底物選擇性等方面(Saitoh, H. &Hinchey， J. (2000)Functional heterogeneity of small ubiquitin-relatedprotein modifiers SUM0-1 versus SUM0-2/3.The Journal of biologicalchemistry 275 : 6252-6258)。 SUMO化修飾途徑中惟一的E2酶Ubc9的功能缺失可引起多種模式生物體發育缺 陷和致死。但不同亞型的SUMO蛋白在體內各自的生物功能尚不清楚。在較為低等的且僅 有一種類型SUM0表達的生物體中，SUM0對胚胎的正常發育是必需的(Jones， D. ， Crowe，
E. ， Stevens, T.A. ， & Candido， E. P. (2002)Functional and phylogeneticanalysis of the ubiquitylation system in Caenorhabditis elegans :ubiquitin_conjugating enzymes,ubiquitin—activating enzymes,andubiquitin—like proteins. Genome biology 3 :RESEARCH0002)。而最近的基因敲除(knockout)結果顯示SUM01不是小鼠胚胎發育所 必需的(Zhang， F. P. ， Mikko體，L. ， Toppari， J. ， Palvimo， J.J. (2008) S翻-lf皿ction is dispensable in normal mouse development. Molecular andcellular biology 28: 5381-5390)。

發明內容
因此，為了研究不同SUM0亞型各自的功能，本發明運用Morpholino技術在模式生 物體斑馬魚早期胚胎發育過程中單獨/聯合沉默(knockdown)各SUMO亞型基因的表達，以 提供蛋白質類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型，以作為蛋白質翻譯後修 飾相關藥物篩選的動物模型。 本發明的一個目的是提供蛋白質類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚 模型以及建立該模型的方法。 本發明的蛋白質類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型利用 Morpholino技術在模式生物體斑馬魚早期胚胎發育過程中將SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 3 所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯合顯微注射入單細胞期的斑馬魚卵中以單獨或 聯合沉默各SUMO亞型基因的表達而建立。 本發明的蛋白質類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型的建立方法 包括將SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 3所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯合顯微注 射入單細胞期的斑馬魚卵中的步驟以及持續培養並在倒置解剖顯微鏡下觀察整體表型的 步驟。 在模式生物體斑馬魚中存在SUM01、SUM02和SUM03三種亞型的SUM0蛋白表達。本 研究發現Morpholino基因沉默結果顯示，與Ubc9缺失的表型相似，三種亞型SUMO聯合缺 失的胚胎表現出最為嚴重的發育缺陷；而基因沉默單一亞型SUMO或聯合基因沉默SUM01/ SUM02的胚胎無明顯異常表型；SUM01/SUM03或SUM02/SUM03聯合基因沉默的胚胎發育缺陷 率較低。斑馬魚胚胎發育缺陷主要包括頭部發育異常，出現小頭、小眼和頜部畸型，並且胚 胎致死。 因此，本發明還提供所述蛋白質類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚 模型作為蛋白質翻譯後修飾相關藥物篩選的動物模型的用途。


圖1A為斑馬魚胚胎發育各時相UBC9表達譜，
其中，Hpf :受精後小時；lateral :側向；dorsal :背向；
圖IB為斑馬魚胚胎發育各時相SUMO各亞型表達譜，
其中，Hpf :受精後小時；lateral :側向；dorsal :背向；
圖2顯示Morpholino寡核苷酸測效結果， 其中，Con :對照;Mis :錯配對照;actin :肌動蛋白，A為Morpholino寡核苷酸測 效實驗結果(a， b， c， d， e， f， g， h， i為螢光顯微鏡下視野，a'至i'為光學顯微鏡下同一視 野)，B和C均為蛋白印跡(Western blot)結果；
圖3顯示錶型分析， 其中，a， b， c表示倒置光學解剖顯微鏡下分別注射錯配Morpholino寡核苷酸 (Mis) ;SUMOl， SUM02, SUM03 Morpholino寡核苷酸聯合注射(MO s翻l-s翻2-s翻3);注 射UBC9 Morpholino寡核苷酸(MO ubc9)的胚胎的表型。d， e， f為同一胚胎Alcian blue 染色顯示軟骨組織結構。g， h分別為注射錯配Morpholino寡核苷酸(Mis) ;SUMOl， SUM02,
4SUM03 Morpholino寡核苷酸聯合注射(M0sumol-sumo2-sumo3)進行HE染色顯示胚胎眼部 結構； 圖4顯示TUNEL實驗及pH3 (antiphosphorylated histone H3)免疫螢光實驗結 果， 其中，a， b分別表示注射錯配Morpholino寡核苷酸(Mis) ;SUMOl， SUM02, SUM03 Morpholino寡核苷酸聯合注射(M0s咖ol-s咖o2-s咖o3)的胚胎頭部TUNEL實驗顯示凋亡 細胞。c，d分別表示這兩種胚胎PH3實驗結果。e，f為c，d的局部放大細節圖。g，h顯示 注射錯配Morpholino寡核苷酸(Mis) ;SUM01， SUM02， SUM03Morpholino寡核苷酸聯合注射 (M0 s咖ol-s咖o2-s咖o3)的胚胎頭部細胞的流式細胞儀檢測結果。i和j顯示這兩種胚胎 軀幹細胞的流式細胞儀檢測結果；
圖5為PCS2+表達載體圖譜。
具體實施例方式
結合附圖，本發明將參照以下實施例進行詳細說明，但這不應成為對本發明的限 制。 實施例1 1、斑馬魚的養殖 斑馬魚的飼養、繁殖與分齡依照經典方法進行(Kimmel， C. B. ， Ballard, W. W.， Kimmel， S. R. ， Ullma皿，B. (1995)Stages of embryonicdevelopment of the zebrafish. Dev Dyn 203 :253-310)。 2、 Morpholino (M0)寡核苷酸片段的合成與顯微注射 Morpholino (M0)寡核苷酸片段由Gene Tools公司合成。斑馬魚各基因
Morpholino寡核苷酸片段序列如下 SUM01 M0 GTCTCCGTGTCTGACATGATATTCC (SEQ ID NO. 1) SUM02 M0 CATGGTTATTGTATTTGCGCTTCTC (SEQ ID NO. 2) SUM03 M0 TAGGCTTGTCTTCGGACATTTTTGC (SEQ ID NO. 3)Ubc9M0 TCAGAGCAATGCCAGACATGACCAC (SEQ ID NO. 4)錯配MO (Mismatch MO) GTGTCCCTGTCTCACATCATATACC (SEQ ID NO. 5) 其中，Ubc9M0作為陽性對照MO ;錯配MO作為錯配陰性對照M0。 將各Morpholino (MO)寡核苷酸片段溶於超純水中，以如下顯微注射劑量，注射入
單細胞期的斑馬魚卵中 單一注射劑量錯配MO，SUMOl M0，SUM02 M0， SUM03M0， Ubc9 MO均為12. 46ng/卵。
聯合注射劑量SUM01/SUM02 M0， SUM01/SUM03 M0， SUM02/SUM03， SUM01/SUM02/ SUM03M0，各4. 15ng/卵。
顯微注射後即將胚胎培養於egg溶液(egg solution)中(配方純水9升，海鹽 0. 54克，100微升0. 2%亞甲基藍)並置於28. 5。C恆溫培養箱中持續培養，在附圖中所示時
相於倒置解剖顯微鏡下觀察表型並進行相關實驗，具體相關實驗見下文。
3、質粒構建與體外轉錄 斑馬魚Ubc9和各SUMO基因由RT-PCR (按常規方法抽提斑馬魚總RNA，總RNA提取 應用Trizol試劑(Gibco公司)。取1 y g RNA用M-MLV (Promega公司)300U進行逆轉錄， 引物使用試劑盒中提供的oligo dT引物。PCR擴增反應總體積為100 iU，內含1Xbuffer， 3. 75mmol/L MgC12、0. 2mmol/L dNTP、正反向引物各0. 35 ii mol/L、1 ii 1逆轉錄產物、0. 05U/ ii 1高保真Taq DNA聚合酶(Takara公司)。反應程序95。C 2min， 1個循環；95。C 60s、 50°C 60s、72°C 2min，30個循環；72。C延伸7min，4t:保存。)獲得，並克隆入PCS2+表達載 體中(PCR擴增產物連接到PCS2+表達載體中，轉化DH5a感受態細胞，經平板篩選單克隆， 擴增後抽提質粒DNA，然後酶切鑑定。用末端螢光標記法進行DNA序列分析。所獲測序結果 通過Blast軟體與GenBank收錄序列進行同源性比較得到正確克隆。)，其中表達載體的結 構如圖5中所示。 斑馬魚Ubc9和各SUM0基因全長基因的各克隆引物序列如下(其中"For"表示正 ;"Rev"表示反向引物)
向引物
















SUM01 For
Rev
SUM02 For
Rev
SUM03 For
CCGGAATTCATGTCAGACACGGAGACCAAGCCCTC
(SEQ ID NO. 6) CCGCTCGAGGCGAGGCTCTCGTGAAGGCAGGTATG
(SEQ ID NO. 7) CCGGAATTCCTTTGTGTGGCGGCGTAGAGAAGCGC
(SEQ ID NO. 8) CCGCTCGAGGTATCTGAAGCAGAACAAACCCTGAAC
(SEQ ID NO. 9) CCGGAATTCGCGCGTCTTGTGTTCTAATC
(SEQ ID NO. 10) CCGCTCGAGCTACACCCTCCCTCGATGTTTGCTCTC
(SEQ ID NO. 11) CCGGAATTCATGTCTGGCATTGCTCTGAGTCGAC
(SEQ ID NO. 12) CCGCTCGAGCTGATCGAGAAGGGGAACAGAGCG
(SEQ ID NO. 13)
將各全長基因克隆進行體外轉錄用限制酶Kpnl消化質粒製備線性模板DNA ;用
酚氯仿抽提及乙醇沉澱純化模板DNA ;將DNA溶解於水；在一微量離心管中，室溫下以下
列順序混合模板DNA lug， 2 ill 10 X轉錄緩衝液，2 ii 1噬菌體依賴於DNA的RNA聚合酶
(約10單位)，補無RNA酶的水加至20 iU。 37t:下溫育反應物2小時。 RNA轉錄本用於原位雜交實驗。 斑馬魚Morpholino測效質粒克隆序列如下 測效質粒是指在正式實驗前將所要沉默的基因啟始密碼子ATG左右各約50bp
Ubc9
Rev
For
Rev序列與EGFP螢光基因融合入同一質粒中，體外轉錄出mRNA，將此融合轉錄本單獨或與相 應的Morpholino寡核苷酸共注射入單細胞期的斑馬魚卵中，在螢光顯微鏡下觀察共注射 Morpholino寡核苷酸的胚胎中EGFP的表達是否消失，以此判斷各Morpholino寡核苷酸沉 默外源性SUMO分子表達的有效性，判斷出各Morpholino寡核苷酸片段的有效性之後即開 展正式實驗。 採用如下引物將各所需沉默基因用PCR方法擴增出(條件同上)，該克隆包含各基 因啟始密碼子ATG左右各約50bp序列(其中"For"表示正向引物；"Rev"表示反向引物) SUM01 For CCGGAATTCCTGCTGGTAGCACTAGCAAAACCTCTC (SEQ ID NO. 14) Rev CCGCTCGAGGGTCAGGTTGTCTGTGATTCTCTGTCC (SEQ ID NO. 15) SUM02 For CCGGAATTCGTGTGGCGGCGTAGAGAAG (SEQ ID NO. 16) Rev CCGCTCGAGCTTCAGGTTGATGTGGTCG (SEQ ID NO. 17) SUM03 For CCGGAATTCGCGCGTCTTGTGTTCTAATC (SEQ ID NO. 10) Rev CCGCTCGAGCGCCACCTTCAGATTGATGTG (SEQ ID NO. 18) 將上述SUMOl， SUM02, SUM03擴增片段分別按閱讀框架插入PCS2-EGFP載體(即在
附圖中PCS2載體多克隆位點中已插入一個EGFP螢光基因)的多克隆位點中，體外轉錄出 含目的基因與EGFP的融合轉錄本。將此融合轉錄本單獨或與相應的Morpholino寡核苷酸 共注射入單細胞期的斑馬魚卵中，在螢光顯微鏡下觀察共注射Morpholino寡核苷酸的胚 胎中EGFP的表達是否消失，以此判斷各Morpholino寡核苷酸沉默外源性SUMO分子表達的 有效性，單獨注射融合轉錄本的胚胎由於EGFP的表達，會在螢光顯微鏡下發出綠色螢光； 而融合轉錄本與相應的Morpholino寡核苷酸共注射的胚胎，如果Morpholino能夠特異性 沉默融合轉錄本的翻譯，那綠色螢光的表達也會隨之消失，如果該綠色螢光的表達仍然存 在，說明Morpholino不能特異性地沉默目的基因的表達。
4、原位雜交 SUMOl， SUM02, SUM03和UBC9各反義RNA探針(用體外轉錄試劑盒將上述已克 隆的各全長基因轉錄成反義RNA探針)體外合成(Roche)，原位雜交與檢測按已報導方 法進行(Be騰tt， C. M. ， Kanki， J. P. ， Rhodes, J. ， Liu， T. X. (2001)Myelopoiesis in the zebrafish， Daniorerio. Blood 98 :643-651)。
5、蛋白印跡(Western blot): 顯微注射3天後，提取胚胎細胞總蛋白進行SDS PAGE電泳後轉至硝酸纖維素膜 (Invitrogen)，封閉，用肌動蛋白(actin)抗體做為上樣量參考(Sigma公司)；SUMOl抗 體和SUM02/3抗體(均為Zymed公司)雜交，SuperSignal West Pico化學發光法試劑盒 (Pierce公司)檢測，觀察各Morpholino寡核苷酸沉默內源性SUMO分子表達的有效性。
6、組織和細胞化學染色
HE和Alcian blue染色均按已報導方法進行(Robu， M. E. ， Larson, J. D.， Nasevicius, A. ， Beiraghi， S. (2007)p53 activation by knockdowntechnologies. PLoS genetics 3 :e78)。 7、細胞凋亡原位檢測(TUNEL)實驗，pH3免疫螢光實驗和流式細胞儀(FACS)檢測 TUNEL試劑盒購自Roche公司，按推薦方法進行。 pH3免疫螢光實驗試劑盒購自Invitrogen公司，按推薦方法進行。FACS檢測按已報導方法進行(Nowak， M. & Hammerschmidt， M. (2006) Ubc9
regulates mitosis and cell survival during zebrafishdevelopment. Mol Biol Cell
17 :5324-5336)。 實驗結果 1. SUMO和Ubc9在斑馬魚胚胎發育早期的時空表達譜 斑馬魚中存在三種SUMO亞型，這三種SUMO分別和人的相應亞型具有高度的同源 保守性。本發明利用全胚胎原位雜交的方法檢測了三種亞型的SUMO及Ubc9在斑馬魚胚胎 發育早期的時空表達情況(如圖1中所示)。在受精後24小時左右，SUMO及Ubc9全身廣 泛表達，24小時到48小時，表達主要集中在細胞高增殖區，包括神經系統、眼睛、神經嵴細 胞(neural crest cell)、胸鰭芽細胞(pectoral f inbud)，到72小時左右，表達則主要集 中在鰓弓和消化系統。 2.基因沉默SUMO蛋白的表達導致斑馬魚早期胚胎發育異常 為了研究SUMO在斑馬魚胚胎發育早期的生物學功能，本發明採用了 morpholino 基因沉默技術。預初實驗顯示SUM0 M0及Ubc9M0能夠有效地沉默相應的耙基因表達(如 圖2中所示)，驗證了 M0引物的有效性。圖2中，A為Morpholino寡核苷酸測效實驗結果。 結果顯示單獨注射融合轉錄本的胚胎和共注射錯配Morpholino寡核苷酸的胚胎由於EGFP 的表達，會在螢光顯微鏡下發出綠色螢光；而融合轉錄本與相應的Morpholino寡核苷酸共 注射的胚胎，由於Morpholino能夠特異性沉默融合轉錄本的翻譯，綠色螢光的表達也隨之 消失，說明了我們所用的Morpholino寡核苷酸針對目的基因的有效性。A說明免疫螢光實 驗顯示各亞型特異性Morpholino寡核苷酸有效地阻止了相應SUMO 1，2，3(c，f， i)蛋白質 的翻譯；B和C均為蛋白印跡(Western blot)結果。胚胎顯微注射3天後，提取細胞總蛋 白進行Western blot檢測，結果顯示未注射胚胎和注射錯配Morpholino寡核苷酸的胚胎 中SUMO和UBC9的表達不變，而注射相應的Morpholino寡核苷酸的胚胎中，SUMO和UBC9的 蛋白質表達大大減弱，也說明了我們所用的Morpholino寡核苷酸針對目的基因的有效性。 B和C說明蛋白印跡實驗同樣顯示Morpholino寡核苷酸有效地阻止了 SUM0(B)和ubc9 (C) 蛋白質的翻譯。當聯合基因沉默三種亞型的SUMO後，發育72小時後，胚胎出現表型異常， 具體表現為頭部及眼睛變小，鰓弓出現異常，而耳部及軀幹發育正常。Ubc9基因沉默實驗也 出現類似表型(如圖3中所示)。圖3中，當聯合基因沉默三種亞型的SUM0後(b)，胚胎出 現頭部及眼睛變小，鰓弓出現異常，而耳部及軀幹發育正常。Ubc9基因沉默實驗也出現類似 表型(c)。 Alcian blue染色結果顯示斑馬魚頭部第一到第四鰓弓(gillarch)縮短或缺 失，而第五鰓弓仍然存在，鰓弓軟骨細胞形態變圓，體積增大(e)。組織化學染色眼部切片顯 示眼部細胞各層都存在，僅出現細胞數量減少(h)。 Alcian blue染色結果顯示斑馬魚 頭部第一到第四鰓弓(gill arch)縮短或缺失，而第五鰓弓仍然存在，鰓弓軟骨細胞形態變
8圓，體積增大。 3. SUMO各亞型的缺失導致細胞周期阻滯和細胞凋亡 為了進一步闡述上述表型是由細胞增殖減少或是細胞凋亡增多所引起，我們進行 了 TUNEL實驗及pH3(antiphosphorylated histoneH3)免疫螢光實驗(如圖4中所示)。 TUNEL實驗結果顯示，聯合基因沉默SUMO 48小時後，在中後腦邊界及眼部出現大量的凋亡 細胞(b)， pH3免疫螢光實驗結果顯示，這些區域同時出現了大量pH3陽性細胞(d， f)。為 了進一步檢測細胞周期是否受到影響，流式細胞儀分析顯示，頭部細胞出現了明顯的細胞 周期G2/M期阻滯(g，h)，而軀幹細胞則沒有受到影響(i， j)。 通過上述實驗結果證實本發明成功建立了蛋白質類泛素化修飾(SUM0)缺失型模 式生物體斑馬魚模型，從而為蛋白質翻譯後修飾相關藥物的篩選提供了很好的動物模型。
討論 1.三種亞型的SUMO是斑馬魚胚胎早期發育所必需的 SUM0化修飾在許多細胞生命活動中發揮重要功能。雖然已經有報導證實Ubc9在 斑馬魚胚胎早期發育有重要作用，但各SUMO亞型相應的生物學功能仍然未知。這裡我們證 實了類似於基因沉默Ubc9，聯合基因沉默各SUM0亞型導致胚胎早期發育異常並致死。值得 注意的是，基因沉默Ubc9後異常胚胎的比率更高於基因沉默SUM0(97. 5% vs 84. 9% )。提 示基因沉默Ubc9的效率更高於聯合基因沉默SUM0各亞型，可能是Ubc9除了作為SUM0化 途徑的E2連接酶外，還具有其他功能。 2.三種亞型的SUM0在斑馬魚胚胎早期發育過程中存在冗餘性
與Ubc9基因沉默的表型相似，三種亞型的SUMO聯合基因沉默的胚胎表現出最為 嚴重的發育缺陷；而基因沉默單一亞型的SUMO或聯合基因沉默SUM01/SUM02的胚胎無明 顯異常表型；SUM01/SUM03或SUM02/SUM03兩兩聯合基因沉默的胚胎發育缺陷率較低。這 與在小鼠與擬南芥菜中沉默某種亞型的SUMO得到的結果相類似(Zhang， F. P. ， Mikkonen， L. ， Toppari， J. ， Palvimo， J. J. (2008)S咖o-1 function is dispensable in normal mouse development. Molecularand cellular biology 28 :5381-5390禾口 Saracco， S. A.， Miller, M.J. ， Kur印a， J. ， & Vierstra， R. D. (2007) Genetic analysis of SUMOylation inArabidopsis -conjugation of SUM01 and SUM02 to nuclear proteins isessential. Plant physiology 145 :119-134)。提示三種亞型的SUMO在斑馬魚胚胎早期發育過程中存 在一定的冗餘性。 3. SUMO缺失後造成特異性的細胞周期阻滯和細胞凋亡 最近有報導證實SUMO參與了哺乳動物細胞的有絲分裂過程，SUMO缺失後， 可能阻止了姐妹染色單體的正常分離，從而導致了細胞周期阻滯，最終引起細胞凋亡 (Zhang， X. D. ， Goeres， J. ， Zhang， H. ， Yen, T.J. (2008) SUM0-2/3 modification and binding regulate theassociation of CENP—E with kinetochores and progression throughmitosis. Molecular cell 29:729-741)。
序列表 〈110〉上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 〈120〉蛋白質類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立方法
〈130>DI08-205HC37
9
〈160>18〈170>PatentIn version3. 3〈210〉1〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gtctccgtgt ctgacatgatattcc〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2catggttatt gtatttgcgcttctc〈210>3〈211>25DNA〈213〉人工序列〈400>3taggcttgtc ttcggacatttttgc〈210>4〈211>25〈212>DNA人工序列〈400>4tC3g3gC朋t gCC3g3C3tg〈210>525〈212>腿〈213〉人工序列〈400〉5gtgtccctgt ctcacatcatatacc〈210>6〈211>35〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ccggaattca tgtcagacacgg3g3CC33g ccctc〈210>7
25
25
25
25
25
35
10:0149]
:0150] :0151]
:0152] :0153]
〈211>35
〈212>DNA 〈213〉人工序列
〈400>7
ccgctcgagg cgaggctctc gtgaaggcag gtatg
:0154] 〈210>8
:0155] 〈211>35
:0156] 〈212>DNA
:0157] 〈213>人工序列
:0158] 〈400>8
:0159] ccggaattcc tttgtgtggc ggcgtagaga agcgc 35
:0160] 〈210>9
:0161] 〈211>36
:0162] 〈212〉DNA
:0163] 〈213>人工序列
:0164] 〈400>9
:0165] ccgctcgagg tatctg朋gc agaacaaacc ctg朋c 36
:0166] 〈210>10
:0167] 〈211>29
:0168] 〈212〉DNA
:0169] 〈213>人工序列
:0170] 〈400〉 10
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:0172] 〈210>11
:0173] 〈211>36
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:0175] 〈213>人工序列
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:0180] 〈212>DNA
:0181] 〈213>人工序列
:0182] 12 ccggaattca tgtctggcat tgctctgagt cgac 34 〈210〉 13 〈211〉33 〈212>DNA 〈213>人工序列
110188]〈400>13
0189]ccgctcgagc tgatcgagaagggg朋c卿gcg
0190]〈210〉14
0191]〈211〉36
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0194]14
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0199]〈213〉人工序列
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:0201]ccgctcgagg gtcaggttgtctgtgattct ctgtcc
:0202]16
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:0204]〈212>DNA
:0205]〈213〉人工序列
:0206]〈400〉16
:0207]ccggEuattcg tgtggcggcg
:0208]〈210>17
:0209]〈211〉28
:0210]〈212〉腿
:02"]〈213>人工序列
:0212]〈400>17
:0213]ccgctcgagc ttcaggttgatgtggtcg
:0214]〈210〉18〈211〉30〈212>DNA〈213〉人工序列18ccgctcgagc gccaccttcagattgatgtg
33
36
36
28
28
30
1權利要求
一種蛋白質類泛素化修飾缺失型模式生物體斑馬魚模型，其中，該模型利用Morpholino技術在模式生物體斑馬魚早期胚胎發育過程中將SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯合顯微注射入單細胞期的斑馬魚卵中以單獨或聯合沉默各SUMO亞型基因的表達而建立。
2. —種建立蛋白質類泛素化修飾缺失型模式生物體斑馬魚模型的方法，其包括將SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 3所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯合顯微注射入單細胞期 的斑馬魚卵中的步驟以及持續培養並在倒置解剖顯微鏡下觀察整體表型的步驟。
3. 權利要求1所述的蛋白質類泛素化修飾缺失型模式生物體斑馬魚模型作為蛋白質 翻譯後修飾相關藥物篩選的動物模型的用途。
全文摘要
本發明涉及蛋白質類泛素化修飾(SUMO)缺失型模式生物體斑馬魚模型及其建立方法，該模型利用Morpholino技術在模式生物體斑馬魚早期胚胎發育過程中將SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的Morpholino寡核苷酸片段單一或聯合顯微注射入單細胞期的斑馬魚卵中以單獨或聯合沉默各SUMO亞型基因的表達而建立。
文檔編號C12N15/87GK101748121SQ20081020412
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月5日 優先權日2008年12月5日
發明者周雋, 朱軍 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院