一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗製備方法與流程

2023-09-22 14:57:40 1

本發明涉及一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗的製備方法，其中包括如下特徵：將構建成微小rna145-5p(microrna145-5p，mir-145-5p)的基因片段重組到載體質粒上，通過脂質體轉染人未成熟樹突狀細胞(dendriticcells，dcs)，並負載腫瘤細胞裂解抗原後，製備成樹突狀細胞疫苗；mir145-5p在樹突狀細胞中過表達可以抑制免疫負調控作用的信號調控蛋白α的表達，增強樹突狀細胞適應性免疫活性。

背景技術：

樹突狀細胞是機體內最大抗原遞呈細胞，可激活機體淋巴細胞產生抗腫瘤和抗病毒的適應性免疫反應，是目前在國內外臨床治療癌症和病毒的常見免疫細胞技術。目前樹突狀細胞常用的培養技術為通過粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，gm-csf)、白介素4(interleukin4，il-4)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα，tnf-α)等其他因子誘導，並負載各類腫瘤抗原後得到樹突狀細胞疫苗，用於抗腫瘤臨床治療。

不過樹突狀細胞不僅具有激活抗腫瘤抗病毒的免疫反應，而且也可以表達免疫負調控因子，對dcs的免疫功能產生抑制作用。其中dcs表達信號調節蛋白α(signalregulatoryproteinα，sirpα)，其可以通過與特異性配體cd47相互作用發揮負向調節作用，我們能觀察到dc表型和功能的抑制，包括dc成熟標誌減少，細胞因子il-12分泌減少。因而抑制dcs表達sirpα，將能逆轉sirpα對dcs免疫負調控的作用。

本發明提供了以調控sirpα基因表達的mir-145-5p基因片段，重組到載體質粒上，通過脂質體轉染人未成熟dcs，並負載腫瘤細胞裂解抗原後，製備成樹突狀細胞疫苗。mir145-5p在樹突狀細胞中過表達將抑制免疫負調控作用的信號調控蛋白α的表達，將增強了其表達共刺激分子、分泌細胞因子能力和激活毒性t淋巴細胞活性的能力，在體內體外試驗抗腫瘤具有很強殺傷毒性，更加有助於提高臨床療效和延長患者生存期。

技術實現要素：

本發明針對現有技術培養的樹突狀細胞，並沒有抑制dcs中負調控因子的表達，這樣在臨床治療中共刺激分子表達較低，分泌細胞因子下降以及激活t林細胞因子特異性低與殺傷效果力度有限。我們前期研究中篩選得到dcs中負調控因子sirpα基因的調控微小rna，即mir145-5p，其可以調控dcs中負調控因子sirpα基因的表達，mir145-5p高表達能有效抑制sirpα基因的表達，從而增強了其對腫瘤細胞殺傷活性與臨床治療療效。

信號調節蛋白a是sirp家族中最主要的成員，並在髓系細胞包括樹突狀細胞中表達，sirpα通過與特異性配體cd47相互作用發揮負向調節作用。dcs表面的sirpα與t淋巴細胞表面的cd47相互結合，雙向負調節dc和t細胞功能，即抑制dcs活化，下調其抗原遞呈能力；並抑制t細胞增殖和殺傷功能，因而抑制dcs表達sirpα，將有助於產生對腫瘤細胞最佳的免疫活性。

本發明涉及一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗的製備方法，其中包括如下特徵：構建成微小rna145-5p的基因片段，重組到載體質粒上後通過脂質體轉染人未成熟樹突狀細胞，其負載腫瘤細胞裂解抗原後，製備成樹突狀細胞疫苗；微小rna145-5p在樹突狀細胞中過表達從而抑制免疫負調控作用的信號調控蛋白α的表達，增強了樹突狀細胞的適應性免疫活性。

本發明所述微小rna145-5p的基因片段為成熟體微小rna145，上下遊各延長200個鹼基，並在5』端和3』端加入限制性酶切位點，構建成微小rna145-5p重組片段。

將含成熟體微小rna145-5p基因序列24個鹼基，及其上下遊各200個鹼基與5』端kpni和3』端ecori的識別序列構成的基因序列通過化學合成獲得，即mir145-5p；將mir145-5p的目的dna片段重組到dna載體質粒上，獲得可以穩定複製並序列正確的mir145-5p/pcdna4。

本發明所述人未成熟樹突狀細胞，來源於人外周血、骨髓或臍帶血中單核細胞，經小鼠抗人抗cd14免疫磁珠分選獲得cd14陽性單核細胞，在重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、和重組人幹細胞生長因子和重組人白介素4誘導培養得到的未成熟樹突狀細胞。

本發明所述方法中dcs來源於自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單核細胞。優選地，來源於癌症患者手術一個月後、放化療一個月後採集的新鮮外周血或骨髓；更優選地，為經小鼠抗人抗cd14免疫磁珠分選獲得cd14陽性單核細胞。

本發明所述抑制sirpα表達的dcs疫苗製備方法是由上述mir145-5p/pcdna4通過脂質體轉染未成熟dcs，獲得穩定表達mir145-5p並靶向抑制sirpα表達的未成熟dcs；負載新鮮腫瘤組織來源的腫瘤細胞熱休克裂解的腫瘤抗原後，誘導獲得成熟dcs。

本發明所述方法中負載未成熟dcs的腫瘤抗原，為手術後新鮮腫瘤組織來源的，經消化分離後獲得腫瘤細胞，經超聲裂解後製備成腫瘤抗原。

優選地，腫瘤抗原通過熱休克後裂解製備成，即將腫瘤細胞懸液放置在43℃水浴鍋或金屬浴中熱休克0.5-4小時後製備成腫瘤抗原。

本發明所述方法中100ml外周血來源的單核細胞誘導培養獲得dcs疫苗，培養到8天細胞數達3×107以上；高表達共刺激分子，即cd83陽性率大於85％，cd86陽性率大於90％，cd80陽性率大於90％，4-1bbl陽性率大於80％；與未抑制dcs中負調控sirpα表達的成熟dcs疫苗(如其未成熟dcs按照下述文獻所述方法製備：fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.，然後負載與本申請相同的腫瘤細胞裂解抗原)相比，本發明獲得的dcs疫苗經螢光定量dna聚合酶鏈式反應(real-timepolymerasechainreaction，qrt-pcr)技術檢測sirpα基因表達顯著下調40倍以上；經酶聯免疫吸附測定試劑盒(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)檢測分泌的白介素12/p70提高20倍以上。

所述方法中的樹突狀細胞疫苗，與未抑制dcs中負調控sirpα表達的成熟dcs疫苗(如其未成熟dcs按照下述文獻所述方法製備：fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.，然後負載與本申請相同的腫瘤細胞裂解抗原)相比，激活t淋巴細胞增殖倍數為10倍以上，分泌的幹擾素γ(interferonγ，ifn-γ)提高10倍以上；在殺傷腫瘤細胞毒性實驗中效靶比40∶1時殺傷腫瘤細胞達到80％以上，顯著高於現有技術。

本發明使用的誘導成未成熟dcs的細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基或rpmi1640培養基加入5-200ng/mlgm-csf、1-50ng/ml幹細胞因子(stemcellsfactor，scf)和1-50ng/mlil-4和1-10％自體血清或胎牛血清，優選地，細胞培養基為rpmi1640培養基，含有20-100ng/mlgm-csf、5-20ng/mlscf和5-20ng/mlil-4和5％自體血清。

本發明使用的誘導成熟dcs的細胞培養基為淋巴細胞無血清培養基或rpmi1640培養基加入5-200ng/mlfms樣酪氨酸激酶3配體(fms1iketyrosinekinase3ligand，flt3l)，1-50ng/mltnfα和1-10％自體血清或胎牛血清，優選地，細胞培養基為rpmi1640培養基，含有10-50ng/mlflt3l，5-20ng/mltnfα和5％自體血清。

本發明還提供了上述方法製備dcs疫苗，可用於各類癌症包括實體瘤和血液腫瘤在內的多個療程的免疫治療。

附圖說明

圖1表示為構建的mir145-5p基因片段與pcdna4/to載體示意圖；

圖2表示為實施例二製備的mir145-5p/dc通過流式細胞儀檢測的共刺激分子表達水平；

圖3表示為實施例二和對比例製備的dcs疫苗通過qrt-pcr技術檢測mir-145-5p和sirpα基因表達水平；

圖4表示為實施例二和對比例製備的dcs培養的培養上清通過elisa試劑盒檢測il-12/p70分泌水平；

圖5表示為實施例二和對比例製備的dcs激活t淋巴細胞增殖曲線；

圖6表示為實施例二和對比例製備的dcs激活t淋巴細胞培養的培養上清通過elisa試劑盒檢測ifn-γ分泌水平；

圖7表示為實施例二和對比例製備的dcs激活的t淋巴細胞對u251細胞的殺傷活性；

圖8表示為荷人膠質瘤細胞系u251scid鼠模型實施例二和對比例製備的dcs激活的t淋巴細胞治療完之後腫瘤大小變化曲線。

具體實施方式

我們研究發現在樹突狀細胞中mir145-5p能有效抑制信號調節蛋白α基因的表達，而sirpα與特異性配體cd47結合在免疫功能起到負向調節作用，因而抑制樹突狀細胞表達sirpα，從而解除了sirpα對dcs免疫負調控的作用，激活t淋巴細胞增殖和殺傷活性，增強了其對腫瘤細胞殺傷活性與臨床治療療效。

對本發明涉及的一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗的製備方法的製備方法進行具體說明。

本發明涉及一種抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞疫苗的製備方法，其特徵在於，構建成微小rna145-5p的基因片段，重組到載體質粒上後通過脂質體轉染人未成熟樹突狀細胞，其負載腫瘤細胞裂解抗原後，製備成樹突狀細胞疫苗；微小rna145-5p在樹突狀細胞中過表達從而抑制免疫負調控作用的信號調控蛋白α的表達，增強了樹突狀細胞的適應性免疫活性。

本發明所述微小rna145-5p的基因片段為成熟體微小rna145，上下遊各延長200個鹼基，並在5』端和3』端加入限制性酶切位點，構建成微小rna145-5p重組片段。

將含成熟體微小rna145-5p基因序列24個鹼基，及其上下遊各200個鹼基與5』端kpni和3』端ecori的識別序列構成的基因序列通過化學合成獲得，即mir145-5p；

將mir145-5p的目的dna片段和pcdna4載體kpni和ecori雙酶切後，在t4dna連接酶作用下，將兩者於4℃、12小時連接反應製備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞dh5a後進行陽性克隆的pcr鑑定和測序鑑定，即mir145-5p/pcdna4；pcr產物凝膠電泳檢測和測序鑑定符合mir145-p5大小和序列後，將測序正確的菌液轉接於10ml含氨苄的lb液體培養基中，37℃培養過夜，用無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒通過核酸定量儀確定dna濃度，用去離子水稀釋到4ug/μl，然後將重組載體dna放置-80℃超低溫冰箱中長期保存。

本發明所述方法中樹突狀細胞來源於自體靜脈血、自體骨髓、臍帶血和胎盤血等的單核細胞。優選地，來源於癌症患者手術一個月後、放化療一個月後採集的新鮮外周血或骨髓；更優選地，為經小鼠抗人抗cd14免疫磁珠分選獲得cd14陽性單核細胞。

採集來源於患者自體外周血，經淋巴細胞分離液分離純化得到單個核細胞後，用1×pbs(ph值為7.4)重懸並稀釋到2-15×106細胞/ml，通過小鼠抗人抗cd14免疫磁珠分選獲得cd14陽性單核細胞，1500rpm離心10分鐘收集cd14單核細胞，並用rpmi1640培養基重懸並稀釋到1-5×106細胞/ml，並補充5-200ng/mlgm-csf、1-50ng/mlscf和1-50ng/mlil-4和1-10％自體血清或胎牛血清，每3ml加入到6孔板每孔中，於37℃、含5％co2培養箱內培養；48小時後進行1/3換液，於37℃、含5％co2培養箱內繼續培養2天，第5天即可獲得未成熟樹突狀細胞；

根據樹突狀細胞在6孔板中培養的孔數，每孔配製溶液1為250μl：240μlrpmi1640培養基+10μl脂質體3000轉染試劑(溫育5min)，以及溶液2為250μl：249μlrpmi1640+1μl4μg重組載體dna，將溶液1與溶液2混合，室溫下置20min；與此同時，第5天培養的未成熟樹突狀細胞通過1500rpm離心10分鐘收集，細胞用rpmi1640培養基衝洗細胞1遍後，用rpmi1640培養基重懸並稀釋到1×106細胞/ml，並加入到6孔板中，每孔2ml；將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻，在37℃，5％的co2中保溫5～6小時；6小時後，更換rpmi1640培養基(含5-200ng/mlgm-csf、1-50ng/mlscf和1-50ng/mlil-4和1-10％自體血清或胎牛血清)，在37℃，5％的co2中繼續培養48～72h檢測轉染水平。

培養到第7-8天的未成熟樹突狀細胞通過1500rpm離心10分鐘收集，用rpmi1640培養基(含5-200ng/mlflt3l，1-50ng/mltnfα和1-10％自體血清或胎牛血清)重懸並稀釋到3×106細胞/ml，並加入到6孔板中，每孔3ml；同時加入新鮮腫瘤組織來源的腫瘤細胞熱休克後裂解釋放的腫瘤抗原，每孔1-500ng/ml；在37℃，5％的co2中繼續培養24h，即獲得成熟樹突狀細胞，通過1500rpm離心10分鐘收集，用0.9％生理鹽水洗滌2次後0.9％生理鹽水重懸並稀釋到3-20×106細胞/ml，製備樹突狀細胞疫苗。

本發明所述方法中腫瘤細胞裂解抗原來源於手術後的新鮮腫瘤組織，腫瘤組織用1×pbs(ph值7.4，含1×雙抗)洗滌3次，使用眼科剪去除結締組織和血管後剪碎，加入5-10ml1×pbs(ph值7.4，含1×雙抗)，吸入15ml離心管中1000rpm離心10min，加入3-6ml0.25％(質量體積百分比)胰酶(含質量體積百分比0.02％edta和100活性單位iu的膠原酶i)，在37℃，5％co2培養箱中消化30min，每隔10min漩渦振蕩1次；消化後加入2-12mlrpmi1640培養基(含10％胎牛血清)中止消化，1200rpm離心10min後獲得腫瘤細胞沉澱，加入4.5mlrpmi1640培養基重懸。

將腫瘤細胞懸液加入蛋白酶抑制劑cocktail0.5ml，立即通過超聲破碎儀破碎超聲破碎3sec，停3sec，共3min，3次超聲破碎；破碎後12000rpm離心20min，吸去上清到新的15ml離心管中，通過核酸蛋白檢測儀測定蛋白濃度，用rpmi1640培養基將裂解腫瘤抗原稀釋到10ng/μl，分裝到200μlep管中，每管50μl，放置-80℃保存備用。

優選地，腫瘤抗原通過熱休克後裂解製備成，即將腫瘤細胞懸液放置在43℃水浴鍋或金屬浴中熱休克0.5-4小時後製備成腫瘤抗原。

本發明所述方法中100ml外周血來源的單核細胞誘導培養獲得dcs疫苗，培養到8天細胞數達3×107以上；通過流式抗體染色後在流式細胞儀上機檢測其高表達共刺激分子，即cd83陽性率大於85％，cd86陽性率大於90％，cd80陽性率大於90％，4-1bbl陽性率大於80％；與未抑制dcs中負調控sirpα表達的成熟dcs疫苗(如其未成熟dcs按照下述文獻所述方法製備：fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.，然後負載與本申請相同的腫瘤細胞裂解抗原)相比，本發明獲得的dcs疫苗經螢光定量dna聚合酶鏈式反應(real-timepolymerasechainreaction，qrt-pcr)技術檢測sirpα基因表達顯著下調40倍以上；經酶聯免疫吸附測定試劑盒(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)檢測分泌的白介素12/p70提高20倍以上。

所述方法中的樹突狀細胞疫苗，與未抑制dcs中負調控sirpα表達的成熟dcs疫苗(如其未成熟dcs按照下述文獻所述方法製備：fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.，然後負載與本申請相同的腫瘤細胞裂解抗原)相比，激活t淋巴細胞增殖倍數為10倍以上，elisa試劑盒檢測分泌的ifn-γ提高10倍以上；通過非放射性細胞毒性分析(cytotoxnon-radioactivecytotoxicityassay)試劑盒檢測在殺傷腫瘤細胞毒性實驗中效靶比40∶1時殺傷腫瘤細胞達到80％以上，顯著高於現有技術。

作為本發明中使用的pcdna4載體質粒可以在商業上購買，為哺乳動物表達載體，如pcdna4/myc-hisc載體、pcdna4/to載體、pcdna4/hismaxa、b、c和pcdna4/to/myc-hisa等。

作為本發明中使用的脂質體可以在商業上購買，如脂質體2000、脂質體3000和lipofectamine等，優選脂質體3000。

作為本發明dcs培養中使用的細胞培養板、細胞培養皿和培養瓶，可例舉，為6孔板、90mm細胞培養皿、75cm2細胞培養瓶和175cm2細胞培養瓶等細胞培養用器材(容器)，均可用於本發明，優選6孔細胞培養板。

本發明的製造方法中對dcs進行凍存，對凍存液無特殊限制，但優選如為50％小牛血清、40％細胞培養液和10％二甲基亞碸，其中細胞培養液更優選為dcs培養液。

在培養基中可以添加血清或血漿進行培養。它們在培養基中的添加量不受特殊限制，如大於0容量％至20容量％，且可以根據不同的培養階段而改變血清或血漿的用量，優選為5％(體積比)。例如，可以階段性減少血清或血漿濃度來使用。另外，作為血清或血漿的來源，可以是自己(意味著與所培養的細胞來源相同)或非自己(意味著與所培養的細胞的來源不同)中的任一種，從安全性的觀點出發，優選自己來源的血清或血漿。另外，也可以添加如人血清白蛋白之類經分離純化的血清成分。

本發明的自體dcs培養的製備使用上述各種成分及培養基來實施。本發明中使用的培養培養條件也沒有特殊限制，可以使用通常的細胞培養中使用的條件。例如，可在37℃、5％co2等條件下培養。還可以實施如下等操作：間隔適當的時間添加新鮮培養基來稀釋細胞培養液，或更換培養基，或更換細胞培養用器材等。

本發明還提供dcs疫苗在臨床應用中多次的抗腫瘤治療，更好地在生物體內發揮抗腫瘤免疫應答，達到很好的治療效果。此外，上述dcs疫苗還具有如下優點，多次dcs疫苗治療將更好地引發淋巴細胞殺瘤活性，抑制調節性t淋巴細胞免疫抑制活性，產生高效、長效地抗腫瘤免疫效應，因此非常利於患者療效的提高和生存期的延長。

以下，結合實施例對本發明做更具體的描述，但本發明不限於此。

實施例一重組mir145-5p/pcdna4基因構建的製備

將含成熟體微小rna145-5p基因序列24個鹼基，及其上下遊各200個鹼基與5』端kpni和3』端ecori的識別序列構成的基因序列通過化學合成獲得，即mir145-5p；

將mir145-5p的目的dna片段和pcdna4/to載體(購自美國thermofisher公司)kpni和ecori雙酶切後，在t4dna連接酶作用下，將兩者於4℃、12小時連接反應製備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞dh5a(購自美國invitrogen公司)後進行陽性克隆的pcr鑑定和測序鑑定，即mir145-5p/pcdna4，見圖1；pcr產物凝膠電泳檢測和測序鑑定符合mir145-p5大小和序列後，將測序正確的菌液轉接於10ml含氨苄的lb液體培養基中，37℃培養過夜，用無內毒素質粒小提中量試劑盒進行質粒抽提，抽提合格的重組質粒通過核酸蛋白定量儀(美國bio-rad公司)確定dna濃度，用去離子水稀釋到4ug/μl，然後將載體mir145-5p/pcdna4放置-80℃超低溫冰箱中長期保存。

實施例二抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞的製備

採集來源於膠質瘤患者(男，44歲，與其籤署知情同意書)自體外周血100ml，經淋巴細胞分離液分離純化得到單個核細胞後，用1×pbs(ph值為7.4)重懸並稀釋到10×106細胞/ml，通過小鼠抗人抗cd14免疫磁珠(購自德國美天旎公司)分選獲得cd14陽性單核細胞，1500rpm離心10分鐘收集cd14單核細胞，並用rpmi1640培養基(購自美國life公司)重懸並稀釋到2×106細胞/ml，並補充100ng/mlgm-csf(購自美國r&dsystems公司)、10ng/mlscf(購自美國r&dsystems公司)和20ng/mlil-4(購自美國r&dsystems公司)和5％自體血清或胎牛血清(購自美國life公司)，每3ml加入到6孔板每孔中，於37℃、含5％co2培養箱內培養；48小時後進行1/3換液，於37℃、含5％co2培養箱內繼續培養2天，第5天即可獲得未成熟樹突狀細胞；

根據樹突狀細胞在6孔板中培養的孔數，每孔配製溶液1為250μl：240μlrpmi1640培養基+10μl脂質體3000(購自美國invitrogen公司)轉染試劑(溫育5min)，以及溶液2為250μl：249μlrpmi1640+1μl4μgmir145-5p/pcdna4重組載體，將溶液1與溶液2混合，室溫下置20min；與此同時，第5天培養的未成熟樹突狀細胞通過1500rpm離心10分鐘收集，細胞用rpmi1640培養基衝洗細胞1遍後，用rpmi1640培養基重懸並稀釋到1×106細胞/ml，並加入到6孔板中，每孔2ml；將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻，在37℃，5％的co2中保溫5～6小時；6小時後，更換rpmi1640培養基(含100ng/mlgm-csf、10ng/mlscf和20ng/mlil-4和1-10％自體血清或胎牛血清)，在37℃，5％的co2中繼續培養48h檢測轉染水平。

培養到第7天的未成熟樹突狀細胞通過1500rpm離心10分鐘收集，用rpmi1640培養基(含20ng/mlflt3l，購自美國r&dsystems公司；10ng/mltnfα，購自美國r&dsystems公司和5％自體血清或胎牛血清)重懸並稀釋到3×106細胞/ml，並加入到6孔板中，每孔3ml；同時加入新鮮腫瘤組織來源的腫瘤細胞熱休克後裂解釋放的腫瘤抗原，每孔50ng/ml；在37℃，5％的co2中繼續培養24h，即獲得成熟樹突狀細胞，通過1500rpm離心10分鐘收集，用0.9％生理鹽水洗滌2次後0.9％生理鹽水重懸，計數樹突狀細胞為4.6×107，生理鹽水稀釋到5×106細胞/ml，製備樹突狀細胞疫苗。

取2×106dcs細胞使用流式抗體染色，即fitc標記的小鼠抗人cd83與pe標記的小鼠抗人cd86，fitc標記的小鼠抗人cd80與pe標記的小鼠抗人4-1bbl(均購自美國bd公司)，然後上機檢測，圖2中dc高表達共刺激分子，即圖2a中cd83陽性率為93.83％，圖2b中cd86陽性率為99.83％，圖2c中cd80陽性率為99.54％，圖2d中4-1bbl陽性率為98.97％。

實施例三dcs負載的腫瘤抗原製備

手術後的新鮮腫瘤組織(膠質瘤患者，臨床iv期，男，44歲，與其籤署知情同意書)，腫瘤組織用1×pbs(ph值7.4，含1×雙抗)洗滌3次，使用眼科剪去除結締組織和血管後剪碎，加入6ml1×pbs(ph值7.4，含1×雙抗)，吸入15ml離心管中1000rpm離心10min，加入3ml0.25％(質量體積百分比)胰酶(含質量體積百分比0.02％edta和100活性單位iu的膠原酶i，均購自美國sigma公司)，在37℃，5％co2培養箱中消化30min，每隔10min漩渦振蕩1次；消化後加入3mlrpmi1640培養基(含10％胎牛血清)中止消化，1200rpm離心10min後獲得腫瘤細胞沉澱，加入4.5mlrpmi1640培養基重懸。

將腫瘤細胞懸液放置在43℃水浴鍋或金屬浴中熱休克2小時後，腫瘤細胞懸液加入蛋白酶抑制劑cocktail0.5ml(購自美國bd公司)，立即通過超聲破碎儀破碎超聲破碎3sec，停3sec，共3min，3次超聲破碎；破碎後12000rpm離心20min，吸去上清到新的15ml離心管中，通過核酸蛋白檢測儀測定蛋白濃度，用rpmi1640培養基將裂解腫瘤抗原稀釋到10ng/μl，分裝到200μlep管中，每管50μl，放置-80℃保存備用。

實施例四抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞免疫功能檢測

依據fukudak等2017年3月3日在黑色素瘤研究雜誌中發表的多肽負載樹突狀細胞聯合卡鉑和紫杉醇治療iv期黑色素瘤(fukudak，funakoshit，sakurait，etal.peptide-pulseddendriticcellvaccineincombinationwithcarboplatinandpaclitaxelchemotherapyforstageivmelanoma.melanomares.2017mar3.doi：10.1097/cmr.)的方法誘導培養到未成熟dcs，同樣負載實施例三中製備的熱休克腫瘤細胞裂解抗原，在通過該報導中的方法誘導成熟dcs，獲得的dcs作為對比例。

實施例二中製備和對比例製備的dcs疫苗，通過螢光定量dna聚合酶鏈式反應(real-timepolymerasechainreaction，qrt-pcr)技術檢測mir-145-5p和sirpα基因表達水平，按照iiione-stepqrt-pcr試劑盒(美國invitrogen公司)進行操作，實驗結果圖3a中可以發現mir-145-5p表達顯著高於對比例製備的dcs，提高了81.06倍；同時圖3b中sirpα基因在本發明dcs表達明顯下降，與對比例製備的dcs相比下調43倍。圖中dcs為未mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞，mir145-5p/dcs為本發明mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞；對比例dcs為對比例中現有技術製備的樹突狀細胞。

取dcs培養第7天的培養上清，通過il-12/p70elisa試劑盒檢測培養上清中il-12/p70分泌水平，實驗結果如圖4所示，本發明製備的dcs培養上清中il-12/p70明顯高於對比例製備的，提高了20.24倍，分泌水平達11.74ng/ml。圖中dcs為未mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞培養的上清，mir145-5p/dcs為本發明mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞培養的上清；對比例dcs為對比例中現有技術製備的樹突狀細胞培養的上清。

取2×106實施例2中製備和對比例製備的dcs，分別與1×107人t淋巴細胞在10mlrpmi1640培養基(含5％胎牛血清)進行共培養，每間隔2天對t淋巴進行計數1次，並分析t淋巴細胞增殖倍數。實驗結果如圖5所示，可以看到從計數第3天開始，本發明製備的dcs激活的t淋巴細胞數均明顯高於對比例製備的，在培養到第15天t淋巴細胞增殖倍數為對比例的11.24倍，比激活前起始t淋巴細胞數增殖878.9倍。圖中dc-t為未mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞，mir155-5p/dcs-t為本發明mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞；對比例dcs-t為對比例中現有技術製備的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞。

取dcs與t淋巴細胞共培養第7天的培養上清，通過ifn-γelisa試劑盒檢測培養上清中ifn-γ分泌水平，實驗結果如圖6所示，本發明製備的dcs激活t淋巴細胞培養上清中ifn-γ明顯高於對比例製備的，為後者的13.64倍，分泌水平達14.87ng/ml。圖中dc-t為未mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞培養的上清，mir145-5p/dcs-t為本發明mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞培養的上清；對比例dcs-t為對比例中現有技術製備的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞培養的上清。

實施例五抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞體外殺瘤試驗

分別以膠質瘤細胞系u251為靶細胞，以實施例四中本發明製備的和對比例製備的dcs激活的t淋巴細胞作為效應細胞，按效靶比40∶1、20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1分別加入96孔培養板中，然後置於37℃、5％co2條件下培養4h，均設3個復孔。採用cytotoxnon-radioactivecytotoxicityassay試劑盒(購自美國promega公司)激活的t淋巴細胞對腫瘤細胞的毒性，按照試劑盒使用說明書操作，最後通過490nm波長處測吸光度(od)值。按下列公式分別計算對u251細胞的殺傷率：殺傷率＝(實驗組od值-效應細胞自然釋放組od值-靶細胞自然釋放組od值)/(靶細胞最大釋放組od值-靶細胞自然釋放組od值)×100％。

圖7為dcs激活的t淋巴細胞對u251細胞的殺傷活性，隨著效靶比提高，細胞毒性活性也不斷提高，其中mir145-5p/dc-t細胞殺傷u251細胞殺傷毒性顯著高於dc-t細胞和對比例dc-t細胞，p值分別為0.001和0.002。

實施例六抑制信號調控蛋白α表達的樹突狀細胞體內殺瘤實驗中的作用

24隻8周scid裸鼠腹部側翼皮下注射5×106膠質瘤細胞系u251，飼養7天後，隨機分為a、b、c和d4組，每組6隻：a組為實施例二製備的未mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞治療組(dc-t組)；b組為實施例二製備的mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞治療組(mir145-5p/dc-t組)；c組為實施例四製備的對比例dcs為對比例中現有技術製備的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞(對比例dc-t組)；d組為生理鹽水安慰劑組。a組在dc-t細胞培養到第14天和第16天尾靜脈注射2×104細胞/克，b組在mir145-5p/dcs-t細胞培養到第14天和第16天尾靜脈注射2×104細胞/克，c組在對比例dcs-t培養到第14天和第16天尾靜脈注射2×104細胞/克，d組與a、b和c治療組同時間，尾靜脈注射同體積的生理鹽水，各1ml。治療後分別於7d、14d、21d、28d和35d拉頸處死，取荷膠質瘤細胞系u251scid鼠模型腫瘤組織，計算鼠模型荷瘤大小。

圖8荷膠質瘤細胞系u251scid鼠模型dc激活t淋巴細胞治療完之後腫瘤大小變化曲線，生理鹽水組d和dc-t治療組a、mir145-5p/dc-t治療組b與對比例dc-t治療組c相比，治療組a、治療組b與治療組c中膠質瘤腫瘤大小縮少，但治療組b與治療組a與治療組c相比膠質瘤大小縮少更為明顯，p值分別為0.013和0.011，表明mir145-5p/pcdna4脂質體轉染的樹突狀細胞激活的t淋巴細胞引發了強大的體內殺瘤活性。