治療和/或預防Ⅰ型糖尿病的藥物組合物及其應用的製造方法與工藝

2023-09-27 07:39:45 2

本發明涉及一種用於治療和/或預防I型糖尿病的組合物及其應用。

背景技術：
世界衛生組織(WHO)的專家預測，糖尿病將是21世紀主要的健康危機，尤其在亞洲，它的威脅比禽流感和愛滋病更加嚴重。WHO估計全球的糖尿病患者到2010年將增加到兩億人，到2025年將超過3.3億人。而從目前的情況分析，在未來10年時間裡，全球所有病例中有60％都將出現在亞洲。據透露，西太平洋地區(包括中國)和東南亞地區(包括印度)是世界上糖尿病患者最多的地區。在世界糖尿病患者最多的五個國家裡，四個在亞洲。我國在向小康社會發展過程中，人們對脂肪與糖類的攝取量未能得到合理的控制，在老齡化及多方位應激因素影響下，糖尿病的發生率已逐年上升，與20世紀90年代中期相比，國內許多地區平均每年以千分之一的速度遞增，我國專家預測糖尿病發病率在近10餘年間將呈迅速上升趨勢，較WHO的預測更為嚴峻。據我國國內的調查顯示，全國20歲以上的糖尿病患者達2500萬人以上，糖耐量異常者不低於3500萬人，總計在6000萬人以上。其中，富裕地區的發病率顯著高於貧困地區，城市發病率普遍高於農村，肥胖者高於正常體重者，高齡者高於低齡者，而且發病年齡也日益趨於年輕化。40歲以下人群新發病例增多，40歲以上的平均患病率約佔糖尿病總數87％，患者高峰年齡在50歲～70歲。由於我國人口老齡化逐漸加劇，使糖尿病藥物市場潛力進一步加大。I型糖尿病是以CD4+T細胞，CD8+T細胞和巨噬細胞浸潤胰島而造成胰島中產生胰島素的細胞被破壞為特徵的一類自身免疫疾病。它約佔所有糖尿病患者的5-10％(ADA[AmericanDiabetesAssociation].1997.Reportoftheexpertcommitteeonthediagnosisandclassificationofdiabetesmellitus.DiabetesCare20：1183-1197；AtkinsonMA，LeiterEH.1999.TheNODmousemodeloftype1diabetes：Asgoodasitgets？Nature5：601-604)。主要發病機理是自身反應的T淋巴細胞破壞了胰腺中產生胰島素的細胞引起的，以CD4+T細胞，CD8+T細胞和巨噬細胞浸潤胰島而造成胰島中產生胰島素的細胞被破壞為特徵(AtkinsonMA，MaclarenNK.1994.Thepathogenesisofinsulin-dependentdiabetesmellitus.NEnglJMed331：1428-1436；BenoistC，MathisD.1997.Autoimmunediabetes：Retrovirusastrigger，precipitatorormarker？Nature388：833-834；BjorkS.2001.Thecostofdiabetesanddiabetescare.DiabetesResClinPract54(Suppl1)：13-18)。人們已經發現I型糖尿病胰島炎現象，即淋巴細胞浸潤胰島，以後相繼在I型糖尿病患者中發現了抗胰島細胞自身抗體(ICA)，對胰島素、羧肽酶、熱休克蛋白產生自主反應的T細胞。實驗證明胰島素B鏈肽9-23可以結合到II類組織相容性複合體(MHC)等位基因叫I-Ag7。1型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病，是一種T細胞介導性疾病，導致高血糖的胰腺β細胞的自身免疫性破壞的結果。這胰島B肽可能是一種自身抗原可能引發的疾病的候選(Devendra，D.etal.Diabetes54，2549，2005；Starwalt，S.etal.ProteinEng.16，147(2003)；Lee，L.etal.PNAS102，15995，2005)。進一步實驗還證明胰島素B鏈15至23胺基酸片段可以被T細胞識別。它在糖尿病病人體內可以被檢測到表達幹擾素-β和IL-17的CD4+或CD8+T細胞的生產。這種肽可以與B鏈胰島素CTL克隆反應，但不會與脾CD8T細胞反應(Hu，C.etal.J.Clin.Invest.117，3857，2007；Amrani，A.etal.Nature406，739，2000)。實驗證明胰島素C鏈肽也是一個一起自身免疫反應的抗原(Arif，T.I.Tree，T.P.Astilletal.AutoreactiveTcellresponsesshowproinflammatorypolarizationindiabetesbutaregulatoryphenotypeinhealth.TheJournalofClinicalInvestigation，vol.113，no.3，pp.451-463，2004)。至1990年Beakkeskov證明I型糖尿病患者血清中存在的64K抗體就是穀氨酸脫羧酶(GAD)自身抗體和自主反應的T細胞，認為GAD是I型糖尿病自身免疫反應的關鍵抗原(Immunemodulationforpreventionoftype1diabetesmellitus.ItamarRaz1，RoyEldor2andYaakovNaparstek.TRENDSinBiotechnology23：128，2005；Enee，E.etal.JImmunol180，5430，2008；龍秀榮，杜文斌，蘇鍾浦，魏慶琤.兒童糖尿病的穀氨酸脫羧酶抗體檢測.中華兒科雜誌.1998年第10期)。另外，有大量的報導發現胰島澱粉樣多肽(isletamyloidpolypeptide，IAPP)所形成的澱粉樣蛋白沉積，具有破壞胰島beta細胞膜結構、誘導beta細胞凋亡和損傷beta細胞功能、及激活免疫細胞攻擊beta細胞的作用，被認為是糖尿病的重要致病原因之一。最新研究也表明抑制IAPP的聚集可有效減少beta細胞的凋亡，提高胰島移植的成功率。同時，因此，IAPP已成為糖尿病治療中一個具有良好前景的靶點。在目前，T1D的治療主要以外源性胰島素替代治療為主，患者需每日注射胰島素。此方法不僅每天給患者帶來極大不方便，而且易發生注射感染或過敏反應；且此治療方案只能緩解高血糖等臨床症狀，但常有血糖波動和低血糖發生，也無法改變自體病理性T細胞攻擊胰腺的狀況，更加無法恢復受損胰腺功能，也就不能控制遠期併發症。即使目前最為有效的胰島素強化治療方案，也僅能減少併發症發生率的35％～90％，同時患者難免遭受著注射所帶來的不便和痛苦。因此，尋求調節和抑制自主免疫反應，改善甚至恢復胰腺正常功能，成為從根本上治療T1D，解除患者痛苦，提高患者尤其是青少年患者生活質量的必經之路。由於I型糖尿病是T細胞引起的自身免疫性疾病，所以在臨床上也使用的免疫抑制劑來抑制此類疾病，如：地塞米松(DMS)，普樂可復(FK506)，環孢素A(CsA)，驍悉(MMF)，硫唑嘌呤(Aza)，強的松(Pred)，早基強的松龍(MP)；或利用抗體如：抗淋巴細胞球蛋白(ALG)，抗CD4單克隆抗體(OKT4)，每年治療費用在幾十億元。由於這些藥物是非特異性免疫抑制，所以療效不想理，而且大劑量使用免疫抑制劑都有其毒副作用，若使用不當，一方面可因過度抑制機體免疫反應性而引發多種併發症，更有導致抑制器官功能衰竭風險。所以，急需一種毒性低，具有特異性療效的藥物。

技術實現要素：
本發明的目的是提供一種組合物。本發明所提供的組合物的活性成分為如下1)或2)或3)：1)I型糖尿病的蛋白抗原和免疫抑制劑的混合物；2)所述I型糖尿病的蛋白抗原的表位多肽和所述免疫抑制劑的混合物；3)所述I型糖尿病的蛋白抗原、所述I型糖尿病的蛋白抗原的表位多肽和所述免疫抑制劑的混合物；上述組合物中的活性成分，即I型糖尿病的蛋白抗原、I型糖尿病的蛋白抗原的表位多肽和免疫抑制劑可以獨立包裝，也可以混合在一起後整體包裝。所述I型糖尿病的蛋白抗原為胰島素、穀氨酸脫羧酶和胰島澱粉樣多肽中的至少一種。所述免疫抑制劑為地塞米松，環孢素A，他克莫司(普樂可復)，驍悉，硫唑嘌呤，強的松，早基強的松龍，抗CD4單克隆抗體和抗CD3單克隆抗體中的至少一種。。所述表位多肽為單一抗原表位的多肽或多個抗原表位組合而成的多肽。其中，所述胰島素可來源於人、狗、貓，也可以來自於重組基因表達的產物。人的胰島素可以用於狗和貓的I型糖尿病治療。人、狗、貓和鼠的基因序列非常相似。在核酸序列水平上，鼠與人胰島素相似性為95％，貓與人的相似性為84％，狗與人的相似性為89％。所述穀氨酸脫羧酶可來源於人、狗、貓，也可以來自於重組基因表達的產物。人的穀氨酸脫羧酶也用於小鼠I型糖尿病治療。在核酸序列水平上，兩者的序列相似度為90％。所述胰島澱粉樣多肽可來源於人、狗、貓，也可以來自於重組基因表達的產物。所述表位多肽可來源於人、狗、貓序列，並可以進行化學合成得到。所述I型糖尿病的蛋白抗原具體可為人胰島素(Insulin)。所述人胰島素的所述表位多肽的胺基酸序列如序列表中序列1(該多肽的名稱為B9-23)，或序列2(該多肽的名稱為B15-23)，或序列3(該多肽的名稱為C肽)，或序列12(該多肽的名稱為B23-39)，或序列13(該多肽的名稱為B10-C5)所示。所述I型糖尿病的蛋白抗原具體可為狗胰島素。所述狗胰島素的所述表位多肽的胺基酸序列如序列表中序列4(該多肽的名稱為B9-23)，或序列5(該多肽的名稱為B15-23)，或序列12(該多肽的名稱為B23-39)，或序列13(該多肽的名稱為B10-C5)所示。所述I型糖尿病的蛋白抗原具體可為貓胰島素。所述貓胰島素的所述表位多肽的胺基酸序列如序列表中序列6(該多肽的名稱為B9-23)，或序列7(該多肽的名稱為B15-23)，或序列12(該多肽的名稱為B23-39)，或序列13(該多肽的名稱為B10-C5)所示。所述I型糖尿病的蛋白抗原具體可為人穀氨酸脫羧酶-65(GAD65)。所述人穀氨酸脫羧酶-65的所述表位多肽的胺基酸序列如序列表中序列8(該多肽的名稱為G114-123)所示。所述I型糖尿病的蛋白抗原具體可為人胰島澱粉樣多肽isletamyloidpolypeptide(IAPP)。所述人胰島澱粉樣多肽的所述表位多肽的胺基酸序列如序列表中的序列9(該多肽的名稱為1-36)所示。所述I型糖尿病的蛋白抗原具體可為狗胰島澱粉樣多肽。所述狗胰島澱粉樣多肽的所述表位多肽的胺基酸序列如序列表中的序列10(該多肽的名稱為1-36)所示。所述I型糖尿病的蛋白抗原具體可為貓胰島澱粉樣多肽。所述貓胰島澱粉樣多肽的所述表位多肽的胺基酸序列如序列表中的序列11(該多肽的名稱為1-36)所示。其中，序列1由15個胺基酸組成；序列2由9個胺基酸組成；序列3由31個胺基酸組成；序列4由15個胺基酸組成；序列5由9個胺基酸組成；序列6由15個胺基酸組成；序列7由9個胺基酸組成；序列8由10個胺基酸組成；序列9由37個胺基酸組成；序列10由37個胺基酸組成；序列11由37個胺基酸組成；序列12由17個胺基酸組成；序列13由27個胺基酸組成。上述1)中所述I型糖尿病的蛋白抗原與所述免疫抑制劑的使用配比(質量比)為1∶20到20∶1，如1∶1到10∶1。在本發明中，所述I型糖尿病的蛋白抗原與所述免疫抑制劑的使用配比(質量比)具體為1∶1(10μg蛋白抗原+10μg免疫抑制劑)，或10∶1(10μg蛋白抗原+1μg免疫抑制劑)。上述2)中所述表位多肽與所述免疫抑制劑的使用配比為1g∶1g。本發明所提供的組合物具有如下功能：(1)治療和/或預防脊椎動物I型糖尿病；(2)提高哺乳動物動物CD4+CD25+調節性T細胞增殖水平；(3)提高哺乳動物CD4+CD25+調節性T細胞與CD4+T細胞的比例；(4)提高哺乳動物T細胞對IL-10的分泌水平；(5)抑制哺乳動物自身免疫反應性CD8T細胞的殺傷作用；在本發明的實施例中，所述抑制自主免疫CD8T細胞的殺傷作用具體為對胰島細胞和/或脾臟細胞的殺傷作用。(6)控制I型糖尿病患者(哺乳動物)血糖水平；(7)提高哺乳動物外周血單核細胞和/或脾臟細胞中IL-10和/或TGF-β的轉錄水平；(8)抑制哺乳動物DC細胞成熟；所述抑制DC細胞成熟體現為降低DC分泌CD40、CD80、CD83和CD86中的至少一種。所述脊椎動物為哺乳動物，具體可為小鼠、家兔、狗或人。本發明所提供的組合物在製備治療和/或預防I型糖尿病的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明所提供的組合物在製備具有如下a)-h)中至少一種功能的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍：a)提高哺乳動物CD4+CD25+調節性T細胞佔CD4+T細胞的比例；b)提高哺乳動物CD4+CD25+調節性T細胞增殖水平；c)提高哺乳動物T細胞對IL-10的分泌水平；d)控制患I型糖尿病的哺乳動物血糖水平；e)抑制自身免疫反應性CD8T細胞所起的殺傷作用；f)提高外周血單核細胞和/或脾臟細胞中IL-10和/或TGF-β的轉錄水平；g)抑制哺乳動物DC細胞成熟；h)降低哺乳動物DC細胞分泌CD40、CD80、CD83和CD86中的至少一種.所述脊椎動物為哺乳動物，具體可為小鼠、家兔、狗或人。本發明所提供的藥物組合物在治療和/或預防I型糖尿病中應用也屬於本發明的保護範圍。本發明所提供的藥物組合物經過注射機體，體內可以產生CD4+CD25+調節性T細胞，從而抑制I型糖尿病發生。本發明所提供的藥物組合物，在使用過程中：1)作為I型糖尿病的蛋白抗原的胰島素濃度為0.01～1IU/Kg體重，如0.15～0.25IU/Kg體重，免疫抑制劑地塞米松的濃度為0.01～600μg/Kg體重，如1～5μg/Kg體重；2)作為I型糖尿病的蛋白抗原的表位多肽B23-39濃度為0.05～1μg/Kg體重，如0.1～0.5μg/Kg體重，免疫抑制劑地塞米松的濃度為0.01～1μg/Kg體重，如0.05～0.2μg/Kg體重；3)作為I型糖尿病的蛋白抗原的表位多肽B10-C5濃度為0.05～1μg/Kg體重，如0.1～0.5μg/Kg體重，免疫抑制劑地塞米松的濃度為0.01～1μg/Kg體重，如0.05～0.2μg/Kg體重；4)作為I型糖尿病的蛋白抗原的穀氨酸脫羧酶濃度為0.05～1μg/Kg體重，如0.1～0.5μg/Kg體重，免疫抑制劑地塞米松的濃度為0.01～1μg/Kg體重，如0.05～0.2μg/Kg體重；5)作為I型糖尿病的蛋白抗原的表位多肽G114-123濃度為0.05～1μg/Kg體重，如0.1～0.5μg/Kg體重，免疫抑制劑地塞米松的濃度為0.01～1μg/Kg體重，如0.05～0.2μg/Kg體重。本發明所提供的治療和/或預防I型糖尿病的藥物組合物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法導入機體，如肌肉、皮內、皮下、靜脈、黏膜組織；或是被其他物質混合或包裹後導入機體。所述藥物組合物每3-30天給藥一次，一般共需4-8次。實驗證明，本發明所提供的治療和/或預防I型糖尿病的藥物組合物能夠提高免疫動物CD4+CD25+調節性T細胞佔CD4+T細胞的比例；促進CD4+CD25+調節性T細胞增殖；促進T細胞分泌IL-10；控制I型糖尿病患者的血糖水平；抑制自身免疫反應性CD8T細胞所起的殺傷作用；提高外周血單核細胞和/或脾臟細胞中IL-10和/或TGF-β的轉錄水平；抑制DC細胞的成熟；從而誘導免疫抑制的產生，進而達到有效地治療I型糖尿病的目的。附圖說明圖1為確定Treg量效關係的結果，即人胰島素(諾和靈R)與地塞米松不同劑量免疫NOD小鼠後，檢測脾臟CD4+CD25+調節性T細胞的比例。其中，A為流式細胞檢測結果；B為對A流式細胞檢測結果的統計比較結果。A和B中，1均代表第1組(10+10組)，即注射10微克人胰島素(諾和靈R)混合10微克地塞米松；2均代表第2組(100+100組)，即注射100微克人胰島素(諾和靈R)混合100微克地塞米松；3均代表第3組(500+100組)，即注射500微克人胰島素(諾和靈R)混合100微克地塞米松；4均代表未經免疫的NOD小鼠對照組。圖2為確定Treg增殖量效關係的結果，即人胰島素(諾和靈R)與地塞米松不同劑量免疫NOD小鼠後，純化脾臟CD4+CD25+調節性T細胞，標記CFSE，體外用抗原人胰島素(諾和靈R)或人胰島素表位多肽B9-23重新刺激後，檢測Treg的增殖情況。其中，A為流式細胞檢測結果；B為對A流式細胞檢測結果的統計比較結果。A和B中，1均代表陽性對照Anti-CD3；2均代表無關抗原對照OVA323-339；3均代表未刺激陰性對照；(1、2、3均為未經免疫的NOD小鼠)；4均代表10微克人胰島素(諾和靈R)混合10微克地塞米松刺激組；5均代表100微克人胰島素(諾和靈R)混合100微克地塞米松刺激組；6均代表500微克人胰島素(諾和靈R)混合100微克地塞米松刺激組；7均代表10微克人胰島素表位多肽B9-23混合10微克地塞米松刺激組；8均代表100微克人胰島素表位多肽B9-23混合100微克地塞米松刺激組；9均代表500微克人胰島素表位多肽B9-23混合100微克地塞米松刺激組。圖3為確定IL-10量效關係的結果，即胰島素抗原與地塞米松不同劑量免疫NOD小鼠後，純化脾臟CD4+CD25+調節性T細胞，體外用抗原人胰島素(諾和靈R)或人胰島素表位多肽B9-23重新刺激後，檢測上清中IL-10表達(皮克每毫升)。1代表陽性對照Anti-CD3；2代表無關抗原對照OVA323-339；3代表未刺激陰性對照；(1、2、3均為未經免疫的NOD小鼠)；4代表10微克人胰島素(諾和靈R)混合10微克地塞米松刺激組；5代表100微克人胰島素(諾和靈R)混合100微克地塞米松刺激組；6代表500微克人胰島素(諾和靈R)混合100微克地塞米松刺激組；7代表10微克人胰島素表位多肽B9-23混合10微克地塞米松刺激組；8代表100微克人胰島素表位多肽B9-23混合100微克地塞米松刺激組；9代表500微克人胰島素表位多肽B9-23混合100微克地塞米松刺激組。圖4為即發I型糖尿病治療效果的血糖檢測結果，即STZ誘導NOD小鼠I型糖尿病發病後，分別用高劑量組(人胰島素(諾和靈R)100μg+地塞米松100μg)和低劑量組(人胰島素(諾和靈R)10μg+地塞米松10μg)治療，觀察血糖變化(毫摩)。其中，空心圓實線代表發...