奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位的疫苗及其製備方法和應用與流程
2023-09-27 07:40:30
本發明涉及一種奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的亞單位疫苗及其製備方法和應用。屬於獸用疫苗技術領域。
背景技術：
奶牛乳房炎(mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病之一，主要是奶牛乳腺組織受到微生物感染後而引起的一種炎症，多發生於產後哺乳期，該病廣泛存在於世界各地，為奶牛常見病、多發病，是造成乳製品業經濟損失最為嚴重的疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原微生物大約有150多種，主要以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌為主，這三種細菌引起的奶牛乳房炎佔總發病率的90％以上，其中尤以金黃色葡萄球菌為最。
當前奶牛乳房炎的治療主要是抗生素治療。抗生素用於治療奶牛乳房炎已有50多年的歷史，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由於長期單一的、大劑量、不科學使用抗生素，造成了敏感性細菌消除，耐藥性細菌逐漸佔了主流，尤其是金黃色葡萄球菌的耐藥問題日益嚴重，導致了抗生素治療收效甚微；另一方面，隨著生活水平的提高，牛奶中抗生素殘留是一個非常嚴重的健康問題。
用疫苗防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以預防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助於降低乳腺感染的嚴重程度，控制亞臨床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不會存在乳汁中抗生素殘留問題；最後是操作簡便，費用低廉。當前，研製成功的疫苗很少，且大都數為弱毒活菌苗或滅活菌苗，在生產實踐中，對乳房炎的防治有一定作用，然而隨著大規模集約化養殖的發展，人工致弱菌株存在著同源重組、自身毒力返強等潛在可能，而滅活疫苗也存在使用劑量大、滅活不徹底等不足，為提高傳統疫苗的安全性與免疫保護力，高效、廉價的新型疫苗研製極為重要。
金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus,簡稱sa)，也稱「金葡菌」，是一種革蘭氏染色陽性的球菌，直徑0.8μm，在顯微鏡下排列成葡萄串狀，並可以產生金黃色的色素，因此而得名。金葡菌是引起慢性/隱性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以極大的影響牛奶的產量和質量，給奶製品產業帶來巨大的經濟損失。
panton-valentine殺白細胞素(panton-valentineleukocidin，pvl)是由金黃色葡萄球菌產生的細胞外毒素之一，也是其主要的致病因子之一。pvl由vandeleld於1894年首先發現，並在1932年由pantonandvalentine將其從溶血素中分離出來。pvl由兩種蛋白質組成，即pvl-s蛋白和pvl-f蛋白(luks-pvt，lukf-pv)，其分子量分別為34kda和33kda，且f蛋白和s蛋白之間的胺基酸序列同源性有36％。pvl屬於膜鑽孔毒素家族，能誘導pmns壞死或調亡，首先是luks-pv與pmns細胞膜上的特異性高親和力的受體結合，其次lukf-pv與之結合形成二聚體，再依次luks-pv和lukf-pv結臺，最後形成一個環狀結構的雜聚體。此雜聚體內徑為3nm，外徑為9nm，分子量大約200kda，其中所含的luks-pv和lukf-pv的分子比為1:1，此環狀結構的雜聚體插入在pmns細胞膜上，形成一個直徑大約2nm的膜穿孔，其他的pvl分子通過該孔進入細胞，並在線粒體外膜上建立孔道，從而破壞線粒體的內環境，並激活caspase9、caspase3和釋放殺白細胞素c，誘導細胞調亡。因此，pvl是金葡菌亞單位疫苗的重要候選蛋白之一，但是當pvl-s和pvl-f都存在時，可能會造成細胞毒性，本實驗室對其做了小鼠安全性實驗，結果與預期相同，在免疫同時含有pvl-s蛋白和pvl-f蛋白的疫苗時，小鼠在免疫後3-4天就死亡，但是僅免疫相同劑量的pvl-s蛋白或pvl-f蛋白，在免疫後跟蹤的14天內，小鼠都正常，未出現任何異常，所以，在亞單位疫苗的選擇時，僅能選擇其中一種蛋白作為亞單位疫苗的候選蛋白。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題：一是提供一種新型的奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗及其製備方法；二是克服活疫苗存在的同源重組、自身毒力返強等潛在可能；三是克服滅活疫苗使用劑量大和可能存在的滅活不徹底導致的同源重組等問題。
本發明提供了一種新型的奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗，該疫苗包括pvl-s蛋白(即金黃色葡萄球菌pvl-s蛋白)與藥學上可接受的佐劑、或pvl-f蛋白(即金黃色葡萄球菌pvl-f蛋白)與藥學上可接受的佐劑。
本發明的技術方案中，優選地，所述pvl-s蛋白的編碼基因如seqidno.1所示。
本發明的技術方案中，優選地，所述pvl-s蛋白為蛋白質(a1)或蛋白質(b1)：蛋白質(a1)由seqidno.3所示的胺基酸組成的蛋白質；蛋白質(b1)在蛋白質(a1)中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個胺基酸或幾個胺基酸且具有pvl-s蛋白抗原性的由蛋白質(a1)衍生的蛋白質。
本發明的技術方案中，優選地，pvl-f蛋白編碼基因如seqidno.2所示。
本發明的技術方案中，優選地，所述pvl-f蛋白為蛋白質(a2)或蛋白質(b2)：蛋白質(a2)由seqidno.4所示的胺基酸組成的蛋白質；蛋白質(b2)在蛋白質(a2)中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個胺基酸或幾個胺基酸且具有pvl-f蛋白抗原性的由蛋白質(a2)衍生的蛋白質。
本發明的技術方案中，優選地，所述的疫苗中每頭份含pvl-s蛋白為100μg、或疫苗中每頭份含pvl-f蛋白為100μg。
本發明的技術方案中，優選地，所述藥學上可接受的佐劑為isa201vg佐劑。
本發明的技術方案中，優選地，所述疫苗中還含有防腐劑，所述防腐劑為硫柳汞，所述硫柳汞的濃度為2μg/ml。
本發明還提供了一種製備奶牛金黃色葡萄球菌亞單位疫苗的方法，所述製備方法包括以下步驟：(1)金黃色葡萄球菌pvl-s蛋白或pvl-f蛋白的克隆；(2)重組pvl-s蛋白或pvl-f蛋白的表達與純化；(3)將重組pvl-s蛋白或pvl-f蛋白與isa201vg混合乳化得到重組亞單位疫苗，其中，重組pvl-s蛋白或pvl-f蛋白與佐劑isa201vg體積比為46:55。
本發明再提供了一種重組pvl-s蛋白、pvl-f蛋白在製備奶牛金黃色葡萄球菌重組亞單位疫苗及相關診斷試劑中的應用。本發明又提供了一種亞單位疫苗在製備用於預防或治療奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎的藥物中的應用。
與現有技術相比，本發明提供了一種新型的奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗及其製備方法和應用。該亞單位疫苗不含有核酸，不會導致同源重組和自身毒力返強等潛在危險；能誘發機體產生特異性抗體，可促進細胞免疫，誘導免疫記憶和引起廣泛的免疫應答，產生很好的交叉保護反應，因此該疫苗更加安全穩定、製備簡單、應用方便、價格低廉，且省時省力。
與現有技術相比，本發明的小鼠免疫攻毒實驗結果顯示，無論是pvl-s蛋白還是pvl-f蛋白製備的亞單位疫苗在免疫效果方面相當，且不存在安全性問題，相對於其他的毒素(如α-溶血素和β-溶血素)在製備亞單位疫苗時，不需要預先對蛋白進行滅活處理或對編碼基因進行突變處理就能直接製備亞單位疫苗，省時、省力、節約成本。
附圖說明
圖1表示瓊脂糖凝膠電泳pcr擴增pvl-f，pvl-s結果。pvl-f基因pcr結果，大小約為906bp；pvl-s基因基因pcr結果，大小約為849bp；m：dna分子量標準dl2,000。
圖2表示pet28a-pvl-f，pvl-s酶切驗證結果。pet28a-pvl-f：質粒pet28a-pvl-fxhoi和ndei酶切鑑定結果，酶切片段大小為5,369bp和904bp；pet28a-pvl-s：質粒pet28a-pvl-fxhoi和ndei酶切鑑定結果，酶切片段大小為5,369bp和849bp；m：dna分子量標準dl5,000。
圖3表示pvl-f蛋白和pvl-s蛋白純化結果。
圖4表示免疫後抗體效價檢測結果。
圖5表示免疫後攻毒實驗結果。
具體實施方式
以下將結合附圖和實施例對本發明做進一步說明，本發明的實施例僅用於說明本發明的技術方案，並非限定本發明。
本發明試劑及藥品的來源列單如下：
化學試劑和生物試劑全部為市售產品；
防腐劑硫柳汞購自lifesciences；
isa201vg購自法國賽比克公司。
實施例1：表達載體pet28a-pvl-s和pet28a-pvl-f-的構建(兩種載體構建方法相同)
以臨床分離到的奶牛金黃色葡萄球菌基因組為模板，進行pcr，引物如下表所示，結果如圖1所示：pvl-f基因pcr結果，大小約為906bp；pvl-s基因基因pcr結果，大小約為849bp；都與預期大小一致。
1.1加樣體系為(50μl):
1.2pcr擴增程序:
1.3膠回收dna片段:
(1)將步驟1.2的反應液進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳(110v30min)；
(2)在紫外燈下，切膠回收dna片段於1.5mlep管中；
(3)向步驟(2)中的1.5mlep管中加入500μlpcbuffer，50℃，水浴10min；
(4)將步驟(3)中溶液移至吸附柱中心，靜置2min，離心，12,000rpm，30s；
(5)棄廢液，向吸附柱中心加入600μlpwbuffer，靜置3min，12,000rpm，30s；
(6)重複步驟(5)；
(7)空吸附柱離心，12,000rpm，1min；
(8)向吸附柱中心加入30μlddh2o，靜置3min，離心(12,000rpm，2min)；
(9)收集步驟(8)dna樣品進行電泳。
1.4雙酶切反應(50μl體系)：
在1.5mlep管中按照上述體系進行加樣、混勻，而後將這兩個50μl反應液置於37℃恆溫水浴鍋中，水浴3h。
1.5膠回收dna片段：
(1)將步驟1.4的反應液進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳(110v30min)；
(2)在紫外燈下，切膠回收dna片段於1.5mlep管中；
(3)向步驟(2)中的1.5mlep管中加入500μlpcbuffer，50℃，水浴10min；
(4)將步驟(3)中溶液移至吸附柱中心，靜置2min，離心，12,000rpm，30s；
(5)棄廢液，向吸附柱中心加入600μlpwbuffer，靜置3min，12,000rpm，30s；
(6)重複步驟(5)；
(7)空吸附柱離心，12,000rpm，1min；
(8)向吸附柱中心加入30μlddh2o，靜置3min，離心(12,000rpm，2min)；
(9)收集步驟(8)dna樣品進行電泳。
1.6連接反應(10μl體系)：
在1.5mlep管中按照上述體系進行加樣、混勻，而後將上述反應液置於16℃，水浴16h後取出，65℃，水浴15min後進行滅活，將樣品4℃保存。
1.7轉化實驗：
(1)取出步驟1.6的連接反應液，向其中添加100μle.colidh5α感受態細胞，混勻；
(2)冰浴30min；
(3)42℃，水浴100s；
(4)冰浴2min；
(5)取出，向ep管中加入600μl液體lb培養基，37℃，水浴1h；
(6)取出樣品管，離心(8,000rpm，2min)，去掉600μl，剩餘100μllb重懸菌體；
(7)取菌液鋪板於lk平板中(kan濃度為50μg/ml)，將lk平板置於生化恆溫培養箱中，37℃培養12h。
1.8重組質粒提取及酶切鑑定：
(1)從轉化平板中挑取單克隆至3mllk液體培養基中，37℃，260rpm搖菌過夜；
(2)取1ml菌液至1.5mlep管中，離心(12,000rpm，2min)，棄上清；
(3)向步驟(2)中的ep管中加入250μlp1buffer，重懸菌體；
(4)向步驟(3)溶液中加入250μlp2buffer，溫和混勻，靜置2min；
(5)向步驟(4)溶液中加入350μlp3buffer，溫和混勻；
(6)將步驟(5)溶液，離心(12,000rpm，10min)；
(7)將步驟(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，離心(8,000g，30s)；
(8)棄廢液，向吸附柱中心加入500μlwashbuffer，離心(9,000g，30s)；
(9)重複步驟(8)；
(10)空吸附柱離心(9,000g，1min)；
(11)向吸附柱加入30μlelutionbuffer，靜置2min，離心(12,000rpm，2min)；
(12)收集步驟(11)dna樣品進行電泳；
(13)如步驟1.4所示，對提取到的質粒進行酶切鑑定，而後進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。
(14)重組質粒酶切鑑定結果如圖2所示：：pet28a-pvl-f：質粒pet28a-pvl-fxhoi和ndei酶切鑑定結果，酶切片段大小為5,369bp和904bp；pet28a-pvl-s：質粒pet28a-pvl-fxhoi和ndei酶切鑑定結果，酶切片段大小為5,369bp和849bp。
實施例2：轉化大腸桿菌bl21
吸取1μl質粒加入100μlbl21感受態細胞中，冰浴30min；
42℃熱激90s；
冰浴2min；
在超淨臺內加入900μl無抗性的lb培養液；
37℃180rpm搖1h；
吸取100μl菌液塗卡那抗性lb平板，37℃過夜培養。
實施例3：大量誘導表達
挑菌：挑取單克隆至50ml卡那抗性lb培養液中，37℃過夜培養；
轉接：按1:100比例轉接菌液至500ml卡那抗性lb培養液，共搖3.5l，37℃220rpm培養2-2.5h至od600值到0.6；
誘導：菌液od600值到0.6後，加入500μliptg(1m)至iptg終濃度為1mmol/l,37℃220rpm誘導培養4h；
菌體收集：菌液6,000rpm離心10min，收集菌體；用40mlpbs清洗菌體，6,000rpm離心10min，收集菌體，置於-20℃保存；
實施例4：pvl-s蛋白或pvl-f蛋白純化(兩種蛋白純化過程相同)
(1)菌體破碎：向實施例3中的得到的菌體中加入裂解液(8ml/g溼重)(50mmnah2po4(ph8.0)，500mmnacl，20mm咪唑；使用0.8μm的濾膜過濾)，用50ml注射器吹打均勻至無顆粒狀菌塊；將菌體樣品倒入到細胞均質儀樣品槽中，出樣口用燒杯準備收集樣品；以樣品的90％流出出樣口為一個循環，一個循環完成後，將出樣口燒杯收集的樣品倒回樣品槽，繼續重複5個循環。
(2)將步驟(1)中破碎完全的樣品分裝到250mlbeckman離心管中，12,000rpm，4℃離心30min，上清樣品過0.8μm膜後作為上樣樣品，預留80μl樣品用於sds-page檢測；
(3)柱平衡：用超純水平衡2～3柱體積(cv)，排出20％的乙醇保存液；然後用裂解液平衡2～3柱體積(cv)，5ml/min。控制壓力小於0.5mpa。
(4)上樣：2ml/min進行上樣，收集流穿液(flowthrough)，取80μl用於sds-page檢測。
(5)衝洗1：用清洗緩衝液組分1(washingbuffer1：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，20mm咪唑，0.1％tritonx-114，使用0.8μm的濾膜過濾)洗柱，5ml/min，衝洗80個柱體積。
(6)衝洗2：用10倍柱體積(cv)的洗脫緩衝液組分1(elutionbuffer1：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，使用0.8μm的濾膜過濾)洗柱，減少tritonx-114的殘留。
(7)洗脫：50％洗脫緩衝液組分2(50％elutionbuffer2：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，250mm咪唑，使用0.8μm的濾膜過濾)洗脫目的蛋白，至基線洗平，速度5ml/min,收集，混合後取80μl用於sds-page分析；100％脫緩衝液2組分清洗柱子(100％elutionbuffer2：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，500mm咪唑，使用0.8μm的濾膜過濾)，至基線洗平，5ml/min,收集，混合後取80μl用於sds-page分析。
(8)hiprepdesalting脫鹽柱柱平衡：用超純水平衡2～3柱體積(cv)，排出20％的乙醇保存液；然後用洗脫緩衝液組分1平衡3-4柱體積(cv)，速度10ml/min。
(9)上樣：速度10ml/min進行注入(inject)，最大注入(inject)量為13ml。
(10)收集：停止上樣後，進入load模式，10ml/min，uv上升至1mau開始收集，即蛋白樣品開始出峰，10ml/管收集，待uv降至5mau以下，停止收集。
(11)平衡：流速10ml/min，平衡2-3cv。
(12)循環7.10～7.12，直至上樣完成。
(13)除菌過濾：收集的蛋白溶液在4℃，12,000rpm離心15min，收集上清，移至生物安全櫃，過0.2μm蛋白結合率低的針頭濾器，過濾後置於-80℃冰箱保存。
(14)純化結果如圖3所示：純化後的pvl-s蛋白和pvl-f蛋白的純度均能達到90％以上；經過計算，在沒有優化發酵培養的情況下，pvl-s蛋白和pvl-f蛋白的表達量均能達到500mg/l以上。
實施例5：疫苗製備(1ml/頭份)
(1)按照實驗需要，計算疫苗溶液各成分的量，使疫苗中重組pvl-s蛋白或pvl-f蛋白終濃度均為100μg/ml，使疫苗中硫柳汞的終濃度為2μg/ml，再將稱量好的重組蛋白與稱量好的硫柳汞混合作為水相，根據水相與佐劑isa201vg體積比為46:55，量取佐劑；
(2)將量好的水相和佐劑放置在恆溫水浴鍋內加熱至32℃±1℃，待溫度穩定後將抗原加入到佐劑管中，震蕩器震蕩10min進行預乳化；
(3)將預乳化完的疫苗放置於盛滿冰的燒杯中，固定在預先處理好的超聲波細胞破碎儀上進行乳化；
(4)乳化結束後，觀察乳化效果：取部分疫苗置於離心管中，3,000rpm離心15min，疫苗不分層為合格；
(5)檢測合格的疫苗分裝到15ml離心管中，標記，封口膜封口，置於4℃保存。
實施例6：小鼠免疫攻毒實驗
6.1免疫實驗
(1)將疫苗拿到室溫(25℃)放置2h左右，使疫苗溫度恢復到常溫；
(2)給小鼠稱重、分組並標記，兩組為免疫試驗組(每組10隻小鼠)，分別免疫pvl-s亞單位疫苗和pvl-f亞單位疫苗；另一組為對照組(n＝10)，免疫pbs，並記錄數值；
(3)用1ml注射器吸取1ml疫苗，注意將氣泡排盡；然後用75％酒精棉球給後腿肌肉消毒，在肌肉塊中部進針，左右後腿各注射50μl疫苗；
(4)在一免後14天進行二免，二免後7天進行三免，並在一免前、二免前、三免前及三免後14天採集血清，檢測抗體效價。
(5)效價檢測結果如圖4所示：將檢測後的抗體效價結果整合到一張圖中，二免後2組免疫組相對抗體效價均能達到12,800以上，三免後2組免疫組相對抗體效價均能達到80,000以上；無論是二免後還是三免後，pvl-s免疫組的抗體效價均高於pvl-f免疫組的抗體效價，這也與攻毒結果相對應。
6.2攻毒實驗(三免後14天進行攻毒)
(1)挑取sa單菌落(菌株為本實驗室保存的cq339菌株)於5ml液體肉湯培養基中中，220rpm、37℃搖菌過夜；
(2)按百分之一的體積(1ml)將搖過夜的細菌接種於100ml新鮮液體肉湯培養基中，220rpm、37℃搖菌過夜；
(3)將100ml菌液裝入到500ml離心瓶中，8,000rpm離心10min，吸去培養基，菌體用100mlpbs重懸，重複上述步驟3次，最後將所有的菌體用5mlpbs重懸混勻；
(4)將菌液做10,000倍稀釋後計數。根據菌液的濃度，將原菌液稀釋到1.5×108cfu/ml(2mld50)；
(5)給2組免疫組和對照組小鼠稱重，一組免疫pvl-s蛋白試驗組(n＝10)，另一組免疫pvl-f蛋白試驗組(n＝10)；最後一組為對照組(n＝10)記錄數值；
(6)用1ml注射器吸取菌液，按照各濃度細菌對應的小鼠進行尾靜脈注射，注射量為200μl/20g小鼠。
(7)連續觀察小鼠的生存狀況，記錄每一隻小鼠的死亡時間：早中晚各檢查一次。
(8)攻毒後小鼠存活率結果如圖5所示：在觀察的308h之內，對照組死亡8隻，pvl-s免疫組死亡1隻，pvl-f免疫組死亡2隻，因此，對照組存活率只有20％，而2組免疫組存活率均高於80％，且pvl-s免疫組較pvl-f免疫組存活率高10％。
實施例7：elisa抗體效價檢測
(1)包被：用包被液(50mm碳酸鹽緩衝液，ph9.5)稀釋純化的檢測用蛋白(pvl-s蛋白或pvl-f蛋白)至0.5μg/ml，在酶標板上每孔加入100μl，封口膜封好後4℃冰箱放置過夜；
(2)洗滌：從冰箱取出酶標板後，放入洗板機中洗滌，洗滌液用pbst；
(3)封閉：每孔加入200μl封閉液(5％脫脂奶)，封口膜封好後37℃孵育2h；
(4)樣品準備：按已知的信息和需要用量，用封閉液將血清進行適度稀釋；
(5)洗滌：同(2)；
(6)加樣：加入稀釋血清，同時用封閉液做陰性對照，37℃孵育1h；
(7)洗滌：同(2)；
(8)加二抗：每孔加入適度稀釋的hrp標記的二抗100μl，37℃孵育0.5h；
(9)洗滌：同(2)；
(10)顯色：避光條件下每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃孵育10min；
(11)終止：每孔加入50μl終止液(2m的h2so4)，終止反應；
(12)檢測：於450nm波長測定樣品od值，分析數據；
(13)結果分析：判斷抗體陽性的標準：p/n≥2.1，od450≥0.1。
本發明通過上面的實施例進行舉例說明，但是，應當理解，本發明並不限於這裡所描述的特殊實例和實施方案。在這裡包含這些特殊實例和實施方案的目的在於幫助本領域中的技術人員實踐本發明。任何本領域中的技術人員很容易在不脫離本發明精神和範圍的情況下進行進一步的改進和完善，因此本發明只受到本發明權利要求的內容和範圍的限制，其意圖涵蓋所有包括在由附錄權利要求所限定的本發明精神和範圍內的備選方案和等同方案。
序列表
浙江海隆生物科技有限公司
奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎亞單位疫苗及其製備方法和應用
4
patentinversion3.3
4
879
dna
重組金黃色葡萄球菌pvl-s蛋白編碼基因序列
1
atgggaaatattgagaatattggtgatggcgctgaggtagtcaaaagaacagaagataca60
agtagcgataagtggggggtcacacaaaatattcagtttgattttgttaaagataaaaag120
tataacaaagacgctttgattttaaaaatgcaaggttttatcaattcaaagactacttat180
tacaattacaaaaacacagatcatataaaagcaatgaggtggcctttccaatacaatatt240
ggtctcaaaacaaatgaccccaatgtagatttaataaattatctacctaaaaataaaata300
gattcagtaaatgttagtcaaacattaggttataacataggtggtaattttaatagtggt360
ccatcaacaggaggtaatggttcatttaattattcaaaaacaattagttataatcaacaa420
aactatatcagtgaagtagaacgtcaaaattcaaaaagtgttcaatggggaataaaagct480
aattcatttatcacatcattaggtaaaatgtctggacatgatccaaatttatttgttgga540
tataaaccatatagtcaaaatccgagagactattttgttccagacaatgaattaccccca600
ttagtacacagtggtttcaatccttcatttattgcaactgtttctcatgaaaaaggctca660
ggagatacaagtgaatttgaaataacgtatggcagaaatatggatgttactcatgctact720
agaagaacaacacactatggcaatagttatttagaaggatctagaatacacaacgcattt780
gtaaacagaaattacacagttaaatatgaagtgaactggaaaactcatgaaattaaagtg840
aaaggacataatctcgagcaccaccaccaccaccactga879
4
921
dna
重組金黃色葡萄球菌pvl-f蛋白編碼基因序列
2
atgggagctcaacatatcacacctgtcagcgagaaaaaagtggatgacaaaatcactttg60
tacaaaacgactgctacatcagattctgacaaattaaaaatttctcaaattctaactttt120
aattttattaaagacaaaagttatgataaagacacattaatactaaaagctgccggaaac180
atttactcaggctatacccaacccacttctgatagtagtataaattcacaattttattgg240
ggagctaagtataatgtttttgttagctcggagtccaaagattctgtaaatattgttgac300
tacgcgcctaaaaatcaaaatgaagaatttcaagttcaacaaacattaggttattcatat360
ggcggagatattaatataataaatggattaactggtggattgaacgggtcaaaatcattt420
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