異葒草苷作為製備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途的製作方法

2023-09-27 08:17:50

專利名稱：異葒草苷作為製備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，特別涉及異葒草苷(isoorientin)作為製備抗呼吸道 合胞病毒的藥物的用途。
背景技術：
異葒草苷(isoorientin)是一個天然來源的黃酮6位碳苷類化合物，不少藥用 植物中都含有該化合物。在國家知識產權局、中國期刊網和Scifinder Scholar的檢索 結果顯示，有關異葒草苷的公開發明專利有三個①白花敗醬草中幾種高純度藥用物質 的快速製備方法(專利號200410068016. 2)；②藏茵陳提取物及其製備方法、藥物組合物 和用途(專利號200710163097. 8)；③從含羞草中分離純化黃酮苷單體的方法(專利號 200910096967. 3)。分別為異葒草苷從白花敗醬草、藏茵陳和含羞草中分離、純化的製備方 法。有關異葒草苷的研究論文大致可分為三類①異葒草苷的分離和結構鑑定從淡竹葉、 竹葉、含羞草、白花敗醬草、金蓮花、廣金錢草、大青葉、鴨蹠草、某些龍膽屬植物等中都曾分 離得到異葒草苷；②異葒草苷在植物中的含量分析淡竹葉、竹葉、金蓮花、線葉龍膽中的 異葒草苷含量測定研究；③異葒草苷的生物活性研究只有異葒草苷的抗菌活性研究，結 果顯示，該化合物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黃麴黴有一定的抑制活性。未發現從植物 中分離得到的異葒草苷或其它來源的異葒草苷在抗呼吸道合胞病毒方面的專利和文獻。本發明中的異葒草苷從中藥淡竹葉中分離得到。中藥淡竹葉為禾本科淡竹葉屬植 物淡竹葉(Lophatherum gracile Brongn.)的乾燥莖葉，1977年以來的歷版《中華人民共 和國藥典》對淡竹葉均有收載。淡竹葉性寒，味甘、淡，具清熱、除煩、利尿的功效，民間多用 於熱病心煩、口渴、口舌生瘡、牙齦腫痛、尿路炎症、小便熱痛等症的治療。現代藥理學研究 表明，淡竹葉具解熱利尿、抗菌、抗腫瘤、升高血糖等作用。有資料提及淡竹葉有抗病毒作 用，但卻沒見任何活性成分和抗病毒活性研究數據。呼吸道病毒感染是嚴重危害人類健康的傳染性疾病之一。呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus,RSV)屬副粘病毒科肺病毒屬，它所引起的呼吸道感染、喉 炎、氣管炎、支氣管炎和肺炎等是臨床上的常見病與多發病，易感人群為小孩和老人。血清 學統計表明，100%的兒童成年以前都感染過RSV。迄今為止，對RSV感染尚無有效的特異性 防治措施，核苷類藥物病毒唑(ribavirin)是唯一被FDA批准治療RSV感染的化學藥物，但 由於其療效有限、毒副作用大，臨床應用效果並不理想。另外，RSV抗體類藥物(如RSV單 克隆抗體Synagis)雖然療效較好，但使用周期長、費用高，尚未廣泛應用於臨床。因此，亟 需尋找和開發使用安全、特異性強的高效抗RSV感染藥物。

發明內容
為了解決上述現有技術中存在的不足之處，本發明的目的在於提供異葒草苷 (isoorientin)作為製備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途。本發明的目的通過下述技術方案來實現異葒草苷作為製備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物含有治療有效量的異葒草苷和藥學上可接受的載 體。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物製成散劑、丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、氣霧劑或注 射劑。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物可與臨床上應用的抗病毒藥物病毒唑組合，製備成 預防和治療由呼吸道合胞病毒感染引起疾病的藥物。所述異葒草苷分子結構如下 本發明所述異葒草苷可由淡竹葉或其它植物中分離得到，也可由其它途徑(如從 SIGMA等公司購買)獲得，純度大於或等於98%時，活性更好。本發明相對於現有技術，具有如下的優點及有益效果本發明針對目前呼吸道病 毒治療領域急需解決的問題，尋找出新的高效、低毒的抗呼吸道病毒藥物資源；本發明提供 的異葒草苷是天然來源的單體化合物，具有很強的抗呼吸道合胞病毒活性，且對宿主細胞 的毒性小。另外，體外抗病毒實驗表明，異葒草苷與臨床上常用的抗病毒藥物病毒唑聯合應 用時，具協同增效作用。因此，異葒草苷的抗病毒的活性具有高效、低毒、作用機理新穎的特 點，有很好的應用前景。


圖1是異葒草苷和病毒唑聯合應用時的抗呼吸道合胞病毒(RSV)活性照片圖，其 中a為正常喉癌Ofep-2)細胞照片，b為RSV感染的H印-2細胞照片，c為加入5. 7 μ g/mL 的異葒草苷後的RSV感染的!fep-2細胞照片，d為加入5. 7 μ g/mL的異葒草苷和2. 9 μ g/mL 病毒唑混合物後的RSV感染的H印-2細胞照片。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 於此。實施例1 異葒草苷體外抗呼吸道合胞病毒活性(1)細胞、病毒和實驗材料呼吸道合胞病毒(RSV，Long strain)，宿主細胞為喉 癌細胞(Hep-2細胞)；陽性對照藥為病毒唑(ribavirin)；細胞生長在質量百分比濃度為 10 %的小牛血清(FBS)的MEM培養基中；維持液是含有質量百分比濃度1 %的FBS的MEM培養基。(2)樣品溶液的配製分別將異葒草苷樣品(購買於SIGMA公司)和病毒唑樣品 用二甲基亞碸(DMSO)配成濃度為40mg/mL的溶液，再用維持液分別將樣品配製成400 μ g/ mL和25 μ g/mL的樣品溶液，分別用作細胞毒性和抗病毒活性實驗。
(3)用四唑鹽(MTT)比色法測定化合物的細胞毒性將Hep-2細胞培養在96孔培養板中，等單層細胞長好後，加入用維持液倍半稀釋 的系列濃度(濃度為400 12. 5μ g/mL)樣品溶液，在37°C，5 % C02培養箱中培養3天； 加入10 μ L MTT溶液(5mg/mL，用緩衝溶液配置)，繼續培養4小時。吸出樣品溶液，加入二 甲亞碸，室溫下，將96孔板置於微空孔板振蕩器中振蕩10分鐘。用酶標儀測定各孔的OD 值，測量波長為570nm，參比波長為630nm，計算樣品對細胞的半數致死毒性濃度(CC5tl)。每 組設4個平衡孔，每組實驗重複3次。計算結果，畫出曲線，求出半數毒性濃度(CC5tl)。(4)通過觀察樣品對細胞病變效應的抑制程度(cytopathic effect reductionassay) IlJ定抗病毒 舌個生
將Hep-2細胞培養在96孔培養板中，等單層細胞長好後，加入用維持液稀釋好的 100倍半數感染量(IOOTCID5ci)的病毒液，再加入用維持液倍半稀釋的系列濃度(濃度為 25 0.8 μ g/mL)樣品溶液，在37°C，5 % C02培養箱中培養3 4天。每天於倒置顯微鏡 下觀察細胞病變效應(CPE)的程度，並記錄-表示無CPE ；+表示0 25%細胞有CPE ；2+ 表示25 50%細胞有CPE ；3+表示50 70%細胞有CPE ；4+表示75 100%細胞有CPE。 最後估計出半數抑制濃度(IC5tl)。選擇性指數(Si) = CC50/IC50O實驗結果異葒草苷體外抑制呼吸道合胞病毒的IC5tl = 5. 7 士0. 8 μ g/mL, CC50 = 362. 6 士0. 7 μ g/mL, SI = 63. 6。病毒唑體外抑制呼吸道合胞病毒的IC5tl = 2. 9 士0. 2 μ g/mL, CC50 = 62. 6 + 3. 2 μ g/mL, SI = 21. 6。可見，異葒草苷抑制RSV的SI值(Si = CC5(1/IC5(1)高於陽性對照藥病毒唑，其抗病 毒的活性具有高效、低毒的特點。實施例2 異葒草苷與病毒唑聯合用藥的體外抗呼吸道合胞病毒活性測定(1)細胞、病毒和實驗材料呼吸道合胞病毒(RSV，Long strain)，宿主細胞為喉 癌細胞(Hep-2細胞)；陽性對照藥為病毒唑(ribavirin)；細胞生長在質量百分比濃度為 10%的小牛血清(FBS)的MEM培養基中；維持液是質量百分比濃度為1 %的FBS的MEM培養基。(2)樣品溶液的配製分別將異葒草苷樣品(購買於SIGMA公司)和病毒唑樣品 用二甲基亞碸(DMSO)配成濃度為40mg/mL的溶液，用維持液分別將異葒草苷和病毒唑配製 成5. 7 μ g/mL和3. 0 μ g/mL的溶液，再將兩者按體積比1 1混合成待測樣品溶液。(3)採用細胞病變抑制法(cytopathic effect reduction assay)測定異葒草苷 和病毒唑聯合應用的抗病毒活性將Hep-2細胞培養在96孔培養板中，等單層細胞長好後，加入用維持液稀釋好的 100倍半數感染量(IOOTCID5ci)的病毒液，再加入待測樣品溶液，在37°C，5 % C02培養箱中 培養3 4天。每天於倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)的程度，並記錄_表示無 CPE ；+表示0 25%細胞有CPE ；2+表示25 50%細胞有CPE ；3+表示50 70%細胞有 CPE ；4+表示75 100%細胞有CPE。最後用數位相機照相。實驗結果如圖1所示，在異葒草苷和病毒唑的半數抑制濃度(IC5tl分別為5.7 μ g/ mL和3. 0 μ g/mL)時，兩者聯合應用能100%抑制由RSV引起的細胞病變，說明兩者具有協同作用。實施例3 異葒草苷體內抗呼吸道合胞病毒活性(1)動物昆明種雄性或雌性小白鼠(18 22g)。(2)動物實驗採用小鼠RSV感染模型，測定異葒草苷內抗呼吸道合胞病毒(抗 RSV)活性。選用BALB/C小鼠60隻，雄雌各半，隨機分成6組，分別為異葒草苷高劑量組 (40. Omg/ (kg ·(!))、中劑量組(20. Omg/ (kg -d))、低劑量組(10. Omg/ (kg -d))、病毒唑 IOmg/ (kg · d)、病毒陽性和生理鹽水陰性對照組，每組10隻。灌胃給藥，陽性和陰性對照組灌胃 生理鹽水。三天後，經鼻滴入RSV懸液(TCID5tl為I(T66Ail)，繼續灌胃給藥7天，觀察小鼠 存活情況。最後給藥40min後處死小鼠，無菌取肺組織，勻漿、用維持液吹打懸浮、離心、稀 釋，接種在Hep-2細胞上，採用細胞病變效應抑制法測定病毒滴度，計算病毒抑制率。實驗結果如表1所示，可見異葒草苷在體內能抑制抗呼吸道合胞病毒，且具有劑 量依賴性。表1異葒草苷體內抗呼吸道合胞病毒結果 *χ2檢驗，與病毒對照組比較ρ < 0. 05實施例4 異葒草苷片劑的製備取異葒草苷Ig與微晶纖維素27g及硬脂酸鎂2g混合，混合物用單衝壓片機打成 直徑6mm，重量300mg的片。本片劑中每片含異葒草苷10mg。實施例5 異葒草苷膠囊劑的製備取異葒草苷Ig與乳糖27g、硬脂酸鎂2g混合，以每300mg填充膠囊。本膠囊劑中， 每個膠囊含異葒草苷10mg。實施例6 異葒草苷散劑的製備取異葒草苷5g與澱粉25g混合，加水製成軟材，過12目篩進行造粒，乾燥後得到 散劑。本散劑中，每300mg中含異葒草苷50mg。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明 的保護範圍之內。
權利要求
異葒草苷作為製備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述抗呼吸道合胞病毒的藥物含有治療 有效量的異葒草苷和藥學上可接受的載體。
3.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述抗呼吸道合胞病毒的藥物製成散劑、 丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、氣霧劑或注射劑。
全文摘要
本發明公開了異葒草苷作為製備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物含有治療有效量的異葒草苷和藥學上可接受的載體。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物製成散劑、丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、氣霧劑或注射劑。本發明針對目前呼吸道病毒治療領域急需解決的問題，尋找出新的高效、低毒的抗呼吸道病毒藥物資源；本發明提供的異葒草苷是天然來源的單體化合物，具有很強的抗呼吸道合胞病毒活性，且對宿主細胞的毒性小；另外，體外抗病毒實驗表明，異葒草苷與臨床上常用的抗病毒藥物病毒唑聯合應用時，具協同增效作用。因此，異葒草苷的抗病毒的活性具有高效、低毒、作用機理新穎的特點，有很好的應用前景。
文檔編號A61P11/00GK101843612SQ201010178799
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者葉文才, 張曉琦, 李藥蘭, 王英, 範春林 申請人:暨南大學