酒和/或釀酒副產物中酚酸和/或其酯的檢測方法與流程

2023-09-27 06:01:15 2

本發明涉及酒和/或釀酒副產物中酚酸和/或其酯的檢測方法，屬於化學分析
技術領域：
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背景技術：
：酚酸是一類含有酚環的有機酸，具有抗氧化活性及清除自由基的作用，其相對應的一些酚酸酯類化合物也具有類似的生物活性。如，阿魏酸及阿魏酸乙酯均具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放，抑制血小板血栓素a2(txa2)的生成，增強前列腺素活性，鎮痛，緩解血管痙攣，調節免疫功能，清除和抑制氧自由基，在人體中可起到健美和保護皮膚的作用。釀酒的原輔材料本身存在一些酚酸/酯類物質，另外，釀酒過程中，原輔材料在各酶系、微生物的作用下也會生成一些酚酸/酯，這些具有生物活性的物質經釀造過程進入酒體中，使得酒類產品具有一定的保健功效。研究酒中的酚酸/酯類物質，闡明其生理活性，能夠為「適度飲酒有利於健康」這一觀點提供理論依據，對酒類產品的市場推廣有重要的意義。同時，分析酒中所含有的有益活性物質、明確其種類和含量，有利於提升酒的品質，並有助於對酒的質量進行有效監控。然而，由於酒及釀酒副產物成分及其複雜，酚酸/酯類化合物在其中僅為痕量物質，檢測難度較大。而且，酚酸本身含有較多-oh和-cooh，使得它們具有極性強、柱保留弱的特點，而酚酸酯的極性相對較弱，柱保留較強，所以，要同時分離並檢測這兩類化合物難度就更大。目前，尚未見檢測酒和/或釀酒副產物中酚酸和/或其酯類化合物的相關報導，因此，亟需提供一種操作簡便、靈敏度高、準確度高的檢測方法。技術實現要素：本發明的目的是提供酒和/或釀酒副產物中酚酸和/或其酯的檢測方法。本發明提供了酒和/或釀酒副產物中酚酸和/或其酯的檢測方法，通過高效液相色譜-質譜聯用進行檢測；所述高效液相色譜採用反相色譜，流動相的水相中含有0.1～1g/l甲酸或乙酸，有機相為甲醇或乙腈；所述質譜採用負模式檢測。進一步地，所述高效液相色譜採用梯度洗脫，流動相為：0～15min：5～100％v/v甲醇；15～20min：100％v/v甲醇；20～22min：5％v/v甲醇；停止洗脫。進一步地，所述高效液相色譜的色譜柱為c18柱。進一步優選地，所述高效液相色譜的色譜柱為zorbaxeclipseplusc18柱。進一步優選地，所述zorbaxeclipseplusc18柱長100mm，內徑2.1mm，粒徑1.8μm。進一步地，所述高效液相色譜柱溫為25～35℃，流速為0.1～0.4ml/min，進樣量為1～10ul。進一步優選地，柱溫為30℃，流速為0.2ml/min，進樣量為2ul。進一步地，每1ml進樣樣品對應酒10ml；或，每1ml進樣樣品對應黃水1ml；或，每1ml進樣樣品對應酒糟2g。進一步地，水相含有0.1±0.01g/l甲酸或乙酸。進一步優選地，水相含有0.1g/l甲酸或乙酸。進一步地，所述質譜的檢測條件為：採用電噴霧離子源，乾燥氣溫度280～350℃，乾燥氣流量8～12l/min，霧化氣壓力30～40psig，毛細管電壓3500～4000v，毛細管出口電壓60～135v。進一步優選地，乾燥氣溫度325℃，乾燥氣流量10l/min，霧化氣壓力40psig，毛細管電壓3500v，毛細管出口電壓90v。進一步地，進樣高效液相色譜前，所述酒和/或釀酒副產物採用hlb固相萃取柱預處理。其中，所述hlb固相萃取柱的填料吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性n-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物。進一步地，所述hlb固相萃取柱預處理的方法為：上樣，0.01％w/w甲酸水淋洗，90％甲醇水溶液洗脫，濃縮甲醇水洗脫液，即得檢測樣品。進一步地，所述檢測樣品用甲醇或乙腈溶解，樣品溶解後再進樣檢測。進一步地，所述的酚酸為沒食子酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、芥子酸、咖啡酸、原兒茶酸中一種或兩種以上的混合物。進一步地，所述的酚酸酯為酚酸乙酯。進一步地，所述的酒為蒸餾酒。進一步優選地，所述的蒸餾酒為白酒。進一步優選地，所述白酒為五糧液濃香型白酒的基酒。進一步地，所述的釀酒副產物為釀造所述酒產生的酒糟、黃水、酒尾、底鍋水中一種或兩種以上的混合物。進一步地，所述質譜的檢測器為四級杆飛行時間質譜檢測器。進一步地，所述質譜選擇m/z分子離子作為定量離子。進一步地，所述酒和/或釀酒副產物中酚酸或其酯的m/z信號峰根據標準物質對照品確定；採用所述檢測方法，酚酸或其酯與相應的標準物質對照品m/z信號峰的出峰時間一致。進一步地，所述酚酸的m/z信號峰為：化合物m/z出峰時間/min沒食子酸169.01423.167阿魏酸193.05068.22香草酸167.0356.60丁香酸197.04556.90芥子酸223.06128.10咖啡酸179.0356.77原兒茶酸153.01934.62所述酚酸酯的m/z信號峰為：化合物m/z出峰時間/min沒食子酸乙酯197.04557.60香草酸乙酯195.066310.75阿魏酸乙酯221.081911.50進一步地，所述酚酸和/或其酯的含量計算方法還包括如下步驟：a、繪製標準曲線：配製酚酸和/或其酯的標準溶液，根據所述檢測方法進樣檢測，分別以酚酸或其酯m/z信號峰的峰面積和標準溶液濃度為橫縱坐標，繪製濃度-峰面積標準曲線；b、檢測並計算含量：酒和/或釀酒副產物按所述檢測方法進樣檢測，根據酚酸或其酯m/z信號峰的峰面積與步驟a的標準曲線計算出含量，即可。本發明提供了一種酒和/或釀酒副產物中酚酸和/或其酯的檢測方法。該方法選擇了合適的液相-質譜條件，通過向流動相中添加適量的甲酸或乙酸(0.1～1g/l)，不僅可以延長酚酸類物質的柱保留，實現幾種化合物的良好分離，又不至於造成質譜負模式檢測條件下儀器噪音基線過高、檢測靈敏度降低等問題。進樣檢測前選擇hlb固相萃取小柱對酒和/或釀酒副產品進行預處理，預處理方法簡便快捷，一方面能同時吸附樣品中的酚酸及酚酸酯兩類親水性質不同的化合物，另一方面又可以有效除去樣品中的糖類物質，避免對酚酸/酯的檢測造成幹擾。此外，本發明利用高分辨的四級杆飛行時間質譜檢測器，以質荷比(m/z)、同位素相對豐度、同位素比例等的相似度，定性各種酚酸/酯，檢測靈敏度高，準確性好，可大大減少樣品中其它離子的幹擾，排除樣品檢測的假陽性結果。檢測結果表明，採用本發明方法可以同時分離與檢測沒食子酸、阿魏酸等酒類產品中常見的酚酸/酯類化合物，靈敏度高且檢測結果準確，是一種檢測酒及釀酒副產物中這類物質種類及含量行之有效的方法。附圖說明圖1為標準溶液濃度為400μg/l時10種酚酸/酯類標準物質總離子流圖及提取離子流圖；圖2為白酒樣品總離子流圖；圖3為酒糟黃水樣品總離子流圖；圖4為酒糟樣品總離子流圖；圖5為對比例1中流動相不加酸的總離子流圖及提取離子流圖；圖6為流動相甲酸含量為1.5g/l的總離子流圖及提取離子流圖；圖7為對比例2中酒糟黃水樣品總離子流圖；圖8為對比例3中酒糟黃水樣品總離子流圖。具體實施方式本發明具體實施方式中使用的原料、設備均為已知產品，通過購買市售產品獲得。本發明採用高效液相色譜-質譜聯用法對酒和/或釀酒副產物中酚酸和/或其酯進行檢測，填補了該領域檢測方法的空白，主要具有以下創新點：1、由於酚酸類物質本身含有較多-oh、-cooh基團，使得它們具有極性強，柱保留弱的特點，所以必須向流動相中添加適宜種類的酸才能延長酚酸的柱保留，實現幾種酚酸良好的分離。但是，由於質譜採用負模式檢測(-oh、-cooh基團在流動相或者離子源離子化的過程中易於脫掉-h，變成帶有負電荷的離子，適合採用負模式檢測)，若流動相中酸的加入量過大，會抑制樣品中待測化合物的離子化，導致儀器噪音基線過高，大大降低檢測靈敏度。因此，流動水相中添加酸的種類和用量均非常關鍵。發明人經過反覆考察，確定流動相中添加0.1～1g/l甲酸或乙酸為最佳，不僅可以延長酚酸類物質的柱保留，實現幾種化合物的良好分離，又不至於造成質譜負模式檢測條件下儀器噪音基線過高，檢測靈敏度降低等問題。相反，若甲酸或乙酸含量小於0.1g/l，各酚酸類化合物之間難於分離、且出現峰拖尾；甲酸或乙酸含量大於1g/l時，所檢測的酚酸化合物離子化響應降低，影響其檢測限。2、前期研究發現，如果將樣品濃縮後直接進樣檢測，酒類產品，特別是酒糟、酒糟黃水中高濃度的糖類和酚酸出峰時間比較靠近，對樣品中酚酸的檢測幹擾非常大，所以必須除去樣品中的糖類物質。本發明在進樣檢測前選擇hlb固相萃取小柱對酒和/或釀酒副產品進行預處理。上樣hlb小柱後，糖類物質經由甲酸水淋洗除去，此時所要檢測的目標化合物酚酸/酯仍保留在小柱上，再經由甲醇洗脫下來，實現樣品中目標化合物與雜質的分離，避免檢測過程中雜質的幹擾。另外，使用hlb小柱對樣品進行預處理，才能夠達到同時檢測酚酸、酚酸酯兩類物質的目的，使用其他小柱則無法實現這一目的：本發明的檢測對象之一酚酸，其苯環上帶有多個-oh以及-cooh，使得化合物具有較強的親水性；而另一檢測對象酚酸酯，由於-cooh親水端消失，極性變弱，疏水性變強。也就是說，上述兩類化合物一類親水性強，一類疏水性較強，如何在預處理過程中對它們均產生一定的柱保留，並與糖類雜質完全分離，實現酚酸及其酯的同時檢測，是需要解決的一大難題。發明人經過反覆考察發現，hlb小柱對這兩類親水疏水性質不同的化合物均具有一定的柱保留；相反，如果採用其他類型的固相萃取小柱(如c18小柱)進行預處理，樣品中部分酚酸無法保留在小柱上，不能與雜質有效分離，難以實現準確檢測。以下具體實施例中，以酒類產品中常見的、極性強弱差別很大的七種酚酸和三種酚酸乙酯為代表，證明採用本發明方法可以同時分離與檢測酚酸/酯類化合物，靈敏度高且結果準確，是一種檢測酒及釀酒副產物中這類物質種類及含量行之有效的方法。以下例子採用安捷倫1290lc-6520qtof液質聯用儀，waters公司的primehlb小柱。實施例1採用本發明方法檢測白酒中酚酸/酯類化合物lc-qtof(高效液相色譜四級杆飛行時間質譜聯用儀)的液相色譜條件：流動相：a為超純水溶液(0.1g/l甲酸)，b為甲醇，梯度洗脫為：0-15min：5～100％v/vb(儀器自動實現梯度變化)；15-20min：100％v/vb；20-22min：5％v/vb；停止洗脫。色譜柱為zorbaxeclipseplusc18柱，柱長100mm，內徑為2.1mm，粒徑為1.8μm，柱溫為30℃，流速為0.2ml/min，進樣量為2μl。lc-qtof聯用儀的質譜條件為：採用電噴霧離子源，負模式，乾燥氣溫度325℃，乾燥氣流量10l/min，霧化氣壓力40psig，毛細管電壓3500v，毛細管出口電壓90v。a、繪製標準曲線：以甲醇為溶劑，配製酚酸及酚酸酯混合標準母液100ml(沒食子酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、芥子酸、咖啡酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、香草酸乙酯、阿魏酸乙酯濃度分別為1000mg/l)，用70％甲醇稀釋母液，分別配製濃度為20μg/l、80μg/l、400μg/l、800μg/l、1500μg/l、2000μg/l的標準溶液並進樣lc-qtof聯用儀，根據各溶液濃度與其對應的m/z的峰面積計算得到了濃度-峰面積標準曲線。各酚酸類化合物的線性範圍、線性方程、r2值、檢測限、檢測靈敏度(rsd)，如下表所述：表1各酚酸類化合物的標準曲線以上標準物質總離子流圖及提取離子流圖見圖1(圖中橫坐標表示時間/min，縱坐標表示離子強度)，各酚酸類化合物的m/z信號峰見下表：表2各酚酸類化合物的m/z信號峰化合物m/z出峰時間/min沒食子酸169.01423.167阿魏酸193.05068.22香草酸167.0356.60丁香酸197.04556.90芥子酸223.06128.10咖啡酸179.0356.77原兒茶酸153.01934.62沒食子酸乙酯197.04557.60香草酸乙酯195.066310.75阿魏酸乙酯221.081911.50b、白酒樣品處理：分別取白酒樣品三份(五糧濃香型白酒的基酒，由五糧液技術研究中心分析研究室提供)，各10ml，其中的兩份分別加入酚酸標準溶液100ug/l，800ug/l，於80℃蒸發濃縮，上樣hlb，0.01％w/w甲酸水淋洗，90％甲醇水溶液洗脫，甲醇水洗脫液氮氣吹乾，1ml甲醇溶解，作為檢測樣品進樣lc-qtof。白酒樣品總離子流圖見圖2(圖中橫坐標表示時間/min，縱坐標表示離子強度)。c、分析色譜質譜圖：在總離子流圖中提取各酚酸類化合物的m/z，得到各酚酸類化合物提取離子色譜圖，並積分，定量各酚酸類化合物。以步驟b處理後的白酒樣品，進行方法的回收率測定，檢測結果見下表：表3白酒樣品的回收率測定結果實施例2採用本發明方法檢測酒糟黃水中酚酸/酯類化合物a、標準曲線繪製與實施例1中的相同；lc-qtof聯用儀的液相色譜的條件與實施例1相同。b、分別取酒糟黃水樣品三份(由五糧液技術研究中心分析研究室提供)，各1ml，其中的兩份分別加入酚酸標準溶液200ug/l，2000ug/l，上樣hlb，0.01％w/w甲酸水淋洗，90％甲醇水溶液洗脫，甲醇水洗脫液氮氣吹乾，1ml甲醇溶解，作為檢測樣品進樣lc-qtof。酒糟黃水樣品總離子流圖見圖3(圖中橫坐標表示時間/min，縱坐標表示離子強度)。c、分析色譜質譜圖：在總離子流圖中提取各酚酸類化合物的m/z，得到提取離子色譜圖，並積分，定量各酚酸類化合物。以步驟b處理後的酒糟黃水樣品，進行方法的回收率測定，檢測結果見下表：表4酒糟黃水樣品的回收率測定結果實施例3採用本發明方法檢測酒糟中酚酸/酯類化合物a、標準曲線繪製與實施例1中的相同；lc-qtof聯用儀的液相色譜的條件與實施例1相同。b、分別取酒糟樣品三份(酒糟樣品由五糧液技術研究中心分析研究室提供)，各10g，其中的兩份分別加入酚酸標準溶液200ug/l，2000ug/l，50ml甲醇浸提，取10ml浸提液於90℃蒸發除去甲醇，水稀釋後上樣hlb，0.01％w/w甲酸水淋洗，90％甲醇水溶液洗脫，甲醇水洗脫液氮氣吹乾，1ml甲醇溶解，作為檢測樣品進樣lc-qtof。酒糟樣品總離子流圖見圖4(圖中橫坐標表示時間/min，縱坐標表示離子強度)。c、分析色譜質譜圖：在總離子流圖中提取各酚酸類化合物的m/z，得到各酚酸類化合物的提取離子色譜圖，並積分，定量各酚酸類化合物。以步驟b處理後的酒糟樣品，進行方法的回收率測定，檢測結果見下表：表5酒糟樣品的回收率測定結果以下通過對比例進一步證明本發明的有益效果。對比例1流動水相中酸含量對檢測效果的影響取實施例1中製備的濃度為400μg/l的標準溶液，分別在下述兩種流動水相酸含量條件下進樣檢測，其餘色譜、質譜條件均與實施例1相同：條件一：流動水相中不添加酸；條件二：流動水相中甲酸含量為1.5g/l。實驗結果：流動水相中不添加酸的標樣分離效果圖見圖5，流動水相中甲酸含量為1.5g/l的標樣分離效果圖見圖6(圖中橫坐標表示時間/min，縱坐標表示離子強度)。從圖中可以看出，流動水相中不添加甲酸，出峰時間靠前的幾個化合物，出現峰寬，峰拖尾，且難於分離；流動水相中甲酸含量大於1g/l時，目標化合物響應明顯降低，特別是極性較弱的酚酸酯，如阿魏酸乙酯無響應。在上述兩種酸含量的條件下，酚酸/酯的分離效果均明顯不如圖1。上述實驗結果表明，本發明確定的檢測條件，即流動相中添加0.1～1g/l甲酸或乙酸，檢測效果最佳，不僅可以延長酚酸類物質的柱保留，實現幾種化合物的良好分離，又不至於造成質譜負模式檢測條件下儀器噪音基線過高，檢測靈敏度降低等問題。若流動水相中酸含量在該範圍之外，均難以達到良好的檢測效果。對比例2hlb小柱預處理對檢測效果的影響取酒糟黃水樣品，採用與實施例2相同的方法及條件進樣檢測，但進樣前不使用hlb小柱預處理。檢測結果見圖7(圖中橫坐標表示時間/min，縱坐標表示離子強度)。從圖中可以看出，所需檢測的目標化合物出峰位置被大量雜質峰覆蓋，根本無法準確檢測(可與圖3分離效果對比)。上述實驗結果表明，進樣檢測前選擇hlb固相萃取小柱對酒和/或釀酒副產品進行預處理，可以有效除去樣品中的糖類物質，避免對酚酸/酯的檢測造成幹擾。對比例3梯度洗脫條件對檢測效果的影響取酒糟黃水樣品，採用與實施例2相同的方法及條件進樣檢測，但流動相不同：a為超純水溶液(0.1g/l甲酸)，b為甲醇，梯度洗脫條件：0-10min：20～100％v/vb(儀器自動實現梯度變化)；10-15min：100％v/vb；15-17min：20％v/vb；停止洗脫。檢測結果見圖8(圖中橫坐標表示時間/min，縱坐標表示離子強度)。從圖中可以看出，對比例實驗中，流動相甲醇比例增加過快，結果難以實現樣品中目標化合物與雜質的分離(可與圖3分離效果對比)。上述實驗結果表明，採用本發明梯度洗脫的流動相條件，可以最大限度地減小雜質幹擾，實現所檢測目標化合物的分離；若梯度洗脫過程中甲醇比例增加過快，會影響酚酸/酯類化合物之間的分離，且雜質對所檢測化合物的幹擾也更明顯。當前第1頁12