口服熱淋清顆粒後腎臟組織兩種化學成分的測定方法
2023-10-05 22:21:24
口服熱淋清顆粒後腎臟組織兩種化學成分的測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種口服熱淋清顆粒後腎臟組織兩種化學成分的確定及其含量測定方法，含量測定方法是採用高效液相色譜—質譜聯用檢測方法，在所建立的檢測方法下對口服熱淋清顆粒後腎臟組織中的化學成分沒食子酸和原兒茶酸進行含量測定。本發明含量測定方法的精密度高，重現性好，穩定性好，測定結果準確，可有效評價口服熱淋清顆粒後沒食子酸和原兒茶酸在腎臟組織中的分布。
【專利說明】口服熱淋清顆粒後腎臟組織兩種化學成分的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於中藥有效成分體內代謝研究【技術領域】，具體涉及一種口服熱淋清顆粒後腎臟組織兩種化學成分的確定及其含量測定方法。
【背景技術】
[0002]熱淋清顆粒是以苗藥頭花寥為原料製成的單方製劑，收載於《中國藥典》2010版。具清熱解毒、利尿通淋的功效。用於溼熱蘊結，小便黃赤，淋漓澀痛之症，尿路感染，腎盂腎炎見上述證候者。對泌尿系統感染具有確切的療效。「熱淋清顆粒」為國家中藥保護品種、國家社保藥物，並為唯一進入2010版《中國藥典》的苗藥，獲國家發展改革委員會單獨定價權。
[0003]根據文獻報導，熱淋清顆粒中主要的化學成分為酚酸類化合物和黃酮類化合物。現熱淋清顆粒收載於《中國藥典》2010版，該標準【含量測定】項僅以沒食子酸為指標成分。熱淋清顆粒臨床上主要應用於治療泌尿系統疾病，其發揮功效的有效成分是哪些？如何到達腎臟發揮作用？在腎臟中如何進行代謝？這些問題的解決必須依賴於一種準確可靠的有效成分含量測定方法，本發明正是基於這樣的背景，發明了一種評價口服熱淋清顆粒後腎臟組織中化學成分的含量測定方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於:提供一種口服熱淋清顆粒後腎臟組織兩種化學成分的確定及其含量測定方法。本發明通過對口服熱淋清顆粒後腎臟組織中的化學成分沒食子酸及原兒茶酸進行含量測定研究，使口服熱淋清顆粒後體內研究更為科學合理。
[0005]本發明是這樣實現的:
[0006]提供一種口服熱淋清顆粒後腎臟組織兩種化學成分的測定方法，其包括以下步驟:
[0007](I)測試樣品的製備:
[0008](a)取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給予大鼠(體重230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg ；
[0009](b)分別在30~360min，後對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中；
[0010](C)加入內標巖白菜素母液10 μ 1，然後按腎臟組織與沉澱試劑體積比為1:4~8沉澱蛋白，沉澱時間2~5min，渦旋混勻30~60s後，在O~10°C恆溫條件下以10000~12000r/min離心5~15min(所述的沉澱試劑為乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)混合液並且添加I %~4%酸，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合)
[0011](d)將上層液轉移至新空白EP管中，於30~50°C氮氣流吹乾，殘留物用100μΙ流動相溶解，渦旋混勻30~60s後，在O~10°C恆溫條件下以10000~12000r/min離心5?15min，取上清液即為供試品溶液；
[0012](e)按步驟(b)至步驟(d)的方法對未服用藥物的動物腎臟組織進行處理，得到空白溶液；
[0013](f)對照品溶液的製備:分別精密稱取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01?lmg,各自加純甲醇定容至IOml,即得三種母液,分別取三種母液適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至所需濃度，即為對照品溶液；
[0014](2) LC-MS/MS分析的色譜條件和檢測條件:
[0015]色譜柱為反相色譜柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，流速為0.1?0.5mL/min,柱溫為20?40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2000?3000V，霧化溫度為300?500°C，鞘氣壓力為30?50mTorr，輔助氣壓力為5?15mTorr，毛細管溫度為200?400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.05%?0.5 %，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合);
[0016](3)測定法:分別精密吸取對照品溶液、空白溶液與供試品溶液5?20μ L，注入高效液相色譜-質譜聯用儀，測定，即得。
[0017]根據本發明的方法，其中步驟(a)中，通過灌胃給藥方式給大鼠(230?270g)熱淋清顆粒水溶液2?4ml。
[0018]根據本發明的方法，其中步驟(b)中，分別在30min，60min，2h，3h，6h後大鼠進行米血。
[0019]根據本發明的方法,其中步驟(b)中，將樣品於低速離心機5000r/min離心lOmin。
[0020]根據本發明的方法，其中步驟(c)中，用酸度為2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉澱蛋白5min。
[0021]根據本發明的方法，其中步驟(C)中，沉澱蛋白後渦旋均勻30s後4°C恆溫離心，轉速 12000r/min,離心 IOmin0
[0022]根據本發明的方法，其中步驟(C)中，使用甲酸:乙酸=2:1體積比混合酸來酸化沉澱試劑。
[0023]根據本發明的方法，其中兩種入腎臟成分是沒食子酸和原兒茶酸。
[0024]根據本發明的方法，其中步驟(d)中，將上層清液於氮吹儀於40°C吹乾。
[0025]根據本發明的方法，其中步驟(d)中，殘留物用ΙΟΟμ I流動相溶解，渦旋混勻60s後12000r/min, 4°C恆溫,離心IOmin後取10 μ I進樣。
[0026]根據本發明的方法，其中步驟(2)中，色譜柱為C18色譜柱。
[0027]根據本發明的方法，其中步驟(2)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.1%。
[0028]根據本發明的方法，其中步驟⑵中,流速為0.2ml/min，柱溫為30°C。
[0029]根據本發明的方法，其中步驟(2)中，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr，毛細管溫度為300°C。
[0030]根據本發明的方法，其中步驟(2)中，使用梯度洗脫，洗脫液的變化為:開始時，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相98%，穩定3min ;接著至第IOmin時，酸性乙腈相線性增加至10%，酸性水溶液相90% ;第10.1min時，酸性乙腈相改為2 %，酸性水溶液相98%，穩定7min。
[0031]根據本發明的方法，其中步驟(3)中，分別精密吸取對照品溶液、空白溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質譜聯用儀。
[0032]根據本發明的方法，其中步驟(2)中，質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對及形成穩定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(TybeLens Offset) 71V,碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(CollisionEnergy) 13eV ;原兒茶酸 152.918 — 109.244，補償電壓(Tube Lens Offset) 75V，碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.SmTorr,碰撞能量(Collision Energy) l；3eV ;內標巖白菜素 326.922 — 192.167，補償電壓(Tube Lens Offset) 100V，碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 22eV。
[0033]根據本發明的方法，其特徵在於:取熱淋清顆粒2.0g，W 5?10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30?360min後，對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1?0.5g，加5?10生理鹽水，粉碎，3000?6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，用酸度為2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉澱蛋白5min，渦旋均勻30s後4°C恆溫離心，轉速12000r/min，離心lOmin，將上層清液於氮吹儀於40°C吹乾，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻60s後12000r/min，4°C恆溫，離心IOmin後取10 μ I進樣，空白腎臟組織按同樣方法處理，採用液相色譜-質譜聯用儀按以下條件進行LC-MS/MS分析:
[0034]色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5% )乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5%)水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2ml/min，柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr，毛細管溫度為3500C ；
[0035]對照品溶液的製備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01?lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0036]測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質譜聯用儀，測定，即得。
[0037]前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩定7min。
[0038]前述質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對及形成穩定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原兒茶酸 I52.918 — 109.244，補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,內標 326.922 — 192.167,補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0039]根據本發明，所述反相色譜柱是C18色譜柱。[0040]根據本發明的方法，其優選地包括以下步驟:
[0041]取熱淋清顆粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30?360min，後對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1?0.5g，加5?10生理鹽水，粉碎，3000?6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，加入內標巖白菜素10 μ 1，然後按1:4?1:8體積比用I?4%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉澱蛋白，沉澱時間2?5min,潤旋混勻30?60s後10000?12000r/min, O?10°C恆溫,離心5?15min,上層液轉移至新空白EP管中於30?50°C氮氣流吹乾，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻30?60s後10000?12000r/min, O?10°C恆溫，離心5?15min後取5?20 μ I進樣，空白血楽.按同樣方法處理，採用液相色譜-質譜聯用儀按以下條件進行LC-MS/MS分析:
[0042]色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5% )乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5%)水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.1?0.5mL/min,柱溫為20?40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2000?3000V，霧化溫度為300?500°C，鞘氣壓力為30?50mTorr，輔助氣壓力為5?15mTorr，毛細管溫度為200?400°C ；
[0043]對照品溶液的製備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01?lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0044]根據本發明的方法，其特徵在於腎臟組織樣品按以下步驟操作:
[0045]取熱淋清顆粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30?360min，後對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1?0.5g，加5?10生理鹽水，粉碎，3000?6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，加入內標巖白菜素10 μ 1，然後按1:4體積比用2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉澱蛋白，沉澱時間5min，渦旋混勻後12000r/min離心5min，上層液轉移至新空白EP管中於40°C氮氣流吹乾，殘留物用100 μ I流動相溶解，4°C恆溫，12000r/min離心IOmin後取10 μ I進樣，空白腎臟組織樣品按同樣方法處理。
[0046]根據本發明的方法，其特徵在於色譜柱規格為2.1 X 150mm，填料粒徑為1.7μπι，以甲酸0.1 %乙腈Α:甲酸0.1 %水B為流動相，按以下條件梯度洗脫:0?3min2%A, 3.0 ?3.1min2% A—10% A, 3.I ?10.0minl0% A, 10.0 ?10.1minl0% -2% A, 10.1 ?17.0min2% A。
[0047]根據本發明的方法，其特徵在於，質譜噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為350°C。
[0048]根據本發明的方法，其特徵在於:質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對分別為:沒食子酸 169.181 — 125.268，原兒茶酸 152.918 — 109.244，內標 326.922 — 192.167。
[0049]以下是本發明人對口服熱淋清顆粒後腎臟組織中化學成分含量測定進行研究的過程:
[0050]一、口服熱淋清顆粒腎臟組織中化學成分的確定
[0051]本發明人對於有關熱淋清顆粒及其原料藥的文獻進行了大量的研究，而且根據發明人所在課題組前期對頭花寥展開的化學成分研究發現，沒食子酸和原兒茶酸為頭花寥中的生物活性成分，因此選取熱淋清顆粒中的沒食子酸和原兒茶酸為指標進行了口服熱淋清顆粒後腎臟組織分布試驗研究。
[0052]取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在給藥後30min，60min，2h，3h，6h，後對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.5g，加5生理鹽水，粉碎，5000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，用酸度為2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉澱蛋白5min,潤旋均勻30s後4°C恆溫離心,轉速12000r/min,離心10min,將上層清液於氮吹儀於40°C吹乾，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻60s後12000r/min，4°C恆溫，離心10min後取10 μ I進樣，空白腎臟組織按同樣方法處理，採用液相色譜-質譜聯用儀按以下條件進行LC-MS/MS:
[0053]色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸0.1 % )乙腈:酸性(甲酸0.1 % )水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2ml/min,柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為350°C ；
[0054]對照品溶液的製備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品
0.01~lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0055]測定法:分別 精密吸取對照品溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質譜聯用儀，測定，即得。
[0056]前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩定7min。
[0057]前述質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對及形成穩定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原兒茶酸 I52.918 — 109.244，補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,內標 326.922 — 192.167,補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0058]測定結果如圖1-4所示，從圖可以看出，沒食子酸和原兒茶酸為口服熱淋清顆粒後腎臟組織中的化學成分。
[0059]二、口服熱淋清顆粒大鼠腎臟組織中沒食子酸和原兒茶酸的含量測定方法的建立
[0060]1.儀器與試藥
[0061]TSQ 04 8社11111超高效液相色譜-質譜聯用儀(河？^:-|^/^5)，包括:三重四級杆質量分析器，ESI離子源，Xcalib μ r工作站，液相部分為Thermo AccelaMPLC,包括:Accela PDA檢測器,Accela自動進樣器，Accelal250輸液泵(美國賽默飛世爾科技有限公司)、十萬分之一電子天平(梅特勒-託利多儀器上海有限公司)、KQ5200E型超聲波清洗(昆明市超聲儀器有限公司)，TGL-16M高速冷凍離心機(長沙邁佳森儀器設備有限公司)，EYELANG-2200型氮氣吹乾儀(日本東京理化器械株式會社)，微量移液槍(德國Eppendorf公司)。
[0062]乙腈(色譜純，美國「天地」試劑公司)、甲醇(色譜純，美國「天地」試劑公司)；水(重蒸水，臨用前製備)；甲酸(色譜純，美國Roe Scientific公司)、乙酸(色譜純，美國 Roe Scientific 公司)；
[0063]沒食子酸、原兒茶酸及巖白菜素對照品(中國藥品生物製品檢定所提供)。
[0064]2.儀器操作條件
[0065]液相色譜條件:PhenomenexKinetexXB_C18 色譜柱(2.1 X 150mm, 1.7 μ m),流動相A為乙腈(含0.1%甲酸)，B為水(含0.1%甲酸)，梯度洗脫:0~3min2%A，3.0~
3.1min2 % A—10 % A, 3.I ~10.0minlO % A, 10.0 ~10.1minlO % -2 % A, 10.1 ~17.0min2% A，流速 0.2mL/min，進樣量為 5 μ L,
[0066]質譜條件:採用ESI離子源；負離子檢出模式；掃描方式為多反應監測方式(MRM);用於定量分析的監測離子見表1。離子源參數:鞘氣流速:40Arb，輔助氣流速:IOArb ;毛細管溫度:350°C ;毛細管電壓:30V ;霧化溫度為350°C ;噴霧電壓:2500V ;掃描頻率:0.1s。
[0067]表1、以SRM模式優化GA、PA、內標(IS)形成穩定子離子所需碰撞能量
[0068]
【權利要求】
1.口服熱淋清顆粒後腎臟組織兩種化學成分的測定方法，其包括以下步驟: (1)測試樣品的製備: (a)取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給予大鼠(體重230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg ； (b)分別在30~360min，後對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中； (c)加入內標巖白菜素母液10μ 1，然後按腎臟組織與沉澱試劑體積比為1:4~8沉澱蛋白，沉澱時間2~5min，渦旋混勻30~60s後，在O~I (TC恆溫條件下以10000~12000r/min離心5~15min (所述的沉澱試劑為乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)混合液並且添加I %~4%酸，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合) (d)將上層液轉移至新空白EP管中，於30~50°C氮氣流吹乾，殘留物用100μ I流動相溶解，潤旋混勻30~60s後,在O~10°C恆溫條件下以10000~12000r/min離心5~15min，取上清液即為供試品溶液； (e)按步驟(b)至 步驟⑷的方法對未服用藥物的動物腎臟組織進行處理，得到空白溶液； (f)對照品溶液的製備:分別精密稱取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~Img,各自加純甲醇定容至IOml,即得三種母液,分別取三種母液適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至所需濃度，即為對照品溶液； (2)LC-MS/MS分析的色譜條件和檢測條件: 色譜柱為反相色譜柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，流速為0.1~0.5mL/min，柱溫為20~40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2000~3000V，霧化溫度為300~500°C，鞘氣壓力為30~50mTorr，輔助氣壓力為5~15mTorr，毛細管溫度為200~400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.05%~0.5 %，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合); (3)測定法:分別精密吸取對照品溶液、空白溶液與供試品溶液5~20μL，注入高效液相色譜-質譜聯用儀，測定，即得。
2.根權利要求1的方法，其中步驟(a)中，通過灌胃給藥方式給大鼠(230~270g)熱淋清顆粒水溶液2~4ml。
3.根權利要求1的方法，其中步驟(b)中，分別在30min，60min，2h，3h，6h後大鼠進行米血。
4.根權利要求1的方法，其中步驟(b)中，將樣品於低速離心機5000r/min離心10min。
5.根權利要求1的方法，其中步驟(c)中，用酸度為2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉澱蛋白5min。
6.根權利要求1的方法，其中步驟(c)中，沉澱蛋白後渦旋均勻30s後4°C恆溫離心，轉速 12000r/min,離心 lOmin。
7.根權利要求1的方法，其中步驟(c)中，使用甲酸:乙酸=2:1體積比混合酸來酸化沉澱試劑。
8.根權利要求1的方法，其中步驟(d)中，將上層清液於氮吹儀於40°C吹乾。
9.根權利要求1的方法，其中: 步驟(d)中，殘留物用100μ I流動相溶解，渦旋混勻60s後12000r/min，4°C恆溫，離心.10min後取10 μ I進樣； 步驟(2)中，色譜柱為C18色譜柱； 步驟(2)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.1% ； 步驟⑵中，流速為0.2ml/min，柱溫為30°C ； 步驟(2)中，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為.350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為300°C ； 步驟(2)中，使用梯度洗脫，洗脫液的變化為:開始時，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相.98%,穩定3min ;接著至第IOmin時,酸性乙腈相線性增加至10%,酸性水溶液相90% ;第.10.1min時，酸性乙腈相改為2%，酸性水溶液相98%，穩定7min ； 步驟⑶中，分別精密吸取對照品溶液、空白溶液與供試品溶液5yL，注入高效液相色譜-質譜聯用儀；和/或 步驟(2)中，質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對及形成穩定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 71V,碰撞壓力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV ；原兒茶酸152.918 — 109.244，補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV ;內標巖白菜素 326.922 — 192.167，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 22eV。
10.根權利要求1的方法，其特徵在於: 取熱淋清顆粒2.0g,加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30~360min後，對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，用酸度為2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉澱蛋白5min,潤旋均勻30s後4°C恆溫離心,轉速12000r/min,離心10min,將上層清液於氮吹儀於40°C吹乾，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻60s後12000r/min，4°C恆溫，離心IOmin後取10μ I進樣，空白腎臟組織按同樣方法處理，採用液相色譜-質譜聯用儀按以下條件進行LC-MS/MS分析: 色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5(%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2ml/min，柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為.350 0C ； 對照品溶液的製備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~.lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度；或者，其特徵在於: 前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2 %，甲酸水溶液相98 %，穩定7min ； 或者，其特徵在於: 前述質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對及形成穩定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞壓力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV,原兒茶酸 152.918 — 109.244,補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,內標 326.922 — 192.167,補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV ； 或者，其特徵在於:所述反相色譜柱是C18色譜柱； 或者，其特徵在於:取熱淋清顆粒0.5~4g,加5~10倍水溶解,通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30~360min，後對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，加入內標巖白菜素10μ 1，然後按1:4~1:8體積比用I~4%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉澱蛋白，沉澱時間2~5min，潤旋混勻30~60s後10000~12000r/min, O~10°C恆溫,離心5~15min,上層液轉移至新空白EP管中於30~50°C氮氣流吹乾，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻30~60s後10000~12000r/min, O~10°C恆溫，離心5~15min後取5~20 μ I進樣，空白血眾按同樣方法處理，採用液 相色譜-質譜聯用儀按以下條件進行LC-MS/MS分析: 色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5(%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.1~0.5mL/min,柱溫為20~40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監測，噴霧電壓為2000~3000V，霧化溫度為300~500°C，鞘氣壓力為30~50mTorr，輔助氣壓力為5~15mTorr，毛細管溫度為200~400°C ； 對照品溶液的製備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度；或者，其特徵在於: 腎臟組織樣品按以下步驟操作: 取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30~360min，後對大鼠進行斷頭處死，解剖並分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，加入內標巖白菜素10 μ I，然後按1:4體積比用2 %酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉澱蛋白，沉澱時間5min,潤旋混勻後12000r/min離心5min,上層液轉移至新空白EP管中於40°C氮氣流吹乾，殘留物用100 μ I流動相溶解，4°C恆溫，12000r/min離心10min後取10 μ I進樣，空白腎臟組織樣品按同樣方法處理； 或者，其特徵在於:色譜柱規格為2.1 X 150mm,填料粒徑為1.7 μ m，以甲酸0.1 %乙腈A:甲酸0.1 %水B為流動相，按以下條件梯度洗脫:0~3min2% A，3.0~3.1min2% A—10% A, 3.I ~10.0minl0% A, 10.0 ~10.1minl0% -2% A, 10.1 ~17.0min2% A ； 或者，其特徵在於:質譜噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為lOmTorr，毛細管溫度為350°C ； 或者，其特徵在於:質譜檢測為多反應監測模式，反應離子對分別為:沒食子酸.169.181 — 125.268，原兒茶酸 152.91 8 — 109.244，內標 326.922 — 192.167。
【文檔編號】G01N30/02GK103983713SQ201410234592
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】周欣, 龔小見, 陳華國, 馬風偉, 趙楊, 梁斌, 楊槐 申請人:貴州威門藥業股份有限公司