青黴菌、固態發酵產纖維素酶及其制柚皮高酯果膠的方法
2023-10-05 23:58:59 3
專利名稱：青黴菌、固態發酵產纖維素酶及其制柚皮高酯果膠的方法
技術領域：
本發明屬於酶學(C12P)技術，具體涉及一株青黴菌、其固態發酵產纖維素酶，及該纖維素酶用於制柚皮高酯果膠的方法。
背景技術：
果膠(Pectin)是一種親水性植物膠，廣泛存在於高等植物的根、莖、葉、果的細胞壁中。果膠主要成分是D-半乳糖醒酸(D-galactuonic acid),其中部分半乳糖醒酸被甲酯化，分子量約在3 18萬之間。商品化果膠有液體果膠和果膠粉，果膠的色澤從乳白色到淡黃褐色，因原料、生產工藝而不同。根據酯化度(DM)不同，果膠分為高甲氧基果膠(酯化度大於50%，相當於甲氧基含量大於7%)和低甲氧基果膠(酯化度小於50%，相當於甲氧基含量小於7%)，後者包括醯胺果膠。果膠具有良好的乳化、增稠、穩定和膠凝作用，在食品、紡織、印染、菸草、冶金等領域得到廣泛的應用。由於果膠具有抗菌、止血、消腫、解毒、止瀉、降血脂、抗輻射等作用，還是一種優良的藥物製劑基質，可用來製造輕瀉劑、止血劑、毒性金屬解毒劑、血漿代用品等，是醫藥和化妝品工業不可缺少的輔料。果膠是人體七大營養素中水溶性膳食纖維的主要成分，隨著功能性多糖的開發研究，果膠作為水溶性膳食纖維，越來越受到研究與加工行業的重視，具有良好的抗腹瀉、抗癌、治療糖尿病和減肥等多種作用。柚為芸香科柑桔屬植物常綠果樹的成熟果實，在我國南方許多地區大量種植。我國柚皮資源豐富，但大部分被丟棄，且造成了環境汙染。柚皮中果膠含量較高，且所含果膠膠凝度高、級別高。因此，從柚皮中提取果膠具有較高的經濟效益和社會效益。從柚皮中提取果膠目前已有商品化生產，也有許多文獻報導，如周盡花報導了通過正交試驗法得到的酸法提取柚皮果膠的工藝條件，果膠得率為14.9%(天然產物研究與開發，2006，18:483-486)， 又如趙梅等報導了採用酸解法提取柚皮低甲氧基果膠的工藝條件，果膠得率為5.51% (食品與藥品，2008，10 (7):29_31)。雖然酸提取法仍是目前最常用的果膠提取方法，但酸提取容易造成環境汙染。因此人們積極探討減少環境汙染的其他提取方法。如離子交換法(孫潤，食品工業科技，1989, (2):40-41 )、微波提取法(Dredycfuss M S，Appl Eneerio Nicobio, 1980, 38 (1):13;M Kratchanova, Carbohydrate Polymers, 2004, 56: 181 185 ;孔湊，鄭州糧食學院學報，2000, 21 (2):11-15)，這些方法都難以實現工業化應用。最常用的果膠的分離方法是乙醇沉澱法。其他分離方法也有報導，如鹽析法(鄧紅，食品科學，2002,23 ( 3 ):57-60 ;張玲華，農牧產品開發，2000，(11):12 14)。乙醇沉澱法生產的果膠色澤淺、灰分含量少、膠凝度高、品質好。雖然乙醇使用量較大，但若對廢乙醇進行回收和循環利用，則可降低生產成本。
發明內容
本發明要解決的技術問題是採用酶法提取柚皮果膠，以減輕酸法提取所造成的環境汙染，同時提取率與酸法接近甚至超過酸法。為了解決上述技術問題，本發明提供了一株青黴菌固態發酵產纖維素酶及用於製備柚皮高酯果膠的新方法。其主要特點為用一株青黴菌進行固態發酵，萃取固態培養物中的纖維素酶，經冷凍乾燥製得纖維素酶粉。用製得的纖維素酶粉提取柚皮果膠，用乙醇沉澱法沉澱酶提取液的果膠，離心後將沉澱乾燥製得果膠成品，經測定其甲氧基含量屬於高酯果膠。該發明提供的柚皮高酯果膠製備方法，其果膠粉的果膠提取率高於目前報導的酸提取法，且減輕酸對環境的汙染。本發明提供一株青黴菌,該菌株為青黴菌sp.) WZUX01,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6370。本發明還提供上述的青黴菌固態發酵產纖維素酶的方法，包括如下步驟:
1)所述菌株青黴菌WZUXOl劃線轉接到PDA斜面培養基上，25 35°C下培養3 6天；
2)以水洗脫步驟I)得到的培養物中的青黴菌，得到孢子懸液，接入滅菌的稻草麩皮培養基，25 35°C下培養5 7天，其中稻草麩皮培養基由如下重量比的成分構成:稻草粉:麩皮:(NH4)2SO4:水=4 36:8 48:0 16:24 80 ；
3)步驟2)得到的固態培養物加入蒸餾水搗碎，35 45°C恆溫浸提2 10h，過濾，得酶液，經冷凍乾燥即得纖維素酶。優選地，上述恆溫浸提2 10h後，置於4°C下浸泡24 h。優選地，上述步驟2)中所述孢子懸液的孢子量為I X IO12IX IO12個/mL，所述孢子懸液的接種量:孢子懸液和稻草麩皮培養基的體積重量比為I mL:Γ3 g，優選為1:2。優選地，步驟2)所述稻草麩皮培養基由如下重量比的成分構成:稻草粉:麩皮:(NH4)2SO4:水=8:32:8:52。`上述的青黴菌固態發酵產纖維素酶的方法得到的纖維素酶。本發明還提供上述的纖維素酶用於製備柚皮高酯果膠的方法，包括如下步驟:
1)將柚皮烘乾、粉碎，得柚皮粉；
2)將柚皮粉加入酶反應器內，加入緩衝液，再加入所述纖維素酶進行提取，然後離心得果膠液；
3)調節步驟2)所得果膠液的pH為5 9，加入乙醇，沉澱，離心得沉澱物，乾燥，得果膠。沉澱時間優選為2 32h。優選地，步驟2)中所述緩衝液的pH值為5 7，柚皮粉和所述緩衝液的重量體積比為5 20 g: 100 mL，所述緩衝液更優選為pH值為7的HAC/NaAC緩衝液。優選地，步驟2)中所述纖維素酶的加入重量為所述柚皮粉重量的1°/Γ3%。優選地，步驟2)中提取的條件為:在35 45°C下提取24 48 h。優選地，步驟3)中調節步驟2)所得果膠液的pH為5 9，加入乙醇至其在果膠液中的體積百分比濃度為6(Γ80%。本發明能夠達到如下效果 廣黴鎮QPen i c i 11 i Utn sp.)WZUX01固態發酵產纖維素酶的能力為每克固態培養物產CMC酶活力為8210.667U，所製得的纖維素酶粉的CMC酶活力為300U/mg ;纖維素酶粉提取柚皮果膠的柚皮粉果膠提取率為19.30%,乙醇沉澱果膠的果膠沉澱率為80.23%，柚皮粉的果膠成品提取率為15.48%，所得果膠成品的甲氧基含量可達30.48%，屬於高酯果膠。
圖1是梟黴^QPeniciIIium sp.) WZUXOl固態發酵產纖維素酶曲線。圖2是溫度對纖維素酶粉CMC酶活力影響曲線。圖3是pH對纖維素酶粉CMC酶活力影響曲線。菌株保藏
本發明的青黴sp.)WZUX01，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6370，保藏日期為2012年7月20日。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好地理解本發明並能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。實施例一 廣黴霞iPenicillium sp.) WZUXOl固態發酵產纖維素酶 菌株
著纖QPenicillium sp.)WZUX01，由溫州大學生命與環境科學學院自溫州茶山稻杆堆肥土壤中分離獲得，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC N0.6370。(2)培養基
土豆培養基(PDA培養基):土豆汁IOOOmL,瓊脂20g，pH自然。土豆汁的製備:取200g新鮮去皮土豆，切成小塊，加IOOOmL蒸餾水煮Ih後，以紗布過濾，用蒸餾水補至1000mL。稻草麩皮培養基各組分的重量比為:稻草粉:麩皮:(NH4)2SO4:水=4 36:8 48:0 16:24 80，pH 自然。(3)方法
保藏菌株青黴菌WZUX01劃線轉接到PDA斜面培養基上，30°C培養4天，將IOmL的無菌水分多次加入已長滿黴菌的試管中，振蕩製得孢子懸液，測定孢子懸液的孢子數量，將孢子懸液接入已滅菌的稻草麩皮培養基，攪拌均勻，在25-35°C下培養4天，每天攪拌培養基I至2次。稱取得到的固態培養物10g，加入90mL的蒸餾水搗碎，40°C、150r/min恆溫水浴中振蕩浸提4h，置於冰箱中(4°C)浸泡24 h，紗布過濾得粗酶液，4000rpm下離心15分種，得上清液(酶液)，測定CMC酶活力。CMC酶活力測定方法:吸取適當稀釋後的酶液0.5mL於試管中，加入含0.5%CMC_Na的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(0.05mol.L—1，pH4.4) 1.5 mL，然後在50°C水浴中反應30 min後,立即在每試管內加1.5mLDNS試劑,再在沸水中煮5 min後,立即用冷水冷卻，定容至25mL,在520nm處測定OD值，從標準曲線求得其還原糖含量。CMC酶活力單位定義為每分鐘內水解纖維素生成I μ g還原糖量的酶量。以100°C水浴中滅活IOmin的酶液為空白對照(吳海龍等，科技通報，2008，24 (6):769 776)。孢子懸液的孢子數量採用血球計數板法測定。稻草麩皮培養基配方和培養條件的設定及結果見下表I。各實驗組稻草麩皮培養基總量均為20g，孢子懸液的數量為I X IO12 9 X 1012/mL。表I稻草麩皮培養基配方 和培養條件的設定及結果
賣驗組丨稻草:麩皮=(NH4)aSO4:水(W:W:W:W)I溫度CC )|CMC酶活力(U/g)
權利要求
1.株青黴菌，其特徵在於，該菌株為青黴菌(/^wici77iw sp.)WZUX01,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6370。
2.權利要求1所述的青黴菌固態發酵產纖維素酶的方法，其特徵在於，包括如下步驟: 1)所述菌株青黴菌WZUXOl劃線轉接到PDA斜面培養基上，25 35°C下培養3 6天； 2)以水洗脫步驟I)得到的培養物中的青黴菌，得到孢子懸液，接入滅菌的稻草麩皮培養基，25 35°C下培養5 7天，其中稻草麩皮培養基由如下重量比的成分構成:稻草粉:麩皮:(NH4)2SO4:水=4 36:8 48:0 16:24 80 ； 3)步驟2)得到的固態培養物加入蒸餾水搗碎，35^450C恆溫浸提2 10h，過濾得酶液，經冷凍乾燥得纖維素酶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述孢子懸液的孢子量為IX ΙΟ12、X IO12個/mL，所述孢子懸液的接種量:孢子懸液和稻草麩皮培養基的體積重量比為 ImL:1 3g。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟2)所述稻草麩皮培養基由如下重量比的成分構成:稻草粉:麩皮:(NH4) 2S04:水=8:32:8:52。
5.權利要求2 4任一項所述的青黴菌固態發酵產纖維素酶的方法得到的纖維素酶。
6.權利要求5所述的纖維素酶用於製備柚皮高酯果膠的方法，其特徵在於，包括如下步驟: 1)將柚皮烘乾、粉碎，得柚皮粉； 2)將柚皮粉加入酶反應器內，加入緩衝液，再加入所述纖維素酶進行提取，然後離心得果膠液； 3)調節步驟2)所得果膠液的pH為5 9，加入乙醇，沉澱，離心，沉澱物乾燥，得果膠。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述緩衝液的pH值為5 7，柚皮粉和所述緩衝液的重量體積比為5 20g: 100mL。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述纖維素酶的加入重量為所述柚皮粉重量的1°/Γ3%。
9.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟2)中提取的條件為:在35 45°C下提取24 48 h0
10.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟3)中調節步驟2)所得果膠液的pH為5 9，加入乙醇至其在果膠液中的體積百分比濃度為6(Γ80%。
全文摘要
本發明公開了一株青黴菌、固態發酵產纖維素酶及其制柚皮高酯果膠的方法。該青黴菌菌株為青黴菌(Penicillium sp.)WZUX01，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.6370。該青黴菌(Penicillium sp.)WZUX01固態發酵產纖維素酶，該纖維素酶可用於製備柚皮高酯果膠，以此方法製得的柚皮果膠中甲氧基含量可達30.48%。
文檔編號C12R1/80GK103087922SQ20121042018
公開日2013年5月8日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者周茂洪, 趙肖為 申請人:溫州大學