提高棉花纖維品質的GbAnn9基因及其應用的製作方法

2023-10-06 09:25:24 1

專利名稱：提高棉花纖維品質的GbAnn9基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠提高棉花纖維品質的基因及其編碼的多肽。
背景技術：
在棉花育種中，提高棉花纖維的質量是棉花育種的長期目標之一。而提高棉花纖維的長度是提高棉花質量的一個重要方面。棉纖維是從胚珠外表皮細胞發育而來的單細胞無分支的結構。纖維的發育歷經纖維起始、纖維伸長、次生壁增厚及脫水成熟四個互有重疊的階段，整個發育過程約需50-60 天。相對於模式植物擬南芥的表皮毛和根毛髮育的研究，棉纖維的起始發育機理不清楚。儘管研究者證實例如陳曉亞等有關GaMyl^基因的研究以及Dermis實驗室有關GhMyb25基因的研究等證實上述基因具有用於棉花纖維品質的改良潛力，但是目前還沒有確切的轉基因棉花的數據。因此，本領域迫切需要開發新的提高纖維品質基因。由於棉纖維發育是一個由基因時序控制的複雜過程，找出關鍵基因將為利用基因工程技術改良棉纖維品質奠定良好的理論基礎。而運用分子生物學手段從海島棉中分離提高纖維品質基因，採用分子育種手段進行纖維品質育種是提高棉花纖維品質的重要途徑。膜聯蛋白(ANNEXIN)是一類依賴鈣離子的磷脂結合蛋白家族。迄今為止已經發現超過1000個膜聯蛋白亞家族成員，這些膜聯蛋白廣泛分布在動植物的各種組織和細胞之中。膜聯蛋白在進化上較為保守，由於膜聯蛋白具備與鈣離子結合能力，因此膜聯蛋白能夠參與一系列的依賴於鈣離子的膜性生物學活動。現有的研究證明，鈣離子濃度的增加能夠促進植物花粉管的伸長、根尖的發育以及棉花纖維的伸長作用。因此，提供能夠在棉花纖維組織中特異表達膜聯蛋白將有助於提高棉花的品質。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的能夠提高棉花纖維長度的基因，並得到所述基因表達的蛋白產物。本發明首次採用分子克隆方法從構建的海島棉cDNA文庫中分離獲得了新的 (ΛΑηη9基因，並且通過實驗證實了它具有高提高纖維品質的功能，達到了發明目的。本發明包括以下內容1、提供了一種新的分離出的(ΛΑηη9蛋白質多肽，包含具有SEQ ID NO :2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO :2胺基酸序列的多肽；(b)將 SEQ ID NO :2胺基酸序列經過一個或多個(較佳地1-20個)胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高纖維品質功能的(ΛΑηη9蛋白質活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了編碼上述多肽的多核苷酸，選自(a)編碼上述(ΛΑηη9蛋白質多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO :1中46-987位的序列；(b)具有SEQID NO :1中1-600位的序列。3、提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。4、提供了製備上述(ΛΑηη9蛋白質多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和(ΛΑηη9蛋白質多肽的用途，即，在培育提高棉花纖維長度的棉花品種方面的應用。6、提供了一種提高棉花纖維品質的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的GbArm9選自下組(a)具有SEQ ID NO 2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高纖維品質的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使(ΛΑηη9基因編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入(ΛΑηη9基因的DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。在本發明中，術語「(ΛΑηη9蛋白質」、「(ΛΑηη9多肽」或「提高纖維品質蛋白」可互換使用，都指具有提高纖維品質蛋白(ΛΑηη9胺基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的(ΛΑηη9蛋白質。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，「分離的(ΛΑηη9蛋白或多肽」是指(ΛΑηη9多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化(ΛΑηη9蛋白質。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主， 本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括(ΛΑηη9蛋白質的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、 「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然(ΛΑηη9蛋白質相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽， 或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據本文所述，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。在本發明中，術語「 (ΛΑηη9多肽」指具有提高纖維長度的SEQ ID Ν0.2序列的多肽。該術語還包括具有與(ΛΑηη9蛋白質相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個 (通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中， 用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和 /或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括(ΛΑηη9蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹程度條件下能與(AArm9DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含(ΛΑηη9多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了 (ΛΑηη9多肽的可溶性片段。通常，該片段具有(ΛΑηη9多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約 80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。發明還提供(ΛΑηη9蛋白質或多肽的類似物。這些類似物與天然(ΛΑηη9多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。 這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到。在本發明中，「(ΛΑηη9蛋白質保守性變異多肽」指與SEQ ID NO 2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。表 權利要求
1.一種分離的(ΛΑηη9蛋白質多肽，其特徵為包含具有SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.權利要求1所述的多肽，所述保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一個或多個胺基酸殘基取代、缺失或添加而形成的，且具有增加棉花纖維的長度或提高棉花纖維強度的多肽。
3.權利要求1或2所述的多肽在提高棉花纖維長度和強度方面的功能與應用。
4.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，包含(a)編碼權利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)與(a)互補的多核苷酸。
5.權利要求4所述的多核苷酸，其特徵在於，其序列選自(a)具有SEQID NO :1中46-987位的序列；或(b)具有SEQID NO :1中1-600位的序列。
6.權利要求4或5所述的多核苷酸在提高棉花纖維長度和強度方面的功能與應用。
7.一種載體，其特徵在於含有權利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於含有權利要求7所述的載體。
9.一種具有(ΛΑηη9蛋白質活性的多肽的製備方法，其特徵在於包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求8所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有(ΛΑηη9蛋白質活性的多肽。
10.一種提高棉花植物纖維品質的方法，包括(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有權利要求4或5所述的多核苷酸；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使(ΛΑηη9蛋白質DNA 編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入(ΛΑηη9蛋白質DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發明提供了一種新的提高棉花纖維品質的GbAnn9基因及其編碼的GbAnn9蛋白質，本發明還提供了經重組技術產生這種GbAnn9蛋白質的方法，以及GbAnn9基因和GbAnn9蛋白質在提高棉花纖維長度和強度方面的功能與應用。
文檔編號C12N1/15GK102286087SQ201110253458
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者左開井, 王勁, 陳繼軍, 黃逸群 申請人:左開井, 王勁