團頭魴與翹嘴紅鮊遠緣雜交的方法

2023-10-05 17:24:04 1

專利名稱：：團頭魴與翹嘴紅鮊遠緣雜交的方法
技術領域：
：本發明涉及一種魚類雜交方法，尤其涉及一種鯉科舶亞科魚類中的遠緣雜交方法。
背景技術：
：雜交技術是改良魚類性狀常用的方法，親緣關係在種間或種間以上的雜交一般稱為遠緣雜交。遠緣雜交作為一種重要的魚類遺傳育種和性狀改良方法，它可以整合整套外源基因，從而改變雜交後代基因的表達調控，使得雜交後代可能在生長速度、抗逆性、抗病性以及肉質等方面表現出雜種優勢。如紅鯽與湘江野鯉的屬間遠緣雜交形成的雜交後代具有生長速度快、肉質鮮嫩、抗病力強、存活率高等優點；紅鯽與團頭魴的亞科間遠緣雜交形成的雜交後代除具有鯽鯉雜交魚以上優點外，體背還明顯增高，外形優美，具有良好的經濟效應。如何利用和改進現有的生物學技術和方法來對現有的自然魚種進行遺傳改良以獲得形狀更為優良、品種更加豐富和對遺傳研究更有意義的新型多倍體魚，就成為本領域技術人員長期面臨和需要解決的問題。
發明內容本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種受精率高、孵化率高、後代性狀優良、對遺傳育種具有重要意義的團頭魴與翹嘴紅舶遠緣雜交的方法。為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種團頭魴與翹嘴紅舶遠緣雜交的方法，包括以下步驟首先挑選性腺成熟、無病無傷、體徵良好的雌性團頭魴(母本親魚)和雄性翹嘴紅舶(父本親魚)作為親魚進行專池培育，然後在繁殖季節對所述親魚進行人工催產，選擇催產效果良好的親魚進行人工幹法授精，授精完成後的胚胎進行培養皿靜水孵化，對孵化完成後的魚苗進行飼養，再對飼養後的實驗魚進行檢測、篩分，獲得團頭魴與翹嘴紅舶雜交三倍體魚和二倍體魚。上述團頭魴與翹嘴紅舶遠緣雜交的方法，具體包括以下步驟1)親魚的選擇和培育在繁殖期前56個月，挑選體重lkg以上、性成熟特徵明顯、體徵良好的雌性團頭魴和雄性翹嘴紅舶作為遠緣雜交的親魚進行專池培育，在繁殖期前一個月左右每隔23天流水剌激一次，以促進所述親魚的性腺發育成熟；體徵良好的親魚一般表現為體型好、體色鮮豔、體質健壯、無病無傷；2)人工催產在所述繁殖期當年的5月下旬至6月下旬，水溫穩定在23°C25°C時，為所述親魚注射黃體素釋放激素類似物(LRH-A)與絨毛膜促性腺激素(HCG)的混合催產劑進行催產，先注射母本親魚，所述LRH-A的用量為lOiig/kg，HCG的用量為600IU/kg;45h後再注射父本親魚，父本親魚的注射劑量減半；注射完畢後按1:(1.52.5)的數量比將母、父本親魚放入同一水面面積為80m2左右的產卵池中，然後根據水情及時向池中衝水，在產卵前34h注入一定水量後，停止注水，讓所述親魚在靜水中催產，直至其開始順利產卵和產精；注射時優選採用胸鰭基部無鱗處腹腔一針注射法，以提高親魚的存活率；3)授精孵化挑選產卵量大、產卵質量高的母本親魚和產精量大的父本親魚進行人工幹法授精，受精卵置於水溫為23°C24t:的培養皿中進行靜水孵化；4)飼養魚苗全部孵出後，先於網箱中培育12天，待魚苗出現腰點、開始平遊後將魚苗轉入預先培肥的池塘中飼養，34天後潑灑豆漿，每天潑灑23次，潑灑時力求細、勻，實驗魚長成後經檢測、篩分獲得團頭魴與翹嘴紅舶雜交三倍體魚和二倍體魚。上述團頭魴與翹嘴紅舶遠緣雜交的方法中，對所述長成後的實驗魚進行檢測的具體方法是指利用流式細胞DNA含量測定法和外周血細胞培養的染色體倍性檢測方法對實驗魚進行DNA含量和染色體數目的檢測。本技術方案中用流式細胞DNA含量測定法和外周血細胞培養的染色體倍性檢測方法來檢測實驗魚具有不殺死實驗魚、準確、快速、試驗結果清晰的優點。上述技術方案中的團頭魴(Megalobramaamblyc印hala)屬於鯉科、舶亞科，魴屬中的二倍體魚(2n=48)，體高側扁，尾柄高而短，體型優美，草食性，生長速度快，肉質細嫩、腴美，脂肪豐富；翹嘴紅魚白(ErythroculterilishaeformisBleeker)隸屬於鯉科，舶亞科，舶屬中的二倍體魚(2n=48)，為大型淡水經濟魚類，生長迅速，耐低氧，適應性與抗病力極強，常年攝食(含嚴冬季節)，肉質潔白鮮嫩，營養價值高，深受人們的青睞。本發明通過反覆實驗最終選擇團頭魴為母本，翹嘴紅舶為父本進行遠緣雜交獲得了具備多種雜交優勢的新型三倍體、二倍體雜交魚類。相比同類雜交試驗，其受精率和孵化率得到了顯著提高。雜交後代整合了父母本體形優美、生長迅速、肉質細嫩、營養價值高等優良性狀，並且成功地解決了遠緣雜交後代不能存活或存活率較低的問題。此外，本發明方法獲得的新型多倍體雜交魚在魚類多倍體育種和生物進化方面也具有重要意義。圖1為本發明實施例中團頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)後代中二倍體魚的外形照片；圖2為本發明實施例中團頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)後代中二倍體魚的染色體圖(2n=48);圖3為本發明實施例中團頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)後代中三倍體魚的外形照片；圖4為本發明實施例中團頭魴(早)X翹嘴紅舶(cP後代中三倍體魚的染色體圖(3n=72);圖5為本發明實施例中測定的團頭魴的DNA含量圖；圖6為本發明實施例中測定的團頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)後代中二倍體魚的DNA含量圖；圖7為本發明實施例中測定的團頭魴(早)X翹嘴紅舶(^)後代中三倍體魚的DNA含量圖。具體實施方式實施例在繁殖期前56個月，挑選體重lkg以上、性成熟特徵明顯、體型好、體色鮮豔、體質健壯、無病無傷的雌性團頭魴和雄性翹嘴紅舶作為遠緣雜交的親魚進行專池培育，合理投餵飼料，特別是在繁殖期前一個月左右每隔23天流水剌激一次，以促進親魚性腺良好發育。在繁殖期當年的5月下旬至6月下旬，當水溫穩定在2325。C時，挑選體徵良好、性腺發育良好的上述親魚注射LRH-A與HCG的混合催產劑進行催產，先注射雌性團頭魴，LRH-A的用量為10iig/kg，HCG的用量為600IU/kg;45h後再注射雄性翹嘴紅舶，劑量減半；注射完畢後立即按l:2左右的數量比將母、父本親魚放入同一水面面積為80rrf左右的產卵池中，以增加母、父本親魚的接觸機會，提高產卵率。然後據水情及時向池中衝水，尤其在產卵前34h，注入一定水量後，終止注水，讓魚在靜水中催產，直至其開始順利產卵和產精。同時，水面吊一紗窗網片，以檢測親魚的發情產卵情況。注射時採用胸鰭基部無鱗處腹腔一針注射法，以提高親魚的存活率。當發現親魚在產卵池中呈"螺旋狀"追逐、紗窗網片上沾有適量卵粒後，開始拉網打撈親魚進行檢測(注意要用軟質網，操作要輕，水中檢測)，將催產效果良好的雌性團頭魴與雄性翹嘴紅舶進行人工幹法授精，把精卵擠入乾淨的瓷盆中，用乾淨的羽毛迅速不停地攪拌23min，然後迅速用羽毛將受精卵均勻鋪於事先準備好的裝有少量水的乾淨培養皿中，密度控制在約8001000粒/培養皿，當受精卵粘於培養皿上後用清水輕輕漂洗一遍，然後馬上放入室溫為23°C24°C的孵化房中加滿清水靜水孵化，孵化期間每天換水23次。魚苗全部孵出後，先於網箱中培育12天，待魚苗出現腰點、開始平遊後將魚苗轉入預先培肥的池塘中飼養，34天後潑灑豆漿，每天潑灑23次，力求細、勻，直至魚苗長到能正常攝食。孵化期間，統計胚胎的受精率和孵化率。團頭魴與翹嘴紅舶遠緣雜交魚的受精率和孵化率分別為78%和62%，相比同類雜交試驗，其受精率和孵化率得到了顯著地提高。魚苗飼養34個月後，隨即抽樣、測量分析其生物學形狀相關數據，並分別與團頭魴和翹嘴紅舶成體魚的各項已知數據進行比較，結果如表1所示表1:團頭魴、翹嘴紅舶及其雜交後代的可數性狀比較(單位片或條)tableseeoriginaldocumentpage5註上表中大寫的羅馬數字代表硬棘條的數目，阿拉伯數字代表鰭條的數目。上述可數性狀相關數據表明兩種雜交後代魚在外型上均基本整合了其父、母本(團頭魴與翹嘴紅舶)的特徵，如二倍體魴舶與三倍體魴舶的側線鱗數分別為6468、5661，介於團頭魴的4952和翹嘴紅舶的8092之間；有的則偏父本遺傳，如側線上鱗片數分別為1315、1415，均超過了其母本9IO的範圍，而靠近父本的1620。另外，這兩種雜交後代魚的外形照片如圖l(二倍體)和圖3(三倍體)所示，從外形上比較可以發現，兩種雜交後代魚的頭部均與團頭魴相似，而二倍體魴舶的體高、尾鰭偏像於翹嘴紅舶，三倍體魴舶的體高、尾鰭則偏像於團頭魴，體形優美，肉質鮮嫩。這些均說明三倍體魴舶和二倍體魴舶是團頭魴與翹嘴紅舶的雜交後代。再用外周血細胞培養的染色體倍性檢測方法對三倍體和二倍體雜交魚的體細胞染色體數目進行抽樣檢測，發現團頭魴與翹嘴紅舶雜交後代中體背較矮者為二倍體(2n=48)，體背較高者為三倍體(3n=72)，二者的染色體圖分別如圖2和圖4所示。同時，以普通團頭魴為參照，用流式細胞儀測定二倍體魴舶和三倍體魴舶紅細胞中的DNA含量，結果分別如圖5、6、7所示。分析圖中數據可知，團頭魴、二倍體魴舶和三倍體魴舶的DNA平均含量分別為74.55、72.76和107.78，二倍體魴舶與對照團頭魴的DNA平均含量比值為0.976，該比值與預計的1:l理論比值間無顯著差異；三倍體魴舶與對照團頭魴的DNA平均含量比值為1.446，該比值與預計的1.5:1理論比值間無顯著差異。這些試驗結果與外周血細胞培養的染色體倍性檢測方法獲得的結果是一致的。上述實施例中外周血細胞培養的染色體倍性檢測方法操作步驟為1)在超淨工作檯中配製培養基，100ml培養基含以下成分84mlRPMH640(1640培養液)，15ml小牛血清，2支植物血凝素(PHA)，lml0.1%肝素鈉，以7.5%NaHC03(無菌)或1NHC1調pH至7.27.4;2)用注射器吸取少量滅菌肝素鈉溶液，於用碘酒消毒後的實驗魚尾部靜脈取血；3)按每10ml培養液中加入約0.2ml抗凝血的標準將抗凝血加入培養液中，於24°C5%的二氧化碳濃度的培養箱中培養6872h，培養期間，定期輕搖勻，以使細胞充分接觸培養基；4)終止培養前24h，在培養液中用lml注射器滴加入10yg/ml的秋水仙鹼，使終濃度為0.050.07iig/ml。以上步驟均需無菌操作。上述實施例中染色體製備步驟為1)將培養物全部轉入潔淨的10ml離心管中，以1000rpm離心5min，棄上清液；2)向離心管中加入低滲液9ml，混勻，低滲2530min;3)加入lml固定液，輕輕混勻後1000rpm離心5min，棄上清液；4)加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20min後1000rpm離心5min，棄上清液；5)重複步驟4一次；6)視最後細胞數量多少加入適量固定液製成細胞懸液(一般為12ml)後，吸取細胞懸液自2030cm高處滴片，輕吹散，空氣中自然乾燥；7)Giemsa染液染色2040min，細水流衝洗載玻片背面去除染液，氣幹後鏡檢、拍照。上述實施例中流式細胞DNA含量測定法步驟為用經肝素潤溼的一次性注射器從魚尾靜脈血管採血約0.2mL，注入裝有0.8%生理鹽水的E卯endorf管中，在血液和生理鹽水混合液中力口入lmL細胞核提取液DAPI-A(nucleiextractionsolution,德國PartecGmbh提供)，處理時間1015min;樣品經過20ym尼龍濾器(德國PartecGmbH提供)過濾；DNA染色液(DAPI-B，德國PartecGmbH提供)靜置於暗處染色樣品約510min，然後上機檢測。本實施例方法獲得的三倍體、二倍體雜交魚，不僅整合了父母本親魚的多項優良性狀，還顯著提高了遠緣雜交的受精率和孵化率，在生物進化研究和魚類遺傳育種方面具有重要的生物學意義。權利要求一種團頭魴與翹嘴紅鮊遠緣雜交的方法，包括以下步驟首先挑選性腺成熟、無病無傷、體徵良好的雌性團頭魴和雄性翹嘴紅鮊作為親魚進行專池培育，然後在繁殖季節對所述親魚進行人工催產，選擇催產效果良好的親魚進行人工幹法授精，授精完成後的胚胎進行培養皿靜水孵化，對孵化完成後的魚苗進行飼養，再對飼養後的實驗魚進行檢測、篩分，獲得團頭魴與翹嘴紅鮊雜交三倍體魚和二倍體魚。2.根據權利要求1所述的團頭魴與翹嘴紅舶遠緣雜交的方法，其特徵在於，所述方法具體包括以下步驟1)親魚的選擇和培育在繁殖期前56個月，挑選體重lkg以上、性成熟特徵明顯、體徵良好的雌性團頭魴和雄性翹嘴紅舶作為遠緣雜交的親魚進行專池培育，在繁殖期前一個月每隔23天流水剌激一次，以促進所述親魚的性腺發育成熟；2)人工催產在所述繁殖期當年的5月下旬至6月下旬，水溫穩定在23°C25t:時，為所述親魚注射黃體素釋放激素類似物與絨毛膜促性腺激素的混合催產劑進行催產，先注射母本親魚，所述黃體素釋放激素類似物的用量為10i!g/kg，絨毛膜促性腺激素的用量為600IU/kg;45h後再注射父本親魚，父本親魚的注射劑量減半；注射完畢後按l:(1.52.5)的數量比將母、父本親魚放入同一水面面積為80m2的產卵池中，然後根據水情及時向池中衝水，在產卵前34h注入水量後，停止注水，讓所述親魚在靜水中催產，直至其開始順利產卵和產精；3)授精孵化挑選產卵量大、產卵質量高的母本親魚和產精量大的父本親魚進行人工幹法授精，受精卵置於水溫為23°C24t:的培養皿中進行靜水孵化；4)飼養魚苗全部孵出後，先於網箱中培育12天，待魚苗出現腰點、開始平遊後將魚苗轉入預先培肥的池塘中飼養，34天後潑灑豆漿，每天潑灑23次，實驗魚長成後經檢測、篩分獲得團頭魴與翹嘴紅鉑雜交三倍體魚和二倍體魚。3.根據權利要求2所述的團頭魴與翹嘴紅舶遠緣雜交的方法，其特徵在於對所述長成後的實驗魚進行檢測的具體方法是指利用流式細胞DNA含量測定法和外周血細胞培養的染色體倍性檢測方法對實驗魚進行DNA含量和染色體數目的檢測。全文摘要本發明公開了一種團頭魴與翹嘴紅鮊遠緣雜交方法，包括以下步驟首先挑選性腺成熟、無病無傷、體徵良好的雌性團頭魴和雄性翹嘴紅鮊作為親魚進行專池培育，然後在繁殖季節對親魚進行人工催產，選擇催產效果好的親魚進行人工幹法授精，授精完成後的胚胎進行培養皿靜水孵化，對孵化完成後的魚苗進行飼養，再用流式細胞DNA含量測定法和外周血細胞培養的染色體倍性檢測方法對飼養後的實驗魚進行檢測，獲得團頭魴與翹嘴紅鮊雜交形成的三倍體魚和二倍體魚。本發明的遠緣雜交方法不僅獲得了性狀改善的二倍體和三倍體魚，而且顯著提高了遠緣後代的受精率和孵化率，開闢了一種生產改良二倍體和三倍體魚的新途徑，在魚類遺傳育種方面具有重要生物學意義。文檔編號A01K61/00GK101720698SQ20091022715公開日2010年6月9日申請日期2009年12月9日優先權日2009年12月9日發明者何偉國,劉少軍,劉筠,張純,羅凱坤,肖軍,趙如榕,陶敏申請人:湖南師範大學