共軛亞油酸在製備治療阿爾茨海默病藥物中的應用的製作方法
2023-10-06 05:24:59 1
專利名稱：共軛亞油酸在製備治療阿爾茨海默病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及共軛亞油酸的新用途。
背景技術：
共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是一組天然存在於牛 肉、奶酪和乳脂中的多不飽和脂肪酸，是亞油酸(Linoleicacid，LA)的 幾何異構體和位置異構體。近十年來大量的科學研究證明，CLA具 有抗腫瘤、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、提高免疫力、提高骨骼密度、 防治糖尿病等多種重要生理功能，引起了人們的極大關注。然而，在 抗阿爾茨海默氏症方面的功能和機制尚未見公開報導。
發明內容
本發明的目的是提供共軛亞油酸在製備治療阿爾茨海默病的藥 物中的應用。
本發明通過嚴格的藥理學實驗證實，共軛亞油酸能夠降低 BACE1蛋白表達，增加胞外具有神經營養作用的sAPPa (可溶性澱 粉樣前體蛋白a畫secretase form of soluble amyloid precursor protein)的 分泌；實驗證實CLA的這一作用是通過激活PPRAY(過氧化物酶體增 殖蛋白、激活受體y ， peroxisome proliferators activated receptor gama)而 實現的，即CLA作為PPRAy的激動劑或激活因子，抑制PPRAY下 遊靶基因BACEl的表達活性，從而調節澱粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)的代謝，促進APP經a分泌酶所介導的途徑水解，解除A(3的細胞毒性，對阿爾茨海默病的預防和治療具有重要 的應用價值。
共軛亞油酸(含98% c9,tlO-CLA和tl9,c12-CLA單體)，其結構
式如式(I )所示
formula see original document page 4(I)
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明現已證實，CLA在不影響APP表達的前提下，具有調節 APP水解途徑、抑制卩分泌酶的表達和營養神經細胞的作用，其天然 產物、對人體無毒、副作用低的特性，可用於製備抗阿爾茨海默氏症 的藥物，應用前景廣闊。
圖1為CLA對APP mRNA轉錄和蛋白質表達水平的影響。A. RT-PCR 檢測CLA對APP mRNA轉錄水平的影響；B. Western blot分析 CLA對APP蛋白質表達水平的影響。
圖2為Western blot分析CLA對B ACE 1蛋白質表達水平的影響。 *P<0.01; **P0.05， n=4。
圖3為ELISA檢測CLA對胞夕卜sAPPa分泌的影響。*P<0.01; **P0.05， n=3。
圖4為siRNA技術分析CLA對SH-SY5Y細胞中PPARY的激活作用。*PO.Ol， **P<0.05， n=3。 圖5為PPARY siRNA分析CLA對BACEl表達水平和胞夕卜sAPPa分泌的影響。
A. Western blot分析PPARy基因活性對BACE 1蛋白水平的表達的影響 (*P0.05， n=4)。 B.ELISA檢湖UPPARy基因活性對sAPPa 分泌的影響(*P<0.01; **P<0.05,n=3)。
具體實施例方式
實施例1 CLA對APP的表達水平沒有顯著影響
為了考察CLA對APP表達的影響，我們分別在轉錄水平和蛋白 質表達水平兩個方面進行。
採用半定量RT-RCR方法，檢測了 APP mRNA的轉錄水平。所 用引物由上海生工公司合成，APP上遊引物序列為5，-CACCACAGA GTCTGTGGAAGA-3;下遊引物序列為5，-AGGTGTCTGAGATACTT GT-3'。卩-actin上遊引物序列為5'-GCAATGCCTGGGTACATGGTG& 3'，下遊引物序列為5'-GTCGTACCACAGGCATTGTGATG&3'。
細胞接種於6孔板，每孔細胞3xlS個，培養過夜後，加入CLA， 處理細胞48 h，用TriZol試齊l」(Invitrogen公司產品)提取RNA。常規方 法進行逆轉錄。PCR擴增程序為94°C變性4 min後，94°C變性l min ， 51。C退火30sec， 72。C延伸l min， 30個循環，最後72。C延伸10 min。 PCR產物在1.5n/。的瓊脂糖凝膠中電泳，美國UVP公司(GDS8000) 凝膠成像系統觀察、拍照並以Labwork4.5軟體分析圖像。以J3-actin作 為內參，通過電泳條帶密度與(3-actin條帶密度的比值進行灰度定量分 析。
用0 80 pmol/L CLA處理SH-SY5Y細胞48小時後，可見APP mRNA轉錄水平未發生明顯變化(圖lA)。採用Westem Blot方法分析APP蛋白質表達水平的變化。用上述方 法處理細胞後，收集細胞並提取細胞總蛋白加入40 ^L裂解液(50 mmol/L Tris-HCl， 150 mmol/L NaCl， 0.02% NaN3， 0.1% SDS， 1% NP-40，0.5。/。去氧膽酸鈉，1 mmol/LEDTA)，4 ^L蛋白酶抑制劑Protease Inhibitor Cocktail,於冰上保溫20 min，然後在4。C下12000 rpm離心 30min，上清轉移至新EP管中，以BCA法測定蛋白質濃度。
取50 lag蛋白質在10。/。SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳分離，90 V、 90min溼法轉移至PVDF膜上。常規方法進行Western blot:卩-actin 為內參，檢測APP蛋白質，ECL化學發光試劑顯色，X-光片放射自顯 影。以目的片段與(3-actin的光密度比值進行灰度分析。
結果見圖1B，在0 80pmol/LCLA範圍內，APP蛋白質的表達 未見明顯變化。與RT-RCR的結果一致，表明CLA對APP無論是在 轉錄水平還是蛋白質表達水平均未產生影響。
實施例2 CLA可抑制BACE1蛋白質表達
BACE1即卩分泌酶，是A卩的限速酶，減少或降低其表達或活性， 有助於控制Ap的產生。我們採用WestemBlot方法檢測了BACEl蛋白 質表達水平，實驗方法同上， 一抗採用鼠抗人BACE1。隨著CLA濃 度的增加，BACE1蛋白質的表達逐漸減少，在40和60 pmol/L時達到 最低，但在80 pmol/L時又有所升高(圖2)。
實施例3 CLA可增加胞外sAPPa的分泌
胞外sAPPa含量的變化預示著胞內APP水解途徑的改變，因此可 作為抗AD的評價指標，同時其對神經細胞的營養作用也將有利於AD 患者病理的改善。我們利用ELISA試劑盒(購自Biosource)檢測了胞外 sAPPa的含量變化。取指數生長期的細胞，消化後以lxl0VmL的濃度接種於12孔板，培養過夜後分別加入不同濃度的CLA，另設只加 DMSO的對照組，每組設3個復孔。48小時後收集培養液，在4"C下 12000 rpm離心5 min， 取上清，按照Human APP EIJSA Kit說明書檢 觀!jsAPPa。
結果表明(圖3)， sAPPa的分泌隨著CLA濃度的增大顯著增加，並 在60 jimol/L達到最高，與對照相比增加至2.16倍，而在80 nmol/L濃 度時有所下降，僅為對照組的1.14倍。
以上三個實施例說明，CLA在不影響APP表達的情況下，可減少 (3分泌酶的表達，促進APP更多地經a分泌酶所介導的途徑水解，使具 有神經營養作用的可溶性澱粉樣前體蛋白sAPPa分泌增多，其最佳作 用濃度為60pmol/L。
實施例4 CLA)^SH-SY5Y細胞中PPARy的激活作用
為了考察PPARy是否介導CLA對細胞中BACE1和sAPPa的影 響，我們利用siRNA技術將細胞中PPARy的表達抑制。siRNA-PPARY 質粒(pGenesil-l，由上海吉凱公司構建合成，其序列5，—3'sense strand: CGAAGACATTCCATTCACA)用電穿孔法轉染質粒DNA至 SH-SY5Y細胞，轉染率達70%以上。在圖4中我們首先證實CLA可 明顯激活SH-SY5Y細胞中PPARy的表達，是對照的1.2倍(**P<0.05), 這在其他細胞中(如MCF-7， SKBr3和Hela)有類似的結果。其次，我 們觀察到，與對照相比，PPARy-siRNA使細胞中的PPARY降低了近 30% (*P<0.01)，當60 pmol/L的CLA與siRNA-PPARy共處理 -SH-SY5Y細胞時，未見到PPARy有顯著的促進作用，其表達水平與 未加CLA時基本一致，說明siRNA-PPAR丫抑制了 CLA對PPARy的 激活作用，即CLA可作為核受體PPARY的激活劑或激活因子，調控 其下遊靶基因。實施例5 PPARy介導CLA^BACEl表達水平和胞外sAPPa分泌的 影響
用上述方法將PPARY的表達抑制來觀察是否影響了CLA對 BACEl的表達和胞夕卜sAPPa的分泌。當用PPARy siRNA處理細胞時， 與對照相比，BACEl的表達可見明顯升高(^PO，01)，而用60 pmol/L 的CLA與PPARysiRNA共處理時，BACE1的表達量有明顯的回落，與 對照沒有顯著差異C^PX).05)(圖5A);同樣條件下，PPARYsiRNA可 使胞夕卜sAPPa分泌有所降低，而用60 (imol/L的CLA與PPARy siRNA共 處理時，sAPPa有所升高，但只比CLA單獨存在時減少了 30%(*P<0.01， ** PO.05)(圖5B)。推領!lPPARY應是直接作用於BACEl 基因，艮卩BACE1可能作為PPARY調控的靶基因，故對其的抑制作用較 為明顯，而sAPPa由於有多種因素影響，因而PPARy的抑制未能完全 消除CLA的激活作用。
權利要求
1.共軛亞油酸在製備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了共軛亞油酸在製備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。本發明現已證實，CLA在不影響APP表達的前提下，具有抑制β分泌酶的表達，調節APP水解途徑和營養神經細胞的作用。其天然產物、對人體無毒、副作用低的特性，可用於製備抗阿爾茨海默氏症的藥物，應用前景廣闊。
文檔編號A61P25/28GK101524346SQ20091003850
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月8日 優先權日2009年4月8日
發明者瑩 杜, 楊湘玲, 翎 鍾, 青 陳 申請人:中山大學