一種培養分離難培養細菌的培養基的製作方法

2023-10-06 06:31:14

專利名稱：一種培養分離難培養細菌的培養基的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物新種培養分離領域，特別是一種用於分離新菌種的培養基及其製備方法。
背景技術：
從細菌對基質的利用及其在自然環境中的生長情況，可以分為四類:1、在高基質下無法生長，卻生長迅速；I1、在高基質濃度下無法生長，且生長緩慢；II1、高基質濃度能夠生長，且生長迅速；IV、高基質濃度下能夠生長，且生長緩慢。第II類群和第IV類群就是寡營養細菌，相對於第1、III類群細菌來說，難以被培養。另外，一些類型的細菌，其生長需要生長因子的刺激，也難以被分離培養。現有的新菌種培養基主要基於高營養濃度的溶菌肉湯(Luria-Bertani，LB)培養基或者稀釋LB培養基，僅對分離培養前述第III類群的細菌有效，難以分離其他難培養的細菌類群。

發明內容
本發明的目的在於，提供一種培養分離難培養菌種的培養基及其製備方法，可以從土壤、酸性礦坑水中高效分離難培養細菌
為達到上述目的，本發明採用以下技術方案:—種培養分離難培養菌種的培養基，以下簡稱該培養基為V3M培養基,其配方為:每IOOmL VL55培養基中加入0.3mL胺基酸溶液、10 μ L溶液I (微量元素)、0.3mL溶液
II(有機酸)、0.3mL溶液III (有機糖類)及1.5wt%結冷膠(gellan gum)；所述VL55培養基配方為，每IL溶液中含有1.95g 2_嗎啉乙磺酸(MES,2-[N-morphoIino]ethansulfonic acid)、0.2mmolMgS04、0.3mmolCaCl2、0.2mmol (NH4) 2HP04、ImL亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液、ImL微量元素溶液、ImLSL-1O溶液、ImL維生素溶液1、3mL維生素溶液II，調pH至5.5 ;所述VL55培養基中的亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液的配方為，每IL溶液中含有NaOH0.5g、Na2SeO3.5H203mg 及 Na2WO4.2H204mg ；所述VL55培養基中的微量元素溶液的配方為，每IL溶液中含有25wt %的HCllOmL, FeCl2.4H201.5g、CoCl2.6H20190mg、MnCl2.4H20100mg、ZnCl270mg、H3B036mg、Na2MoO4.2H2036mg、NiCl2.6H2024mg 及 CuCl2.2H202mg ；所述VL55培養基中的維生素溶液I的配方為，每IL溶液中含有4-氨基苯甲酸酯40mg、(+)-生物素10mg、煙酸100mg、泛酸150mg、維生素B6150mg、氯硫胺鹽酸鹽IOOmg及維生素B1250mg ；所述VL55培養基中的維生素溶液II的配方為，每IL溶液中含有核黃素IOmg及葉酸4mg ；所述胺基酸溶液的配方為，每IOOmL溶液中含有天冬氨酸470mg、蘇氨酸210mg、絲氨酸320mg、穀氨酸960mg、脯氨酸690mg、甘氨酸150mg、丙氨酸200mg、纈氨酸220mg、蛋氨酸90mg、異亮氨酸llOmg、亮氨酸250mg、酪氨酸70mg、苯丙氨酸140mg、賴氨酸350mg、組氨酸IOOmg及精氨酸150mg ；
所述溶液I 的配方為，每 IOOmL 溶液中含有 SrCl2.6H204mg、Na2SiO3.9H203mg、Ti023mg、Cd (NO3) 2.4H202mg 及 SnCl2.2H202mg ；
所述溶液II的配方為，每IOOmL溶液中含有DL-甘油醛30mg、鉻變酸20mg、五倍子酸70mg、抗壞血酸30mg、硫代乙醇酸鈉10mg、琥拍酸鈉50mg、DL-蘋果酸50mg、甲基三氯娃燒50mg、山梨醇50mg、水楊式40mg、巴比妥20mg、烏頭酸20mg、肌酸30mg及脫氧膽酸鈉30mg ；
所述溶液III的配方為，每IOOmL溶液中含有L-鼠李糖26mg、L_松三糖58mg、棉子糖38mg、半乳糖24mg、蜜二糖37mg、菊粉64mg、阿拉伯糖24mg、木糖43mg及纖維二糖54mg。
用於製備V3M培養基的VL55培養基，其配方為，每IL溶液中含有2_嗎啉乙磺酸1.95g, MgSO40.2mmol, CaCl20.3mmol、(MM)2HPO40.2mmol、亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液 lmL、微量元素溶液lmL、SL-1O溶液lmL、維生素溶液IlmL及維生素溶液II3mL，調pH至5.5。
用於製備VL55培養基的亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液，其配方為，每IL溶液中含有NaOH0.5g、Na2SeO3.5H203mg 及 Na2WO4.2H204mg。
用於製備VL55培養基的微量元素溶液，其配方為，每IL溶液中含有濃度為25wt %的 HCllOmL、FeCl2.4Η201.5g、CoCl2.6H20190mg、MnCl2.4H20100mg、ZnCl270mg、H3B036mg、Na2MoO4.2H2036mg、NiCl2.6H2024mg 及 CuCl2.2H202mg。
用於製備VL55培養基的維生素溶液I，其配方為，每IL溶液中含有4_氨基苯甲酸酯40mg、(+)-生物素10mg、煙酸lOOmg、泛酸150mg、維生素B6150mg、氯硫胺鹽酸鹽IOOmg及維生素B1250mg。
用於製備VL55培養基的維生素溶液II，其配方為，每IL溶液中含有核黃素IOmg及葉酸4mg。
用於製備V3M培養基的胺基酸溶液，其配方為，每IOOmL溶液中含有天冬氨酸470mg、蘇氨酸210mg、絲氨酸320mg、穀氨酸960mg、脯氨酸690mg、甘氨酸150mg、丙氨酸200mg、繳氨酸220mg、蛋氨酸90mg、異亮氨酸llOmg、亮氨酸250mg、酪氨酸70mg、苯丙氨酸140mg、賴氨酸 350mg、組氨酸IOOmg及精氨酸150mg。
用於製備V3M培養基的溶液I，其配方為，每IOOmL溶液中含有SrCl2.6H204mg、Na2SiO3.9H203mg、Ti023mg、Cd (NO3) 2.4H202mg 及 SnCl2.2H202mg。
用於製備V3M培養基的溶液II，其配方為，每IOOmL溶液中含有DL-甘油醛30mg、鉻變酸20mg、五倍子酸70mg、抗壞血酸30mg、硫代乙醇酸鈉10mg、琥拍酸鈉50mg、DL-蘋果酸50mg、甲基三氯娃燒50mg、山梨醇50mg、水楊式40mg、巴比妥20mg、烏頭酸20mg、肌酸30mg及脫氧膽酸鈉30mg。
用於製備V3M培養基的溶液III，其配方為，每IOOmL溶液中含有L-鼠李糖26mg、L-松三糖58mg、棉子糖38mg、半乳糖24mg、蜜二糖37mg、菊粉64mg、阿拉伯糖24mg、木糖43mg及纖維二糖54mg。
本發明的有益效果在於:
本發明提供了一種新的培養基，可以高效地分離大量難培養細菌。
下面結合實施例對本發明做進一步說明。


圖1為採用不同培養基培養細菌，各培養基上可見菌落數目的統計數據圖。
具體實施例方式實施例1—種培養分離難培養菌種的V3M培養基，其配方為:每100mLVL55培養基中加入
0.3mL胺基酸溶液、10 μ L溶液I (微量元素)、0.3mL溶液II (有機酸)、0.3mL溶液III (有機糖類)及1.5wt%結冷膠(gellan gum)。所述VL55培養基配方為，每IL溶液中含有1.95g 2_嗎啉乙磺酸(MES,2-[N-morphoIino]ethansulfonic acid)>0.2mmoI MgS04> 0.3mmolCaCl2、
0.2mmol (NH4) 2HP04、ImL亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液、ImL微量元素溶液、ImL SL-10溶液、ImL維生素溶液1、3mL維生素溶液II，調pH至5.5 ;所述VL55培養基中的亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液的配方為，每IL溶液中含有NaOH0.5g、Na2SeO3.5H203mg 及 Na2WO4.2H204mg ；所述VL55培養基中的微量元素溶液的配方為，每IL溶液中含有25wt %的HCllOmL, FeCl2.4H201.5g、CoCl2.6H20190mg、MnCl2.4H20100mg、ZnCl270mg、H3B036mg、Na2MoO4.2H2036mg、NiCl2.6H2024mg 及 CuCl2.2H202mg ；所述VL55培養基中的維生素溶液I的配方為，每IL溶液中含有4_氨基苯甲酸酯40mg、(+)-生物素10mg、煙酸100mg、泛酸150mg、維生素B6150mg、氯硫胺鹽酸鹽IOOmg及維生素B1250mg ；所述VL55培養基中的維生素溶液II的配方為，每IL溶液中含有核黃素IOmg及葉酸4mg。所述胺基酸溶液的配方為，每IOOmL溶液中含有天冬氨酸470mg、蘇氨酸210mg、絲氨酸320mg、穀氨酸960mg、脯氨酸690mg、甘氨酸150mg、丙氨酸200mg、纈氨酸220mg、蛋氨酸90mg、異亮氨酸llOmg、亮氨酸250mg、酪氨酸70mg、苯丙氨酸140mg、賴氨酸350mg、組氨酸IOOmg及精氨酸150mg。所述溶液I 的配方為，每 IOOmL 溶液中含有 SrCl2.6H204mg、Na2SiO3.9H203mg、Ti023mg、Cd (NO3) 2.4H202mg 及 SnCl2.2H202mg。所述溶液II的配方為，每IOOmL溶液中含有DL-甘油醛30mg、鉻變酸20mg、五倍子酸70mg、抗壞血酸30mg、硫代乙醇酸鈉10mg、琥拍酸鈉50mg、DL-蘋果酸50mg、甲基三氯娃燒50mg、山梨醇50mg、水楊式40mg、巴比妥20mg、烏頭酸20mg、肌酸30mg及脫氧膽酸鈉30mgo所述溶液III的配方為，每IOOmL溶液中含有L-鼠李糖26mg、L-松三糖58mg、棉子糖38mg、半乳糖24mg、蜜二糖37mg、菊粉64mg、阿拉伯糖24mg、木糖43mg及纖維二糖54mg。

所述V3M培養基的配置方法為:每IOOmL VL55培養基中加入所述胺基酸溶液
0.3mL、溶液I (微量元素)10 μ L、溶液II (有機酸)0.3mL及溶液III (有機糖類)0.3mL，再加入1.5%結冷膠。將配好的V3M培養基滅菌，倒於培養皿固化保藏於4°C備用。
本發明V3M培養基的培養效果驗證實驗
稱取Ig 土壤，加入到滅菌的IOOmL滅菌蒸餾水中，在攪拌器上以約200rpm攪拌15min,取ImL混合液，200W超聲，以超聲Is停4s為一個循環，共15循環。以此ImL溶液記為10_2，並梯度稀釋直至10_8為止，各培養基在各稀釋梯度上分別塗5板，每板取300 μ L，在室溫下進行培養。
如圖1所示，為不同培養基上隨著培養時間增加菌落數目的變化情況。從圖中可以看出，增加培養時間，各培養基上均會有新的菌落形成，而延長培養時間，在V3M培養基上能夠形成更多 新的菌落。
權利要求
1.一種培養分離難培養菌種的培養基,其特徵在於，所述培養基配方為:每IOOmLVL55培養基中加入0.3mL胺基酸溶液、10 μ L溶液1、0.3mL溶液I1、0.3mL溶液III及1.5wt%結冷膠； 所述VL55培養基配方為，每IL溶液中含有1.95g2-嗎啉乙磺酸、0.2mmol MgSO4,0.3mmol CaCl2,0.2mmol (NH4) 2HP04、ImL亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液、ImL微量元素溶液、ImLSL-1O溶液、ImL維生素溶液1、3mL維生素溶液II，調pH至5.5 ; 所述VL55培養基中的亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液的配方為，每IL溶液中含有NaOH0.5g、Na2SeO3.5H203mg 及 Na2WO4.2H204mg ； 所述VL55培養基中的微量元素溶液的配方為，每IL溶液中含有25wt %的HCllOmL, FeCl2.4H201.5g、CoCl2.6H20190mg、MnCl2.4H20100mg、ZnCl270mg、H3B036mg、Na2MoO4.2H2036mg、NiCl2.6H2024mg 及 CuCl2.2H202mg ； 所述VL55培養基中的維生素溶液I的配方為，每IL溶液中含有4-氨基苯甲酸酯40mg、(+)-生物素10mg、煙酸lOOmg、泛酸150mg、維生素B6150mg、氯硫胺鹽酸鹽IOOmg及維生素B1250mg ； 所述VL55培養基中的維生素溶液II的配方為，每IL溶液中含有核黃素IOmg及葉酸4mg ； 所述胺基酸溶液的配方為，每IOOmL溶液中含有天冬氨酸470mg、蘇氨酸210mg、絲氨酸320mg、穀氨酸960mg、脯氨酸690mg、甘氨酸150mg、丙氨酸200mg、繳氨酸220mg、蛋氨酸90mg、異亮氨酸llOmg、亮氨酸250mg、酪氨酸70mg、苯丙氨酸140mg、賴氨酸350mg、組氨酸1OOmg及精氨酸150mg ； 所述溶液 I 的配方為，每 IOOmL 溶液中含有 SrCl2 *6H204mg,Na2SiO3.9Η203π^、 023π^、Cd (NO3) 2.4H202mg 及 SnCl2.2H202mg ； 所述溶液II的配方為，每IOOmL溶液中含有DL-甘油醛30mg、鉻變酸20mg、五倍子酸70mg、抗壞血酸30mg、硫代乙醇酸鈉10mg、琥拍酸鈉50mg、DL-蘋果酸50mg、甲基三氯娃燒50mg、山梨醇50mg、水楊式40mg、巴比妥20mg、烏頭酸20mg、肌酸30mg及脫氧膽酸鈉30mg ； 所述溶液III的配方為，每IOOmL溶液中含有L-鼠李糖26mg、L_松三糖58mg、棉子糖38mg、半乳糖24mg、蜜二糖37mg、菊粉64mg、阿拉伯糖24mg、木糖43mg及纖維二糖54mg。
2.—種用於製備權利要求1中的培養基的VL55培養基,其特徵在於,其配方為，每IL溶液中含有 2-嗎啉乙磺酸 1.95g、MgSO40.2mmol、CaCl20.3mmol、(MM)2HPO40.2mmol、亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液lmL、微量元素溶液ImUSL-1O溶液lmL、維生素溶液IlmL及維生素溶液II3mL，調 pH 至 5.5。
3.一種用於製備權利要求2中VL55培養基的亞硒酸鹽-鎢酸鹽溶液，其特徵在於，其配方為，每 IL 溶液中含有 NaOH0.5g、Na2SeO3.5H203mg 及 Na2WO4.2H204mg。
4.一種用於製備權利要求2中VL55培養基的微量兀素溶液，其特徵在於，其配方為，每 IL 溶液中含有濃度為 25wt % 的 HCllOmL, FeCl2.4H201.5g、CoCl2.6H20190mg、MnCl2.4H20100mg、ZnCl270mg、H3B036mg、Na2MoO4.2H2036mg、NiCl2.6H2024mg 及CuCl2.2H202mg。
5.一種用於製備權利要求2中VL55培養基的維生素溶液I，其特徵在於，其配方為，每IL溶液中含有4-氨基苯甲酸酯40mg、(+)_生物素10mg、煙酸lOOmg、泛酸150mg、維生素B6150mg、氯硫胺鹽酸鹽IOOmg及維生素B1250mg。
6.一種用於製備權利要求2中VL55培養基的維生素溶液II，其特徵在於，其配方為，每IL溶液中含有核黃素IOmg及葉酸4mg。
7.一種用於製備權利要求1中的培養基的胺基酸溶液，其特徵在於，其配方為，每IOOmL溶液中含有天冬氨酸470mg、蘇氨酸210mg、絲氨酸320mg、穀氨酸960mg、脯氨酸690mg、甘氨酸150mg、丙氨酸200mg、繳氨酸220mg、蛋氨酸90mg、異亮氨酸llOmg、亮氨酸250mg、酪氨酸70mg、苯丙氨酸140mg、賴氨酸350mg、組氨酸IOOmg及精氨酸150mg。
8.一種用於製備權利要求1中的培養基的溶液I，其特徵在於，其配方為，每IOOmL溶液中含有 SrCl2 *6H204mg,Na2SiO3.9H203mg,Ti023mg,Cd (NO3) 2.4H202mg 及 SnCl2 *2H202mgo
9.一種用於製備權利要求1中的培養基的溶液II,其特徵在於,其配方為，每IOOmL溶液中含有DL-甘油醒30mg、鉻變酸20mg、五倍子酸70mg、抗壞血酸30mg、硫代乙醇酸鈉10mg、琥拍酸鈉50mg、DL-蘋果酸50mg、甲基三氯娃燒50mg、山梨醇50mg、水楊式40mg、巴比妥20mg、烏頭酸20mg、肌酸30mg及脫氧膽酸鈉30mg。
10.一種用於製備權利要求1中的培養基的溶液III,其特徵在於,其配方為,每IOOmL溶液中含有L-鼠李糖26mg、L-松三糖58mg、棉子糖38mg、半乳糖24mg、蜜二糖37mg、菊粉64mg、阿拉伯糖24mg、木 糖43mg及纖維二糖54mg。
全文摘要
本發明提供了一種培養分離難培養菌種的培養基，其配方為每100mL VL55培養基中加入0.3mL胺基酸溶液、10μL溶液I(微量元素)、0.3mL溶液II(有機酸)、0.3mL溶液III(有機糖類)及1.5wt％結冷膠(gellan gum)。本發明提供的新的培養基，可以高效地分離大量難培養細菌。
文檔編號C12N1/02GK103184173SQ20111045552
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者劉興宇, 陳勃偉, 劉文彥 申請人:北京有色金屬研究總院