膿毒症早期診斷液相晶片及其製備方法

2023-10-04 05:57:19

專利名稱：：膿毒症早期診斷液相晶片及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及醫學體外診斷技術，具體的是涉及膿毒症早期診斷液相晶片及其製備方法。技術背景膿毒症(Sepsis)是嚴重感染、嚴重創(燒)傷、休克、外科手術後常見的併發症，是由於微生物(如細菌、病毒、真菌、寄生蟲等)侵入人體而誘發的激烈全身炎症反應，並對組織具有損傷性的病理生理過程的一組臨床表現。嚴重膿毒症可以導致膿毒性休克、多器官功能障礙(MODS)，對人類健康和經濟發展構成極大的威脅和挑戰，已成為非心臟病死亡的主要原因。當前，膿毒症存在著患病率高、病死率高、治療費用高的三高現象。據統計，膿毒症的患病率約為總人口的0.3%，全球每年發生的總病例數約1800萬例，相當於丹麥、芬蘭、愛爾蘭和挪威人口的總和，僅美國每年患病人數就有75萬例。中國雖然沒有確切的統計數據，但推算應該不低於每年400萬例。不僅如此，資料還顯示膿毒症病例數正以每年1.5%的比例增長，預計到2050年，美國人口增加約30%(達到4億)，但膿毒症病例數將增加l倍以上(達到160萬例)。膿毒症的病死率約為28%~50%，平均40%，中國國內不完整的報告數據與此相近，全世界死亡人數每天超過1.4萬例，美國每年達到21.5萬例，尚有相當的死亡病例沒有計算在內而歸咎於原發病。膿毒症已經對人類健康產生嚴重威脅，為經濟發展帶來巨大負擔。在美國，每例患者的平均治療費用約為2.2萬美元，年耗資近200億美元，歐洲年耗資近100億美元。我國沒有這方面的確切數據，憑經驗估計每例患者的平均治療費用不會低於美國，因此治療總耗資相當可觀。準確及時診斷早期膿毒症、指導膿毒症的治療和判斷預後是目前icu(重症監護病房)所面臨的一個棘手難題。儘管現代醫療技術和重症監護水平明顯提高，但嚴重膿毒症、膿毒性休克或多器官功能障礙症候群(MODS)等併發症的病死率仍高達50%~70%。目前臨床上對嚴重膿毒症或MODS尚缺乏切實有效的預警指標和監測方法。由於危重病人全身性炎症反應，感染與非感染臨床表現相互混淆，膿毒症的傳統診斷指標如體溫(TEMP)、白細胞計數(WBC)、血沉(ESR)、C-反應蛋白(CRP)等都是非特異性的，且可靠性不強。現有的實驗診斷方法包括早期病原體診斷和血清學指標檢測。早期病原體運用細菌16srRNA基因擴增的方法檢測細菌，從而判斷細菌的存在與否及常見細菌的種類。這種技術具有快速、靈敏度高、不受抗生素治療影響等優點。其不足之處是會出現假陽性，且目前價格較昂貴。血清學指標檢測目前常用的標誌物有降鈣素原(PCT)、C反應蛋白(CRP)、白細胞介素-6(IL-6)及新喋呤等。一些歐洲國家用PCT作為鑑別系統性炎症反應綜合症(SIRS)和膿毒症的一個指標，並且有相關的商用試劑產品銷售，但也有人對該指標持有異議，認為其過於敏感。CRP也被作為診斷及監測膿毒症的一個參數。遺憾的是單一標誌物始終存在著特異性不強，陽性率較低等不足，只能作為膿毒症診斷和監測的參考，不能作為診斷膿毒症的真正的特異性指標。PCT特異性好，化學性能穩定，在早期預測膿毒症及其預後有較大潛力，但其敏感性稍差，配合敏感性好的新喋呤和C反應蛋白，可進一步提高其預測效率。膿毒症時IL-6的升高比這些急性期蛋白升高出現得更早。聯合檢測這些指標可以提高檢測的靈敏度和準確度，可以用來對膿毒症進行早期診斷和判斷預後。本發明根據大量文獻資料，確定聯合應用降鈣素原(PCT)、C反應蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)和新喋呤這四項指標來綜合評估膿毒症及其預後，進而及時地進行早期幹預，防止膿毒症的進一步惡化和改善患者預後。(1)C反應蛋白(CRP):CRP於1930年在肺炎病人血清中發現，可以與肺炎球菌的多聚糖片斷C發生反應並沉澱。正常人群CRP水平在10mg/L以下，膿毒症患者CRP在感染發生後46h即開始升高，3650h達到高峰，峰值可達正常參考值的數百倍，感染消除後其含量急驟下降，l周內可恢復至正常。CRP在病毒感染時無顯著升高，可以用來區別感染性炎症和其他類型的炎症，檢測敏感性為92.1%，特異性為82.1%。CRP在疾病整個過程中濃度分布超過正常值，但與病情嚴重程度無關。(2)降鈞素原(PCT):PCT最早發現於1986年，是無激素活性的降鈣素(CT)前肽物質。正常條件下血中PCT小於0.5ng/ml或檢測不到，感染後迅速上升，2小時左右可在血中檢測到，1224小時達到峰值，嚴重感染時可上升到正常值的2000倍以上。PCT在全身性炎症反應(2-3小時後)早期即可升高，具有早期診斷價值。在局部感染、病毒感染、慢性非特異性炎症、癌性發熱、移植物宿主排斥反應或自身免疫性等疾病時PCT濃度不增加或輕微增加，只在嚴重的全身系統性感染時才明顯增加，具有高度特異性，可用於各種臨床情況的鑑別診斷。PCT可以監測膿毒症的發生發展過程，其血漿濃度與感染和膿毒症疾病嚴重程度和活動程度成正比。PCT可以確定預後和療效，其水平持續增高是預後不好的有力標誌，水平下降標誌著預後良好，連續進行血漿PCT含量測定，有助於早期預測和識別MODS的發生。PCT在區分細菌感染和非感染性炎症方面具有很好的特異性，達81%;對嚴重膿毒症和膿毒性休克具有高達100%的特異性。(3)白細胞介素6(IL-6):IL-6是細胞因子的核心成員，發現於1980年。IL-6在血中代謝較慢，容易檢測，因而被作為膿毒症的重要標誌物。IL-6的升高比其他的急性期蛋白升高出現得更早，因此，檢測血中IL-6具有早期診斷優勢。同時，IL-6具有較好的敏感性和特異性，分別為81.1%和78.9%。許多研究顯示膿毒症病人血IL-6水平明顯增高，且增高幅度與膿毒症的嚴重程度、膿毒性休克和不良預後相關。IL-6水平持續增高病人多臟器功能不全(M0DS)和死亡率明顯增加。(4)新喋呤新喋呤(neopterin)是體內三磷酸鳥苷代謝衍生的低分子量喋啶類化合物。新喋呤與膿毒症等感染的病理過程密切相關，24小時內有休克傾向者血清水平明顯改變，對膿毒性休克的發生具有顯著的預測意義。新喋呤診斷MODS的敏感性、特異性和準確性為83.0%、88.5%和86.6%，其陽性預測值和陰性預測值則為79.6%和90.6%。連續測定新喋呤的含量可能有助於及早預測和識別MODS的發生，為早期幹預奠定基礎。新喋呤的持續升高與嚴重燒傷後膿毒症的發生與發展密切相關，燒傷可引起血清新喋呤升高。新喋呤可以預測新生兒膿毒症，並可以區分細菌感染和病毒感染，連續監測可以早期診斷壞死性小腸結腸炎。傳統的抗原檢測方法主要有放射免疫法，酶聯免疫法及電化學發光免疫法等。然而這些方法每次測試只能獲得一種待測物的濃度。同時，傳統的免疫檢測方法受靈敏度限制，因此對於一些低濃度的血清蛋白物質存在檢測結果不準確等缺陷。
發明內容本發明的目的是針對目前膿毒症的檢測、預後及療效評估方法的敏感性和特異性不高，不能區分細菌和病毒感染以及一次反應只能檢測一種標誌物的缺陷，提供一種可以四種標誌物聯檢的膿毒症早期診斷液相晶片。實現上述目的的技術方案如下一種膿毒症早期診斷液相晶片，包括有1)包被微球含有分別包被了PCT捕獲抗體的微球，包被了CRP捕獲抗體的微球，包被了IL-6捕獲抗體的微球，和包被了新碟呤捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼，-2)生物素標記檢測抗體含有分別用生物素標記的PCT、CRP、IL-6及新碟呤的檢測抗體；3)鏈親和素藻紅蛋白。優選為，每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為110—140個/W，更優選為120/^1;每種生物素標記檢測抗體的使用濃度為l-3ug/ml，更優選為2ug/ml。液相晶片技術也叫流式螢光技術，該技術由一種微球作為反應載體，微球用聚苯乙烯材料製成，直徑5.6um，表面有活性羧基可供化學偶連用。抗原、抗體等生物大分子可通過氨基與微球表面的羧基通過化學反應共價結合(即包被過程)。在微球製造過程中加入紅外和遠紅外兩種螢光染料，根據兩種染料混合比例的不同將微球進行編碼，可區分出上百種不同編碼的微球。使用時，先將PCT、CRP、IL-6及新碟呤的捕獲抗體分別包被於不同顏色編碼的微球上，同時分別用生物素標記PCT、CRP、IL-6及新碟呤的檢測抗體。將包被好的四種微球混合，懸浮於液相，再加入待檢測標本，在懸液中微球上標記的捕獲抗體與標本中相應的檢測物的某一個表位異性地結合，之後加入生物素標記的檢測抗體與標本中相應檢測物的另一表位特異性結合，反應完全後加入螢光物質——藻紅蛋白標記的鏈親和素，由於鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE)可以與生物素高度特異性結合，因此反應體系中最後形成"微球-捕獲抗體+待檢測物+生物素標記的檢測抗體+8八-￡"的四種複合物，以微球為載體，通過Luminex系列液相晶片分析儀器檢測，讀取微球的色彩編號及SA-PE的螢光值。微球色彩編號可辨別檢測項目，SA-PE螢光值與各檢測物濃度呈正相關，通過測定PCT、CRP、IL-6及新碟呤標準品在不同濃度下的螢光值，可以獲得各個檢測指標標準品濃度-螢光值標準曲線以及標準曲線方程。將待測血清樣本檢測所得螢光值代入標準曲線方程即可分別求得待測樣本中的PCT、CRP、IL-6及新碟呤的量。由於所有反應均處在液相環境，更有利於保持蛋白質的天然構象，使探針和被檢測物的反應更快更完全，因此檢測靈敏度和線性範圍均得到極大的提高。本發明另一需要解決的技術問題是提供上述膿毒症早期診斷液相晶片的製備方法。一種膿毒症早期診斷液相晶片的製備方法，主要包括以下步驟(1)相應的捕獲抗體包被微球-將50pL微球活化後，^15000rpm,離心；-吸棄上清，將微球重懸於pH5.0的230-280pL50mM的MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin，後將微球於^15000rpm，離心8—12min;重複該歩驟；-吸棄上清，將微球重懸於100nL50mMpH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-往懸浮的微球中加入相應的0.8-1.2(ag抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550nL;-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr;-偶聯了抗體後的微球以^12000g的速度，離心8—12min;-吸棄上清，將微球重懸於500pLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-室溫避光振蕩30min;再於^12000g，離心8—12min;-吸棄上清，將微球重懸於lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;微球^12000g，離心4一6min;重複該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸於500-1000^iLPBS-TBN溶液中；-每種包被好的微球通過luminex儀器計數後置於2-8"C避光單獨保存，使用時，依據檢測需要等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯微球的濃度均為120個/pl:(2)每種檢測抗體的生物素標記.--依據檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目標體積；-用DMSO(Dimethylsulfoxide)溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反應液；-按摩爾比1:100於反應管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應液；-加入體積為目標體積的1/10的pH8.9的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS補至目標體積；-包上鋁箔，將反應管置于振蕩器上，於25'C恆溫箱中避光孵育3-5小時，轉速為800rpm-1000rpm;-將反應液轉至透析盒內，於PBS緩衝液中透析過夜，以去除未反應的NHS-Biotin;-使用時根據需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合。所述活化微球的步驟如下-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；-取50pL微球離心8—10min;-去掉上清夜，將微球重懸於lOOpL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約30s，215000rpm離心1—2min;-吸棄上清，加入8(HiL的磷酸鹽緩衝液(pH6.2),渦漩振蕩約20s,超聲波懸浮微球約lmin;-加入1050mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻，超聲處理lmin;-加入10nL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫震蕩反應約20min。本發明所公開的多項膿毒症標誌物並行檢測液相晶片可一次反應同時完成多種膿毒症標誌物的定性定量檢測，從而達到對早期膿毒症的準確診斷和預後評估。本發明所提供的多項膿毒症標誌物並行檢測液相晶片具有檢測效率高，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高等優點。本發明方法結合液相晶片平臺高通量、準確靈敏的特性與雙抗體夾心法高靈敏度的特性，同步檢測4種膿毒症特異性標誌物，提高膿毒症早期診斷的敏感性和特異性，區分細菌和病毒感染引起的膿毒症，判斷膿毒症的嚴重程度和不良預後，連續監測以判斷病人對某種治療方法的反應。另外，本發明的製備方法簡單易行，穩定性好，其技術方案中的各種工藝參數如微球和抗體的濃度、反應過程等均是在大量試驗基礎上得出的，為製備過程最佳的參數值。圖1是檢測PCT的標準曲線示意圖；圖2是檢測CRP的標準曲線示意圖；圖3是檢測IL-6的標準曲線示意圖；圖4是檢測新碟呤的標準曲線示意圖。具體實施方式實施例1膿毒症早期診斷液相晶片的製備及抗原的檢測本發明所述的捕獲抗體為分別能對應與CRP、PCT、IL-6、及新喋呤特異性結合的單克隆抗體；本實施例所用的CRP捕獲抗體為CRP的單克隆抗體，克隆號為C2，檢測抗體為CRP的單克隆抗體，克隆號為C6，均購自Hytest公司；PCT捕獲抗體為PCT的單克隆抗體，克隆號為14C12,檢測抗體為PCT的單克隆抗體，克隆號為38F11，均購自Hytest公司；IL-6捕獲抗體為IL-6的單克隆抗體，克隆號為6708，購自R&D公司，檢測抗體為IL-6的多克隆抗體，購自abcam公司；新喋呤的捕獲抗體為新喋呤的單克隆抗體，克隆號為117/14E10，購自Alexis公司，檢測抗體為新喋呤的多克隆抗體，購自abcam公司。本實施例中，所述各種溶液的配方如下1.50mM的MES緩衝液(pH5.0)配方(250ml):tableseeoriginaldocumentpage122.PBS配方:tableseeoriginaldocumentpage123.PBS-TBN配方(即PBS中含O.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%Na3N，pH7.4)tableseeoriginaldocumentpage12l.膿毒症早期診斷液相晶片試劑盒，包括有:1)4-plex包被微球含有分別包被了PCT捕獲抗體的20號微球，包被了CRP捕獲抗體的38號微球，包被了IL-6捕獲抗體的53號微球，包被了新碟呤捕獲抗體的72號微球。2)4-plex生物素標記檢測抗體含有分別用生物素標記的PCT、CRP、IL-6及新碟呤的檢測抗體；3)鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE，10ug/ml);還按照現有技術配套有4)分析緩衝液；5)4-plext示7隹品；6)質控液I;7)質控液n;8)血清基質液；9)封口膜；10)濾板。2.製備上述液相晶片試劑盒，包括有如下步驟(1)按上述試劑盒的組成，每種捕獲抗體包被相應的微球，製備方法相同-分別選取20號、38號、53號、72號微球(美國Luminex公司)，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球，大約30s;-各取50pL微球於1.5ml的離心管中，15000rpm離心10min;-小心去掉上清夜，將微球重懸於IO(VL的雙蒸水中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin:15000rpml2000g離心10min;-吸棄上清，加入80pL的磷酸鹽緩衝液(pH6.2)，渦漩振蕩約30s,超聲處理lrnin;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻，超聲處理lmin;-力口入10pL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫震蕩反應約20min;-活化後的微球，215000rpm，離心10min;-吸棄上清，將微球重懸於250pL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;微球^15000rpm，離心10min;重複該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸於lOOpL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-往每種懸浮的微球中加入相應的l叱抗體，用50mM的MES(pH5.0)溶液將總體積補至500pL;-用渦漩振蕩器混勻，25。C避光振蕩2hr(轉速900rpm);-偶聯抗體後的微球以^12000g的速度，離心10min;-吸棄上清，將微球重懸於500pLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-室溫避光振蕩30min;-微球^12000g，離心10min;-吸棄上清，將微球重懸於lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;微球212000g，離心5min;重複該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸於600nLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通過luminex儀器計數；-包被好的微球置於2-8'C避光保存，每種抗體偶聯的微球單獨保存，使用時，依據檢測項目選擇等比例混合。(2)按上述試劑盒的組成，每種檢測抗體的生物素標記-依據蛋白濃度計算反應體系；-依據蛋白濃度計算抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目標體積(V);-配置NHS-Biotin反應液(用DMSO溶解，使其濃度為10mg/ml);-按摩爾比l:IOO於反應管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin(10mg/ml)反應液；-加入1/10目標體積的NaHC03(pH8.9)溶液；-加入PBS(pH7.4)補至目標體積；-包上鋁箔，將反應管置于振蕩器上，於25'C恆溫箱中避光孵育4h，轉速為900rpm;-將反應液轉至透析盒內，於PBS緩衝液中透析過夜，以去除未反應的NHS-Biotin;-測定蛋白濃度。3.用於檢測，包括如下步驟1)使用前先取出所有試劑，放置平衡至室溫。2)標準品的稀釋每個標準品設6個稀釋度，然後等比例混合，使各自得終濃度為所需的濃度。各管稀釋方法及理論濃度(同下表中的預期濃度)注意每個濃度標準品稀釋完後均必須用渦旋混合儀徹底混勻後才可用於下一濃度的稀釋。混勻過程避免產生泡沫。3)設置96孔板布局，確定96孔板上標準品、質控品、待測樣品及空白孔的位置。考慮到儀器讀數的順序是按照從第1列到第12列、從第A行到第H行的順序縱向讀數，在設置96孔板布局時應遵循從第1列到第12列、從第A行到第H行的順序排列。4)按照設置好的96孔板布局，每孔加25^1分析緩衝液，再分別加入25ul標準品、質控品到各自孔中，空白孔加25ul分析緩衝液。5)分別取出上述製備的針對四種膿毒症特異性標誌物檢測的捕獲抗體偶聯微球，用渦旋混合儀混勻30鈔，超聲處理30秒，按等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯的微球濃度均為120個4U。往每孔中加入的四種捕獲抗體偶聯微球的混合懸液25pl。包被微球應在臨用前混勻，且混勻後應立即使用，否則放置過久微球會再沉澱。6)用封口膜封住所有加樣孔口，並用錫箔紙包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振蕩器上以600轉速度震蕩，孵育60分鐘。7)孵育完成後每孔加入25ul上述製備的生物素標記的檢測抗體的混合液(其中所述四種生物素標記的檢測抗體事先按等比例混合，使每種檢測抗體最終濃度達到2ug/ml，搖勻)，用封口膜封住所有加樣孔口，並用錫箔紙包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振蕩器上以600轉速度震蕩，再孵育60分鐘。8)孵育完成後每孔加入25ul鏈親和素藻紅蛋白，用封口膜封住所有加樣孔口，並用錫箔紙包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振蕩器上以600轉速度震蕩，再孵育30分鐘。9)於Luminex系列液相晶片分析儀上讀取結果。儀器可自動繪製標準曲線，並計算出待測樣品的測值。4.實驗結果分析實驗結果如表l、表2(請參見圖1至圖4)本發明所公開的多項膿毒症標誌物並行檢測液相晶片只需25^L的血清樣本即可一次反應同時完成四種膿毒症標誌物的定量檢測。同時，與放射免疫，化學發光檢測及酶聯免疫吸附等方法相比，液相晶片平臺檢測範圍更寬，靈敏度更高，重複性更好。由於所有反應均處在液相環境，更有利於保持蛋白質的天然構象，使探針和被檢測物的反應更快更完全，因此檢測靈敏度和線性範圍均得到極大的提高。通過對CRP、PCT、IL-6及新喋呤捕獲抗體和檢測抗體的配對，我們找到了適用於這四種膿毒症標誌物檢測的最優抗體對。通過標準曲線的分析，可以看到本發明所提供的膿毒症早期診斷液相晶片對四種膿毒症標誌物的檢測具有很高的檢測靈敏度和特異性。其中，PCT與IL-6標準曲線的線性在9.77pg/ml10ng/ml的濃度範圍內R220.99,最低檢測限可達9.77pg/ml。CRP的標準曲線在97.7pg/ml100ng/ml的濃度範圍內R2^).99，最低檢測限可達97.7pg/ml。新喋呤的標準曲線在2.44pmol/ml2.5nmol/ml的濃度範圍內R220.99，最低檢測限可達2.44pmol/ml，且各個標準點的實測濃度與預期濃度的相對誤差不超過8%。因此，本發明提供的膿毒症早期診斷液相晶片能對血清中四種膿毒症標誌物極微量的變化進行檢測，並且能一次性檢測四種診斷價值各異的血清標誌物，從而提高早期診斷及鑑別診斷的準確率。同時，能區別膿毒症和其他原因引起的SIRS，區分細菌和病毒感染引起的膿毒症，為針對性的治療提供依據，判斷膿毒症的嚴重程度和不良預後，連續監測以判斷病人對某種治療方法的反應。表1tableseeoriginaldocumentpage17權利要求1.一種膿毒症早期診斷液相晶片，其特徵是，主要包括有1)包被微球含有分別包被了PCT捕獲抗體的微球，包被了CRP捕獲抗體的微球，包被了IL-6捕獲抗體的微球，和包被了新碟呤捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；2)生物素標記檢測抗體含有分別用生物素標記的PCT、CRP、IL-6及新碟呤的檢測抗體；3)鏈親和素藻紅蛋白。2.根據權利要求l所述的膿毒症早期診斷液相晶片，其特徵是，每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為110—140個4d;每種生物素標記檢測抗體的使用濃度為l-3ug/ml。3.根據權利要求2所述的膿毒症早期診斷液相晶片，其特徵是，每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為120個4d;每種生物素標記檢測抗體的使用濃度為2ug/ml。4.一種製備如權利要求1所述膿毒症早期診斷液相晶片的方法，主要包括以下步驟-(1)每種相應的捕獲抗體包被微球-將50^iL微球活化後，^15000rpm，離心；-吸棄上清，將微球重懸於pH5.0的230-280pL50mM的MES的溶液中，渦漩振蕩約30s,超聲處理lmin，後將微球於^15000rpm，離心；重複該步驟；-吸棄上清，將微球重懸於100pL50mMpH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-往懸浮的微球中加入相應的0.8-1.2^g抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550iaL;-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr;-偶聯了抗體後的微球以^12000g的速度，離心8-12min;-吸棄上清，將微球重懸於50(^LPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s,超聲處理lmin;-室溫避光振蕩30min;再於^12000g，離心8—12min;-吸棄上清，將微球重懸於lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin:微球^12000g，離心4一6min;重複該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸於500-100(VLPBS-TBN溶液中；-每種包被好的微球通過luminex儀器計數後置於2-8'C避光單獨保存，使用時，依據檢測需要等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯微球的濃度均為110-140個/pl;(2)每種檢測抗體的生物素標記-依據檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目標體積；-用DMSO溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反應液；-按摩爾比l:IOO於反應管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應液；-加入體積為目標體積的1/10的pH8.9的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS補至目標體積；-包上鋁箔，將反應管置于振蕩器上，於25匸恆溫箱中避光孵育3-5小時，轉速為800rpm-1000rpm;-將反應液轉至透析盒內，於PBS緩衝液中透析過夜，以去除未反應的NHS-Biotin:-使用時根據需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合，使每種檢測抗體最終濃度達到l-3ug/ml。5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵是所述活化微球的步驟如下-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；-取50(aL微球離心8—10min;-去掉上清夜，將微球重懸於100pL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約30s，超聲處理lmin，^15000rpm離心8—12min;-吸棄上清，加入80nL的磷酸鹽緩衝液，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約lmin;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻，超聲處理lmim-力口入10nL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫震蕩反應約20min。全文摘要本發明公開了一種膿毒症早期診斷液相晶片，主要包括有含有分別包被了PCT捕獲抗體的微球，包被了CRP捕獲抗體的微球，包被了IL-6捕獲抗體的微球，和包被了新碟呤捕獲抗體的微球，上述微球具有不同顏色編碼；分別用生物素標記的檢測抗體；鏈親和素藻紅蛋白。本發明所提供的膿毒症早期診斷液相晶片具有檢測效率高，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高等優點。同時，同步檢測4種膿毒症特異性標誌物，提高膿毒症早期診斷的敏感性和特異性，區分細菌和病毒感染引起的膿毒症，判斷膿毒症的嚴重程度和不良預後，連續監測以判斷病人對某種治療方法的反應。文檔編號G01N33/543GK101246163SQ20081002611公開日2008年8月20日申請日期2008年1月29日優先權日2008年1月29日發明者林一群,許嘉森,謝建平申請人:廣州益善生物技術有限公司