一種秈稻組織培養基及農桿菌介導的轉基因方法

2023-05-22 23:04:26 2

專利名稱：：一種秈稻組織培養基及農桿菌介導的轉基因方法
技術領域：
：本發明涉及植物組織培養及轉基因
技術領域：
，具體涉及秈稻組織培養基，同時還涉及一種培養基的農桿菌介導的轉基因方法，本發明適用於水稻花葯愈傷組織誘導和繼代，未成熟胚愈傷組織誘導和繼代，成熟胚愈傷組織誘導和繼代。以及農桿菌介導的愈傷組織遺傳轉化操作。
背景技術：
：水稻是全球的主要糧食作物，分為粳稻和秈稻兩個亞種，兩個亞種的各自代表品種都已經進行了全基因組測序(粳稻日本晴，秈稻9311)。所以對其進行基因工程的操作是當前研究的熱點。遺傳轉化方法常用的有農桿菌侵染法和基因槍法。各種轉化方法都依賴於優良的受體材料——愈傷組織，尤其農桿菌介導的遺傳轉化。農桿菌介導的遺傳轉化基於自然界本來存在的生物過程，轉化一般為單拷貝插入，所得到的轉基因苗變異較少優於基因槍轉化方法。但是，農桿菌介導的遺傳轉化方法對轉化受體材料_愈傷組織質量的要求比基因槍遺傳轉化方法高的多。從上世紀九十年代，第一個農桿菌侵染法水稻(粳稻)轉基因成功以來，粳稻轉基因技術已經相當的成熟和穩定。但是，秈稻農桿菌介導的轉基因一直很難成功，進展緩慢，只有極少數品種的秈稻能夠進行轉基因操作，並且成功率很低。漫長研究探索仍然沒有找到理想的、能夠廣泛適用於秈稻愈傷組織的培養和遺傳轉化方法，不能從根本上解決秈稻遺傳轉化的難題依賴基因型和遺傳轉化頻率低。在最新報導的文獻中仏inYJ，ZhangQOptimizingthetissuecultureconditionsforhighefficiencytransformationofindicarice。PlantCellRep(2005)23:540-547;XiaojiaGeZhaohuiChuYongj皿LinShipingWang2006AtissueculturesystemfordifferentgermplasMSofindicaricePlantCellR印(2006)25:392-402;YukohHiei&ToshihikoKomari。Agrobacterium—mediatedtransformationofriceusingimmatureembryosorcalliinducedfrommatureseed。NatureProtocol,2008，3:824-834;AsukaNishimura，IkukoAichi&MakotoMasuoka。AprotocolforAgrobacterium—mediatedtransformationinrice。NatureProtocol，2006，1:2796-2802)，根據Ge，etal。(2007)提供的誘導培養基和方法能夠有效地誘導9311產生愈傷組織，這些愈傷組織能夠有效地進行分化。但是這些愈傷組織在其提供的繼代培養基上生長狀態差，很容易死亡，這種狀態的愈傷組織不能夠用來做農桿菌侵染轉基因操作，本實驗室進行多次重複實驗都沒有能夠獲得遺傳轉化成功的陽性愈傷組織。目前，秈稻轉基因技術仍然存在瓶頸，只有部分秈稻基因型能夠轉化成功，而且轉化效率不高；一些大面積推廣應用的優良品種，包括超級雜交稻的親本材料都存在遺傳轉化困難的問題，大大地限制了轉基因技術在水稻品種改良的作用。針對水稻轉基因的現狀，我們系統地研究分析了培養基成分、溫度、激素、植物凝膠的濃度、抗生素濃度，以及各種處理方法對愈傷組織誘導、繼代和遺傳轉化的影響，最終設計出全新的培養基，命名為LY培養基。LY培養基是秈稻的通用培養基，在已經完成的35個秈稻基因型遺傳轉化試驗中，所獲得的愈傷組織質量好、生長快，適用於農桿菌介導的的遺傳轉化。所測試的35個秈稻基因型遺傳轉化都獲得了成功，轉化效率介於20_50%，獲得了非常理想的結果，取得了秈稻遺傳轉化技術的重大突破。
發明內容本發明的目的是在於提供了一種秈稻組織培養基(LY培養基)，該培養基可用於秈稻組織培養。LY培養基是秈稻的通用培養基，在已經完成的35個秈稻基因型遺傳轉化試驗中，所獲得的愈傷組織質量好、生長快，適用於農桿菌介導的的遺傳轉化。所測試的35個秈稻基因型遺傳轉化都獲得了成功，轉化效率介於20-50%，獲得了非常理想的結果，取得了秈稻遺傳轉化技術的突破。本發明的另一個目的是在於提供了一種在水稻組織培養基上的農桿菌介導的轉基因方法，基於LY培養基的農桿菌介導的先導遺傳轉化技術，對所述的35個秈稻品種進行測試，愈傷組織生長良好，遺傳轉化率高，實現了理想的轉化率(20-50%)。A、一種適合於秈稻愈傷組織生長的培養基(命名LY培養基)物質硝酸根離子(N03—>)銨離子(NH4+)鉀離子(K+)磷酸根離子(P043—)七水硫酸鎂(MgS04*7H20)二水氯化f丐(CaCL2*2H20)硫酸錳(MnS04)硫酸鋅(ZnS04)硼酸(HB03)碘化鉀(KI)五水硫酸銅(CuS04*5H20)二水鉬酸鈉(Na2Mo04*2H20)六水氯化鈷(CoCl2*6H20)甘氨酸維生素Bl維生素B6煙酸肌醇七水硫酸亞鐵(FeS04*7H20)N。。EDTA濃度(基本成分大量元素)40-70mM10-30mM30-60mM2-5mM150-400mg/L150-400mg/L20-40mg/L2-10mg/L5_15mg/Ll_5mg/L0.01-0.lmg/L0.1-lmg/L0.01-0.lmg/L2-4mg/Ll_2mg/L0.5-lmg/L0.5-lmg/L0-100mg/L20-50mg/L30-70mg/L。B、一種在水稻組織培養基上的農桿菌介導的轉基因方法，其步驟是1、愈傷組織誘導誘導培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4_d:0.5—1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6—ba等)濃度0.00-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將本步驟上述成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組配封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。①成熟胚誘導a)成熟水稻胚去穎殼之後，75%體積比酒精浸泡lmin。b)O.15%質量比的HgCl2浸泡10-15分鐘。c)用滅菌水洗4遍，每次1分鐘；再用滅菌水浸泡5分鐘，用滅菌水再洗一次；將成熟種子胚接種到誘導培養基上，每瓶5-6顆，放置29-35攝氏度環境下暗培養25-35天，長出的愈傷組織接種到繼代培養基上。②幼胚誘導a，幼胚去殼取出後，；b，0.15%質量比的HgC12浸泡15分鐘；c，用滅菌水洗4遍，每次1分鐘，再滅菌水浸泡5分鐘，用滅菌水再洗一次；接種到誘導培養基上，每瓶5-6顆；放置29-35攝氏度環境暗培養25-35天長出的愈傷組織接種到繼代培養基上；③花葯誘導a，取水稻花葯，先連同穎殼一起0.15%的HgC12浸泡15分鐘；b，用滅菌水洗4遍，每次1分鐘，再滅菌水浸泡5分鐘，用滅菌水再洗一次；c，每50ml三角瓶接種80個花葯，放置29-35攝氏度環境暗培養30-40天長出的愈傷組織接種到繼代培養基上；:幼穗誘導待幼穗發育到2-3cm時取材，將無菌的幼穗剪2-3rnm的長度散於誘導培養基上，放置29-35攝氏度環境暗培養30-40天長出的愈傷組織接種到繼代培養基上；2、繼代繼代培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠2.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.00-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將本步驟上述成分加入定溶到1000ml。pH5.4-5.830ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。繼代操作挑取發生於盾片處的生長旺盛，質地堅硬，色澤黃亮的愈傷組織，每50ml瓶接種0.2克左右。每100ml三角瓶接種0.4g左右。顆粒大小直徑3mm為宜。29-35度生長9-13天，可以增長7-15倍。3、預培養預培養培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠2.5-3.0g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.00-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將本步驟上述成分加入定容到1000ml。pH5.4_5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組配封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。預培養操作將生長良好的愈傷組織塊接種於預培養培養基上，60-70塊/9cm平皿，28-30度暗培養生長2-3天。秈稻愈傷組織與預培養特徵在於l，預培養培養基的激素濃度2，4-d:0.5-1.5mg/L細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.05-0.5mg/L。4、農桿菌準備將轉化好的農桿菌菌液在相應抗性的平板上劃線，稠密為宜，30度生長36-48小時。再進行一次劃線，生長24-36小時後可以進行轉基因操作。5、農桿菌懸浮培養農桿菌懸浮培養基在LY/2的基礎上添加在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度:0.00-0.5mg/L;Ph5.4-5.830ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。懸浮侵染操作先將農桿菌懸浮培養基分裝在50ml/(100ml三角瓶中)，115度滅菌15分鐘，溫度降到室溫，後加入終濃度100um的乙醯丁香酮。將生長好的農桿菌平板上的農桿菌刮到農桿菌懸浮培養基裡，30度震蕩，0D值在0.5-1.5的範圍內即可轉基因侵染。將預培養的愈傷組織轉移到懸浮的菌液中，室溫浸泡20-30min。6、共培養共培養培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.00-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將本步驟上述成分加入定溶到1000ml。Ph5.4_5.830ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。共培養操作將侵染中在菌液中的愈傷組織瀝乾農桿菌菌液；再將愈傷放置在滅菌後風乾的多層(8-10層)濾紙上，超淨臺晾乾約1小時，儘量浸幹農桿菌菌液，以免共培養的時候農桿菌生長過多，對愈傷組織損害過度。同時，將共培養培養基倒好，方法同預培養培養基，超淨臺吹乾1-2小時。然後將濾紙上的愈傷組織顆粒挑到共培養培養基上，每皿70顆左右，19-22度暗培養2-3天。待培養基上略見菌斑為宜。7、第一次篩選第一次篩選培養基(以潮黴素作為真核抗性為例)篩選培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L;2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6_ba等)濃度0.00-0.5mg/L;在1000ml可滅菌的瓶子中將上述成分全部加入，定容到1000ml，115攝氏度滅菌15分鐘。冷卻到50攝氏度左右加入對應載體抗性標記的陽性克隆篩選劑一定濃度，600-800mg/L終濃度的頭孢，倒平板30ml/9cm平叛。超淨臺晾乾30-60min。篩選操作將共培養的愈傷組織用400-800mg/l濃度的滅菌水洗淨表面的農桿菌，直至水清澈。是否洗淨農桿菌是是決定以後篩選中是否長菌的關鍵。洗乾淨的愈傷組織均勻放置在滅菌濾紙上超淨臺放置30分鐘。將濾紙上的愈傷組織均勻的放在篩選培養基上20-30顆/皿。28-32度暗培養20-25天。8、後篩選後篩選培養基(以潮黴素作為真核抗性為例)8篩選培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L;2，4-d:0.1-0.5mg/L，；細胞分裂素(kt或ba或6_ba等)濃度0.5-1.5mg/L在lOOOml可滅菌的瓶子中將上述成分全部加入，定容到lOOOml，115攝氏度滅菌15分鐘。冷卻到50攝氏度左右加入對應載體抗性標記的陽性克隆篩選劑一定濃度，倒平板30ml/9cm平叛。超淨臺晾乾10-30min。篩選操作將第一次篩選的陽性愈傷組織(新長出的愈傷組織)顆粒，轉移到後篩選培養基上15顆每平皿，28-32度培養7天。分化培養基在LY培養基中加入穀氨醯胺300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素kt:1.5—2.5mg/L;6_ba:1.5—2.5mg/L;NAA:0.1—0.5mg/L;IAA:0.1—0.5mg/L。植物凝膠2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0。將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶。將上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml，30ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中用組配封口膜封口後110攝氏度滅菌15分鐘。冷凝後即可用。分化操作分化培養基配製好後每個100的三角瓶分裝50ml，110度滅菌15分鐘。將篩選長出的陽性愈傷組織顆粒放置與分化培養基上，每瓶放置2-3個陽性克隆。26-30度，光照分化10-14天長出綠葉後就可以進行生根。生根培養基在1/2LY培養基中300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:NAA:0-0.lmg/L或IAA:0-0.lmg/L。植物凝膠2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0，首先將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶。將上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml30ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中用組配封口膜封口後110攝氏度滅菌15分鐘。冷凝後即可用。生根操作將每個克隆分化出的健壯苗每瓶放置2-3棵苗。27-30度光照培養，10_15天後可直接移栽。發明與現有技術相比具有以下優點和效果l，此培養基——改善了愈傷組織的質量。愈傷組織不再出現褐化，水化，白化，玻璃化等症狀。培養出的各品種的愈傷組織堅硬，緻密，色澤黃亮達到轉基因的理想狀態。如圖，3。圖2為9311的愈傷組織。2，使得轉化率達到20-50%。見表一，如圖二，a，b，c，d分別為9311，m63，94d_2，gd-ls的篩選結果。3，本發明解決了長期以來秈稻誘導困難，繼代困難，轉基因困難的難題。經過對秈稻9311，yta，ytb，明輝63，c815s，彥農6s，天源6s，pei64s，9802s，珍山97，IR64，明恢86，ipd，寶大粒等34個秈稻品種實驗表明全部能有效的進行愈傷組織誘導，繼代，轉化。4，提高了愈傷組織生長的速度，縮短了轉化周期誘導只需25天，在最新文獻(XiaojiaGeetal2007，LinandZhang2005)愈傷組織增長6-7倍需要15-20天的時間，然而在本發明中所描述的方法中9-12天就愈傷組織就可以增長7-10倍。兩次篩選只要30天。所以整個轉基因過程從誘導開始3個月就可以完成。從轉化開始一個半月就可以完成。圖1:9311誘導結果，誘導結果良好，出愈率高，沒有任何的褐化。圖2:9311愈傷組織繼代，愈傷組織狀態優秀，黃色顆粒，沒有任何的水化褐化。圖3:9311愈傷組織，愈傷組織黃色，表面光滑，質地堅硬。圖4:9311愈傷組織經過共培養和水洗後的愈傷組織，依然狀態良好沒有任何的發黑的現象，表明愈傷組織質量極好，可以經受逆境處理。圖5:9311篩選結果。有較高的陽性率，轉化率很高。圖6:9311的另一個篩選實例。很多愈傷表面長出了新的愈傷組織，表明轉化率較高。圖7:9311愈傷組織的gus染色驗證，右一為陰性對照，其他為檢測樣品，表明陽性率很好，隨機抽取12個樣有11個表現出明顯的gus陽性。圖8:9311愈傷組織的分化照片，顯示了較高的分化率和分化質量。圖9:9311生根，再生苗健壯。圖10:轉基因苗的per鑑定具體實施方式實施例1-種新的適合於秈稻愈傷組織生長的培養基(命名LY培養基，下同)物質濃度硝酸根離子(N03—>)銨離子(NH4+)鉀離子(K+)磷酸根離子(P043—)七水硫酸鎂(MgS04*7H20)二水氯化f丐(CaCL2*2H20)硫酸錳(MnS04)硫酸鋅(ZnS04)硼酸(HB03)碘化鉀(KI)五水硫酸銅(CuS04*5H20)二水鉬酸鈉(Na2Mo04*2H20)六水氯化鈷(CoCl2*6H20)甘氨酸維生素Bl維生素B6(基本成分大量元素)40或45或51或56或62或66或70mM10mM或20mM或30mM30mM或40mM或50mM或60mM2mM或3mM或4mM或5mM150mg/L或250mg/L或400mg/l150mg/L或250mg/L或400mg/L20mg/L或30mg/L或40mg/L2mg/L或4mg/L或6mg/L或lOmg/L5mg/L或10mg/L或15mg/Llmg/L或3mg/L或5mg/L;0.0lmg/L或0.05mg/L或0.lmg/L0.lmg/L或0.5mg/L或lmg/L0.0lmg/L或0.5mg/L或0.lmg/L2mg/L或3mg/L或4mg/Llmg/L或2mg/L0.5mg/L或lmg/L煙酸0.5mg/L或lmg/L肌醇0mg/L或50mg/L或100mg/L七水硫酸亞鐵(FeS04*7H20)20mg/L或35mg/L或50mg/LNa2EDTA30mg/L或45mg/L或70mg/L實施例2:用質粒pCAMBIA1301(購於澳大利亞CAMBIA公司)，農桿菌為EHA105菌株(本實驗保存)，轉化秈稻材料9311(本實驗室保存)成熟胚誘導的愈傷組織。一種在水稻組織培養基上的農桿菌介導的轉基因方法，其步驟是A、愈傷組織誘導誘導培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，—酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4_d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.0-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組配封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。成熟水稻胚去穎殼之後，75%酒精浸泡lmin。b)O.15%的HgCl2浸泡10-15分鐘。c)用滅菌水洗4遍，每次1分鐘；再用滅菌水浸泡5分鐘，用滅菌水再洗一次；將成熟種子胚接種到誘導培養基上，每瓶5-6顆，放置29-35攝氏度環境下暗培養25-35天，長出的愈傷組織(如圖1)接種到繼代培養基上。B、繼代繼代培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠2.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.0-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。繼代操作挑取發生於盾片處的生長旺盛，質地堅硬，色澤黃亮的愈傷組織，每50ml瓶接種0.2克左右。每100ml三角瓶接種0.4g左右。顆粒大小直徑3mm為宜。29-35度生長9-13天，可以增長7-15倍，如圖2，圖3。C、預培養預培養培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠2.5-3.0g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6_ba等)濃度0.0-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將成分加入定溶到1000ml。Ph5.4_5.830ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組配封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。預培養操作將生長良好的愈傷組織塊接種於預培養培養基上，60-70塊/9cm平皿，28-30度暗培養生長2-3天。秈稻愈傷組織與預培養特徵在於l，預培養培養基的激素濃度2，4-d:0.5-1.5mg/L細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.05-0.5mg/L。D、農桿菌準備將轉化好的農桿菌菌液在相應抗性的平板上劃線，稠密為宜，30度生長36-48小時。再進行一次劃線，生長24-36小時後可以進行轉基因操作。E、農桿菌懸浮培養農桿菌懸浮培養基在LY/2的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4_d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度:0.0-0.5mg/L;Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。懸浮侵染操作先將農桿菌懸浮培養基分裝在50ml/(100ml三角瓶中)，115度滅菌15分鐘，溫度降到室溫後加入終濃度100um的乙醯丁香酮。將生長好的農桿菌平板上的農桿菌刮到農桿菌懸浮培養基裡，30度震蕩，OD值在0.5-1.5的範圍內即可轉基因侵染。將預培養的愈傷組織轉移到懸浮的菌液中，室溫浸泡20-30min。F、共培養共培養培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6_ba等)濃度0.0-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將成分加入定溶到1000ml。Ph5.4_5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。共培養操作將侵染中在菌液中的愈傷組織瀝乾農桿菌菌液；再將愈傷放置在滅菌後風乾的多層(8-10層)濾紙上，超淨臺晾乾約1小時，儘量浸幹農桿菌菌液，以免共培養的時候農桿菌生長過多，對愈傷組織損害過度。同時，將共培養培養基倒好，方法同預培養培養基，超淨臺吹乾1-2小時。然後將濾紙上的愈傷組織顆粒挑到共培養培養基上，每皿70顆左右，19-22度暗培養2-3天。待培養基上略見菌斑為宜。G、第一次篩選第一次篩選培養基(以潮黴素篩選為例)篩選培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L;2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.0-0.5mg/L;在1000ml可滅菌的瓶子中將上述成分全部加入，定容到1000ml，115攝氏度滅菌15分鐘。冷卻到50攝氏度左右加入25-30mg/L終濃度的潮黴素，600-800mg/L終濃度的頭孢，倒平板30ml/9cm平叛。超淨臺晾乾30-60min.篩選操作將共培養的愈傷組織用400-800mg/l濃度的滅菌水洗淨表面的農桿菌，直至水清澈。洗乾淨的愈傷組織均勻放置在滅菌濾紙上超淨臺放置30分鐘，如圖4。將濾紙上的愈傷組織均勻的放在篩選培養基上20-30顆/皿。28-32度暗培養20-25天，如圖5.H、後篩選後篩選培養基(以潮黴素篩選為例)篩選培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L;2，4-d:0.1-0.5mg/L，；細胞分裂素(kt或ba或6_ba等)濃度0.5-1.5mg/L在1000ml可滅12菌的瓶子中將上述成分全部加入，定容到lOOOml，115攝氏度滅菌15分鐘。冷卻到50攝氏度左右加入30-40mg/L終濃度的潮黴素，倒平板30ml/9cm平叛。超淨臺晾乾10_30min。篩選操作將第一次篩選的陽性愈傷組織(新長出的愈傷組織)顆粒，轉移到後篩選培養基上15顆每平皿，28-32度培養7天。分化培養基在LY培養基中加入穀氨醯胺300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:kt:1.5-2.5mg/L;6_ba:1.5-2.5mg/L;NAA:0.1-0.5mg/L;IAA:0.1-0.5mg/L。植物凝膠2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶。將上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml，30ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中用組配封口膜封口後110攝氏度滅菌15分鐘。冷凝後即可用。分化操作分化培養基配製好後每個100的三角瓶分裝50ml，110度滅菌15分鐘。將篩選長出的陽性愈傷組織顆粒放置與分化培養基上，每瓶放置2-3個陽性克隆。26-30度，光照分化10-14天長出綠葉後就可以進行生根，如圖8。[OMO]生根培養基在1/2LY培養基中300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:NAA:0-0.lmg/L或IAA:0-0.lmg/L。植物凝膠2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0首先將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶。將上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml30ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中用組配封口膜封口後110攝氏度滅菌15分鐘。冷凝後即可用生根操作將每個克隆分化出的健壯苗每瓶放置2-3棵苗。27-30度光照培養，10_15天後直接移栽，如圖9。對轉基因愈傷和植株的鑑定如圖7:陽性愈傷的gUS染色檢測。如圖10:轉基因苗的pcr鑑定。實施例3:用質粒pCAMBIA1301(購於澳大利亞pCAMBIA公司)，農桿菌為EHA105菌株(本實驗保存)，轉化秈稻材料9311，yta，明恢63，江-s，94d_2，ytb/9311，71994，5-34/浙733，y58s-l，IR40931,kaslath，IR64，DML105，FR13A，GodaHeenati，E32，天源96-2，顯矮s，MC526,GD-1SD等20個品種的誘導，培養，農桿菌轉化。A、愈傷組織誘導誘導培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.5-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組配封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。成熟水稻胚去穎殼之後，75%酒精浸泡lmin。b)0.15%的HgCl2浸泡10-15分鐘。c)用滅菌水洗4遍，每次1分鐘；再用滅菌水浸泡5分鐘，用滅菌水再洗一次；將成熟種子胚接種到誘導培養基上，每瓶5-6顆，放置29-35攝氏度環境下暗培養25-35天，長出的愈傷組織接種到繼代培養基上。B、繼代繼代培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠2.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。繼代操作挑取發生於盾片處的生長旺盛，質地堅硬，色澤黃亮的愈傷組織，每50ml瓶接種0.2克左右。每100ml三角瓶接種0.4g左右。顆粒大小直徑3mm為宜。29-35度生長9-13天，可以增長7-15倍。C、預培養預培養培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠2.5-3.Og/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將成分加入定溶到1000ml。Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組配封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。預培養操作將生長良好的愈傷組織塊接種於預培養培養基上，60-70塊/9cm平皿，28-30度暗培養生長2-3天。秈稻愈傷組織與預培養特徵在於l，預培養培養基的激素濃度2，4-d:0.5-1.5mg/L細胞分裂素(kt或ba，6-ba等)濃度0.05-0.5mg/L。D、農桿菌準備將轉化好的農桿菌菌液在相應抗性的平板上劃線，稠密為宜，30度生長36-48小時。再進行一次劃線，生長24-36小時後可以進行轉基因操作。E、農桿菌懸浮培養農桿菌懸浮培養基在LY/2的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4_d:0.5-1.5mg/L;Ph5.4-5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。懸浮侵染操作先將農桿菌懸浮培養基分裝在50ml/(100ml三角瓶中)，115度滅菌15分鐘，溫度降到室溫後加入終濃度100um的乙醯丁香酮。將生長好的農桿菌平板上的農桿菌刮到農桿菌懸浮培養基裡，30度震蕩，OD值在0.5-1.5的範圍內即可轉基因侵染。將預培養的愈傷組織轉移到懸浮的菌液中，室溫浸泡20-30min。F、共培養共培養培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L，2，4-d:0.5-1.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將成分加入定溶到lOOOml。Ph5.4-5.830ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘。共培養操作將侵染中在菌液中的愈傷組織瀝乾農桿菌菌液；再將愈傷放置在滅菌後風乾的多層(8-10層)濾紙上，超淨臺晾乾約1小時，儘量浸幹農桿菌菌液，以免共培養的時候農桿菌生長過多，對愈傷組織損害過度。同時，將共培養培養基倒好，方法同預培養培養基，超淨臺吹乾1-2小時。然後將濾紙上的愈傷組織顆粒挑到共培養培養基上，每皿70顆左右，19-22度暗培養2-3天。待培養基上略見菌斑為宜。G、第一次篩選第一次篩選培養基(以潮黴素篩選為例)篩選培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L;2，4-d:0.5-1.5mg/L;在lOOOml可滅菌的瓶子中將上述成分全部加入，定容到lOOOml，115攝氏度滅菌15分鐘。冷卻到50攝氏度左右加入25-30mg/L終濃度的潮黴素，600-800mg/L終濃度的頭孢，倒平板30ml/9cm平叛。超淨臺晾乾30_60min.篩選操作將共培養的愈傷組織用400-800mg/l濃度的滅菌水洗淨表面的農桿菌，直至水清澈。洗乾淨的愈傷組織均勻放置在滅菌濾紙上超淨臺放置30分鐘，如圖4。將濾紙上的愈傷組織均勻的放在篩選培養基上20-30顆/皿。28-32度暗培養20-25天。H、後篩選後篩選培養基(以潮黴素篩選為例)篩選培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L;2，4-d:0.1-0.5mg/L，；細胞分裂素(kt或ba或6_ba等)濃度0.5-1.5mg/L在lOOOml可滅菌的瓶子中將上述成分全部加入，定容到lOOOml，115攝氏度滅菌15分鐘。冷卻到50攝氏度左右加入30-40mg/L終濃度的潮黴素，倒平板30ml/9cm平叛。超淨臺晾乾10_30min。篩選操作將第一次篩選的陽性愈傷組織(新長出的愈傷組織)顆粒，轉移到後篩選培養基上15顆每平皿，28-32度培養7天。分化培養基在LY培養基中加入穀氨醯胺300-500mg/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:kt:1.5-2.5mg/L;6_ba:1.5-2.5mg/L;NAA:0.1-0.5mg/L;IAA:0.1-0.5mg/L。植物凝膠2.5-3.Og/L。Ph值5.6-6.0將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶。將上面描述的所有成分加入定溶到lOOOml，30ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中用組配封口膜封口後110攝氏度滅菌15分鐘。冷凝後即可用。分化操作分化培養基配製好後每個100的三角瓶分裝50ml，110度滅菌15分鐘。將篩選長出的陽性愈傷組織顆粒放置與分化培養基上，每瓶放置2-3個陽性克隆。26-30度，光照分化10-14天長出綠葉後就可以進行生根。生根培養基在1/2LY培養基中300-/L;脯氨酸300-500mg/L;酸水解酪蛋白500-1000mg/L;蔗糖30g/L;激素:NAA:0-0.lmg/L或IAA:0-0.lmg/L。植物凝膠2.5-3.0g/L。Ph值5.6-6.0首先將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶。將上面描述的所有成分加入定溶到1000ml30ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中用組配封口膜封口後110攝氏度滅菌15分鐘。冷凝後即可用生根操作將每個克隆分化出的健壯苗每瓶放置2-3棵苗。27-30度光照培養，10-15天後直接移栽。不同品種誘導產生胚性愈傷組織的效率tableseeoriginaldocumentpage16tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18權利要求一種秈稻愈傷組織培養的培養基，其組成物質和濃度範圍如下物質濃度硝酸根離子40-70mM銨離子10-30mM鉀離子30-60mM磷酸根離子2-5mM七水硫酸鎂150-400mg/l二水氯化鈣150-400mg/L硫酸錳20-40mg/L硫酸鋅2-10mg/L硼酸5-15mg/L碘化鉀1-5mg/L五水硫酸銅0.01-0.1mg/L二水鉬酸鈉0.1-1mg/L六水氯化鈷0.01-0.1mg/L甘氨酸2-4mg/L維生素B11-2mg/L維生素B60.5-1mg/L煙酸0.5-1mg/L肌醇0-100mg/L七水硫酸亞鐵20-50mg/LNa2EDTA30-70mg/L。2.權利要求l所述的一種秈稻組織培養基的農桿菌介導的轉基因方法，其步驟是A、愈傷組織誘導誘導培養基在n培養基的基礎上添加蔗糖30g／L，酸水解酪蛋白500—800mg／L，穀氨醯胺300—500mg／L，脯氨酸300—500mg／L，2，4一Do.5一1.5mg／L，細胞分裂素濃度o.o—o.5mg／L；將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，與本步驟上述成分混勻，定溶到1000ml，pH5.4—5.830ml或50ml／瓶分裝到50ml或lOOml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘，或先115度滅絕15min後倒平板，30ml／9Cm平板；①成熟胚誘導a)成熟水稻胚去穎殼之後，75％酒精浸泡lmin；b)o.15％的HgCl，浸泡lo—15分鐘；C)用滅菌水洗4遍，每次1分鐘；再用滅菌水浸泡5分鐘，用滅菌水再洗一次；將成熟種子胚接種到誘導培養基上，每瓶5—6顆，放置29—35攝氏度環境下暗培養25—35天，長出的愈傷組織接種到繼代培養基上；②幼胚誘導a)幼胚去殼取出後；b)o.15％的HgCl，浸泡15分鐘；C)用滅菌水洗4遍，每次1分鐘，再滅菌水浸泡5分鐘，用滅菌水再洗一次；接種到誘導培養基上，每瓶5—6顆；放置29—35攝氏度環境暗培養25—35天長出的愈傷組織接種到繼代培養基上；⑧花葯誘導a)取花葯，先連同穎殼一起o.15％的HgCl，浸泡15分鐘；b)用滅菌水洗4遍，每次1分鐘，再滅菌水浸泡5分鐘，用滅菌水再洗一次；C)每50ml三角瓶接種80個花葯，放置29—35攝氏度環境暗培養30一40天長出的愈傷組織接種到繼代培養基上；幼穗誘導待幼穗發育到2-3cm時取材，將無菌的幼穗剪2-3mm的長度散於培養基上，放置29-35攝氏度環境暗培養30-40天長出的愈傷組織接種到繼代培養基上；B、繼代繼代培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠2.5-3.0g/L，2，4-D0.5-1.5mg/L，細胞分裂素濃度0.0-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，與本步驟上述成分混勻，定溶到1000ml，pH5.4-5.830ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘；繼代操作挑取發生於盾片處的生長旺盛、質地堅硬、色澤黃亮的愈傷組織，每個50ml瓶接種0.2克，每個100ml三角瓶接種0.4g，顆粒大小直徑3mm，29-35度生長9_13天；C、預培養預培養培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠2.5-3.Og/L，2，4-D0.5-1.5mg/L，細胞分裂素濃度0.0-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，與本步驟上述成分混勻，定溶到1000ml。pH5.4-5.830ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘；預培養操作將生長的愈傷組織塊接種於預培養培養基上，60-70塊/9cm平皿，28-30度暗培養生長2-3天；D、農桿菌準備將轉化的農桿菌菌液在抗性的平板上劃線，稠密，30度生長36-48小時，再進行一次劃線，生長24-36小時後進行轉基因操作；E、農桿菌懸浮培養農桿菌懸浮培養基在1/2LY的基礎上添加在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，2，4-D0.5-1.5mg/L，細胞分裂素濃度0.0-0.5mg/L;pH5.4-5.8，30ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘；懸浮侵染操作先將農桿菌懸浮培養基分裝在50ml三角瓶，115度滅菌15分鐘，溫度降到室溫後加入終濃度100uM的乙醯丁香酮，將生長的農桿菌平板上的農桿菌刮到農桿菌懸浮培養基裡，30度震蕩，0.D.值在0.5-1.5的範圍內轉基因侵染，將預培養的愈傷組織轉移到懸浮的菌液中，室溫浸泡20-30min;F、共培養共培養培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L，2，4-D0.5-1.5mg/L;細胞分裂素濃度O.0-0.5mg/L;將植物凝膠用800ml去離子水用微波爐煮溶，將本步驟上述成分加入混勻，定溶到1000ml，pH5.4-5.8，30ml或50m1/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中，用組培封口膜封口後，115攝氏度滅菌15分鐘；共培養操作將侵染在菌液中的愈傷組織瀝乾農桿菌菌液，再將愈傷組織放置在滅菌後風乾的8-10層濾紙上，超淨臺晾乾1小時，將濾紙上的愈傷組織顆粒挑到共培養培養基上，每皿70顆，19-22度暗培養2-3天，待培養基上見菌斑；G、第一次篩選第一次篩選培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0-3.5g/L，2，4_D0.5-1.5mg/L;在lOOOml滅菌的瓶子中將本步驟上述成分加入，定容到1000ml，115攝氏度滅菌15分鐘，冷卻到50攝氏度加入對應載體抗性標記的陽性克隆篩選劑一定濃度，600-800mg/L終濃度的頭孢菌素，倒平板30ml/9cm平叛，超淨臺晾乾30_60min;篩選操作將共培養的愈傷組織用400-800mg/L頭孢菌素濃度的滅菌水洗淨表面的農桿菌，直至水清澈，洗乾淨的愈傷組織均勻放置在滅菌濾紙上超淨臺放置30分鐘，將濾紙上的愈傷組織均勻的放在篩選培養基上20-30顆/皿，28-32度暗培養20-25天；H、後篩選後篩選培養基在LY培養基的基礎上添加蔗糖30g/L，酸水解酪蛋白500-800mg/L，穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，植物凝膠3.0_3.5g/L，細胞分裂素濃度0.5-1.5mg/L，在lOOOml滅菌的瓶子中將本步驟上述成分加入定容到lOOOml，115攝氏度滅菌15分鐘，冷卻到50攝氏度左右加入對應載體抗性標記的陽性克隆篩選劑一定濃度，倒平板30ml/9cm平叛，超淨臺晾乾10_30min;篩選操作將第一次篩選的陽性愈傷組織顆粒，轉移到後篩選培養基上15顆每平皿，28-32度培養5-7天；I、分化培養分化培養基在LY培養基中加入穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，酸水解酪蛋白500-1000mg/L，蔗糖30g/L，激素KT1.5-2.5mg/L，6_BA1.5-2.5mg/L，NAA0.1-0.5mg/L，IAA0.1-0.5mg/L，植物凝膠2.5-3.0g/L。pH值5.6-6.O，將植物凝膠用800ml去離子水在微波爐中煮溶，將本步驟上述成分加入定溶到lOOOml;30ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中用組培封口膜封口後110攝氏度滅菌15分鐘；分化操作分化培養基配製好後每個100的三角瓶分裝50ml，110度滅菌15分鐘，將篩選長出的陽性愈傷組織顆粒放置在分化培養基上，每瓶放置2-3個陽性克隆，26-30度，光照分化10-14天長出綠葉後進行生根；J、生根培養生根培養基在1/2LY培養基中加入穀氨醯胺300-500mg/L，脯氨酸300-500mg/L，酸水解酪蛋白500-1000mg/L，蔗糖30g/L，激素NAA0-0.lmg/L或IAA0-0.lmg/L，植物凝膠2.5-3.Og/L，pH值5.6-6.O，將植物凝膠用800ml去離子水在微波爐中煮溶，將本步驟上述成分加入定溶到1000ml;30ml或50ml/瓶分裝到50ml或100ml容積的三角瓶中用組培封口膜封口後110攝氏度滅菌15分鐘；生根操作將每個克隆分化出的綠苗每瓶放置2-3棵苗，27-30度光照培養，10-15天後直接移栽。全文摘要本發明公開了一種秈稻組織培養基及農桿菌介導的轉基因方法，該培養基包含水稻愈組織生長所必須的大量元素，小量元素，有機元素以及不同培養階段的激素配比。基於該培養基的秈稻轉基因包括愈傷組織的誘導，繼代，預培養，共培養，篩選，後篩選，分化，生根等步驟。本方法廣泛適用秈稻基因型，所測試的35個秈稻基因型遺傳轉化全部獲得成功，轉化率介於20-50％。解決了長期以來秈稻組織培養和農桿菌介導的遺傳轉化的技術難題基因型依賴和轉化頻率低，將廣泛應用於秈稻的分子生物學、功能基因組研究和品種遺傳改良。秈稻種植的面積佔水稻生產總面積的80％以上，本發明對水稻基礎生物學研究、新品種改良，以及保障未來糧食安全發揮重要的作用。文檔編號C12N15/82GK101717749SQ20091027335公開日2010年6月2日申請日期2009年12月22日優先權日2009年12月22日發明者李陽,李陽生申請人:武漢大學