複製缺陷型抗ev71和ca16病毒雙價疫苗的製備方法
2023-10-04 02:30:19 1
專利名稱：複製缺陷型抗ev71和ca16病毒雙價疫苗的製備方法
技術領域：
本發明涉及疫苗製備技術領域，特別是一種複製缺陷型抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的製備方法。本發明是基於腸道病毒EV71-HB0803株的研究成果，該毒株由中國典型培養物保藏中心保藏(地址中國，武漢大學生命科學學院，武漢市武昌區八一路四9號， 430072)，保藏日期是2010年9月30日，保藏號是CCTCC NO :V201020。
背景技術：
腸道病毒71 型(Enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒 A16 (Coxsakievirus A16, CA16)為手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)最主要的病原體，屬於小 RNA 病毒科，腸道病毒屬成員。EV71病毒CA16病毒在嬰幼兒中引起手足口病的大範圍暴發流行，並可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等併發症，病情發展快即可導致死亡，而EV71 更是被稱之為脊髓灰質炎病毒之後最重要的神經病毒。衛生部2010年11月統計結果顯示，全國丙類傳染病發病中，手足口病高達79591例，死亡20例，在丙類傳染病中高居第二位。我國自2007年以來日手足口病的多次大面積爆發，使得手足口病毒疫苗研發顯得尤為迫切。EV71和CA16在手足口病例中多以混合感染的形式出現，也使雙價疫苗的需求呼之欲出。EV71屬於腸病毒屬，其遺傳物質為單一正股RNA。EV71基因組分為結構基因Pl和非結構基因P2P3。其結構蛋白Pl翻譯形成的多聚蛋白在非結構基因表達的2A、3CD蛋白酶作用下切割成VP1、VP3、VP0。病毒在形態發生過程中必須專一性的選擇正確的基因組RNA 並將之包裹入外殼蛋白質(Capsid)中，才能順利形成成熟的病毒顆粒並離開宿主細胞。， 提有證據證明病毒的形成需要2CATPase與VP3蛋白質間專一性的結合。本發明將Pl結構基因整合到vero細胞中，形成可穩定表達Pl多聚蛋白的細胞系。再將以CA16病毒VPl替換掉Pl的重組型EV71複製子，通過轉染的方式導入該細胞系。重組型複製子表達的2々、30)蛋白酶切割細胞表達的？1，形成￥ 1、￥ 2、￥ 3、￥ 4，再通過2C與VP3的相互作用，包裝重組型複製子形成複製缺陷型病毒。該複製缺陷型病毒在此細胞系中可迅速複製，因而可大量快熟在此細胞中生產。由於缺失結構基因，在正常細胞中無法複製，但EV71病毒顆粒和所表達CA16病毒VPl可作為抗原，引起機體產生抗體，從而同時抗EV71和CA16。我國目前尚無有效的EV71病毒疫苗，已經申請的EV71病毒疫苗研發的專利技術僅1項。現有的EV71病毒疫苗包括減毒活疫苗、滅活疫苗、VLP疫苗、重組蛋白疫苗和DNA 疫苗多處於實驗階段，無法滿足臨床需求，且具有以下缺陷(1)上述所有疫苗均為單價疫苗；(2)減毒活疫苗仍然可以存活，有可能發生回復突變，再次變異為強毒株並引起疾病， 經動物實驗證實，減毒活疫苗可在神經細胞中檢測到其存在，具有潛在的危險；(3)滅活疫苗需大量擴增病毒、純化並完全滅活，操作複雜，且滅活過程可能降低其免疫原性；(4) VLP 疫苗需大量表達結構蛋白，VLP的形成依賴於蛋白的自組裝，效率較低且可能弓I入表達系統的其他蛋白；(5)重組蛋白疫苗需大量表達純化病毒結構蛋白，DNA疫苗需大量獲取病毒cDNA，操作複雜，代價較大。本發明所述基於Pl蛋白穩定表達細胞系和EV71-CA16病毒VPl 重組型複製子的疫苗製備方法，具有明顯的優勢，比如安全性高、製備速度快、同時抗EV71 和CA16、製備簡便穩定，適用於大規模生產。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是為克服現有技術的缺陷，提供一種基於穩定表達細胞系與重組型複製子的、安全性高、方便快速製備的複製缺陷型抗EV71和CA16雙價疫苗的製備方法。本發明解決其技術問題採用以下的技術方案
本發明提供的複製缺陷型抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的製備方法，包括構建EV71P1 多聚蛋白穩定表達細胞系、構建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的EV71病毒全長cDNA 克隆、轉染Pl穩定表達細胞系獲取複製缺陷型病毒和複製缺陷型病毒的檢測的步驟，具體是
1.構建EV71P1多聚蛋白穩定表達細胞系
(1)重組慢病毒載體質粒構建
以引物 Pl-SalI-Kozak-F 和 Pl-NotI-R 對 EV71-HB0803 株(保藏號CCTCC NO V201020)全長cDNA克隆為模板進行PCR，酶切後連接到MLV逆轉錄病毒載體pFB-neo上， 得到插入Pl的載體pFB-neo-Pl，
Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA, Pl-NotI-R :CTCCCGCGGCCGC TTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC,
(2)假病毒包裝
以pFB-neo-Pl和編碼VSVG蛋白的pLP/VSVG質粒共轉染用於包裝MLV假病毒的 GP2-293細胞，獲得假病毒，
(3)vero細胞G418最適篩選濃度的確定
以梯度稀釋法確定vero細胞對G418最低敏感濃度，最低敏感濃度+100ug/ml即為抑制濃度，
(4)假病毒感染vero細胞及G418篩選陽性細胞單克隆
假病毒感染24h後加入含有篩選濃度G418的培養基，獲得抗性細胞後繼續以G418篩選單克隆；篩選3輪後在G418培養基中生長較快、長勢良好的克隆，鑑定其Pl多聚蛋白表達情況，
(5)EV71Pl多聚蛋白穩定表達細胞系的PCR及Wfestern blot檢測鑑定
提取細胞核酸和蛋白，分別用RT-PCR和Western Blot方法檢測核酸水平和蛋白水平 Pl多聚蛋白的表達。2.獲取重組CA16VP1基因的複製缺陷型病毒
(1)EV71全長cDNA克隆的構建逆轉錄PCR獲取全長cDNA後克隆到pGEM-T easy載體上的T7啟動子下遊，得到EV71全長cDNA克隆pEV71，
(2)重組柯薩奇病毒CA16VP1基因質粒構建
提取大腸桿菌DH5 α /pT-CA16VPl (保藏號CCTCC NO :M2010376)中的質粒 pT-CA16VPl，PCR獲得CA16VP1基因，並用CA16的VPl基因替換EV71全長cDNA克隆pEV71上的Pl區，
(3)獲得複製缺陷型病毒
帶有CA16 VPl的EV71重組子質粒體外轉錄後轉染Pl穩定表達細胞系，收取上清中的缺陷型病毒，
(4)複製缺陷型病毒擴大培養
以獲得的缺陷型病毒感染Pl穩定表達細胞系，獲得大量的子代複製缺陷型病毒， 經過上述步驟，得到可用於製備抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的複製缺陷型病毒。在假病毒包裝過程中，將GP2-293細胞於37°C、體積濃度為5%0)2細胞培養箱中， 以DMEM+10%FBS培養基進行培養。本發明採用以下方法對GP2-293細胞進行培養轉染前一天，將每皿5X106個細胞的密度接種於IOcm細胞培養皿中；待細胞培養至70%-80%時，將培養基更換為新鮮的 DMEM+10%FBS培養基；Ih後，將5ugpFB-neo_Pl和2. 5ugpLP/VSVG共轉染用於包裝MLV假病毒的GP2-293細胞，轉染6-8 h後將培養基更換為DMEM+2%FBS ；24h後觀察收取上清，加入新鮮培養基，48h後再次收取細胞上清；兩次上清合併後離心，除去細胞碎片，以0. 45 μ m孔徑濾器過濾，獲得整合有Pl基因的MLV假病毒。在共轉染GP2-293細胞過程中，所採用的轉染試劑為磷酸鈣轉染試劑。本發明通過RT-PCR獲得EV71病毒全長cDNA，並克隆到pGEM_T easy載體上的T7 啟動子下遊，得到EV71-HB0803株全長cDNA克隆pEV71。所述CA16VP1基因是通過提取大腸桿菌DH5 α /pT_CA16VPl (保藏號CCTCC NO M2010376)中的質粒PT-CA16VP1，然後進行PCR獲得。本發明以overlap-PCR的方法用CA16的VPl基因替換EV71-HB0803株全長cDNA 克隆PEV71上的Pl區，引物為
primer-1 ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC，
primer-2 TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT, primer-3 :ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA， primer-4 :TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTC ΤΑ, primer-5 TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA， primer-6 :GTTCCGATACCACGGTGTC。所述Primer-1 和 primer-2、primer-5 和 primer-6 分別以 EV71 全長 cDNA 克隆pEV71為模板進行PCR，Primer-3和primer-4以pT_CA16VPl質粒為模板PCR ；片段以膠回收試劑盒純化後按1:1:1比例混合，以I^rimer-I和primer-6為上下遊引物進行 overlap-PCR,得至Ij overlap-PCR 產物。所述overlap-PCR產物兩端帶有的SnaBI和Mil單酶切位點，將產物片段和EV71 全長cDNA克隆pEV71分別酶切後加入T4DNA連接酶連接；連接產物轉換DH5 α感受態細胞，挑單克隆接菌培養，並以質粒提取試劑盒提取質粒，經irwitrogen公司測序檢測無誤。本發明製備的複製缺陷型病毒，可以採用以下方法進行檢測
(1)複製缺陷型病毒滴度測定
以複製缺陷型感染Pi穩定表達細胞系，取時間點收病毒，有限連續稀釋測定滴度；
(2)複製缺陷型病毒的檢測將濃縮的的複製缺陷型病毒製備樣品，電鏡觀察。本發明與現有技術相比具有以下的主要優點
(1)操作簡便，所需時間短，以少量複製缺陷型病毒感染穩定表達Pi細胞繫到產生下一代複製缺陷型病毒只需Mh。(2)複製缺陷性疫苗不能複製，安全性高；
(3)產量大，產生的複製缺陷病毒滴度高達IO6到IO8；
(4)直接從細胞上清收取複製缺陷病毒作為疫苗，雜質少，便於純化。
圖1為EV71P1基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為Pl穩定表達細胞系PCR鑑定瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為Pl穩定表達細胞系western blot鑑定Pl蛋白表達。圖4為EV71HB0803株全長cDNA逆轉錄PCR產物電泳圖。圖5為複製缺陷型病毒滴度測定。圖6為複製缺陷型病毒電鏡圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明做進一步描述。1. EV71P1多聚蛋白穩定表達細胞系的構建 (1)重組質粒構建
根據EV71病毒EV71-HB0803株(CCTCC保藏號V201020)基因組Pl基因序列設計一對引物
Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA, Pl-NotI-R CTCCCGCGGCCGCTTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC， 擴增片段為W89bp。為便於PCR產物的克隆，上、下遊引物分別添加一個Mil和NotI酶切位點。為提高表達效率，上遊引物上引入了真核生物Kozak序列。該引物由hvitrogen 公司合成。以EV71-HB0803株cDNA為模板進行PCR，得到大小為2589 bp的片段(圖1)。將獲得的用DNA凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司生產)回收PCR產物。以載體 pGEM-T easy(購自promega公司)連接後，轉化大腸桿菌DH5 α，獲得重組質粒。經序列測定， 說明PCR擴增獲得DNA片段為本發明需要的目的片段。用NotI和MlI分別酶切重組質粒和慢病毒載體pFB-neo (Agilent Technology)，回收Pl片段和線性化的pFB-neo，經iMDNA 連接酶(promega公司生產)連接後，轉化大腸桿菌DH5 α。用plasmid mini kit (omega) 試劑盒提取質粒，測序鑑定無誤，此質粒命名為pFB-neo-Pl。(2)假病毒包裝
GP2-293細胞(clontech公司生產)於37°C、5%0)2細胞培養箱中以DMEM+10%FBS培養基進行培養。轉染前一天，將每皿5 X IO6個細胞的密度接種於IOcm細胞培養皿中。待細胞培養至70%-80%時，將培養基更換為新鮮的DMEM+10%FBS培養基。Ih後，將5ugpFB-neo_Pl 和2. 5ug編碼VSVG囊膜蛋白的pLP/VSVG(invitrogen公司生產)共轉染GP2-293細胞，轉染試劑為磷酸鈣(invitrogen公司)，轉染後6_8 h將培養基更換為DMEM+2%FBS。24h後觀察收取上清，加入新鮮培養基，4 後再次收取細胞上清。兩次上清合併後離心，除去細胞碎片，以0. 45 μ m孔徑濾器過濾，即獲得整合有Pl基因的MLV假病毒。(3) vero細胞G418最適篩選濃度的確定
以梯度稀釋法確定vero細胞對G418最低敏感濃度。將vero細胞接種至12孔板中，加入不含G418的DMEM+10%FBS細胞培養基。24h後，吸去培養基，換為濃度依次為含有IOOug/ ml-700ug/mKM18的新鮮培養基。每2_3天以同等濃度的G418選擇培養基換液一次。7_14 天后觀察細胞死亡情況，發現300ug/ml以上濃度的G418可使細胞全部死亡。使細胞全部死亡的最低濃度+100ug/ml=G418最適篩選濃度，可得vero細胞的G418最適篩選濃度為 400ug/ml。(4)假病毒感染vero細胞及G418篩選陽性細胞單克隆
感染前一天，將vero細胞以3X IO6個細胞的密度接種於IOOmrn細胞培養皿中，收取未變黃的上清以0. 45nm孔徑的濾膜過濾備用。融合度達到70%假病時，假病毒以M0I=5感染 vero細胞。感染M小時後，吸去培養基，以PBS洗一次，加入含有400ug/ml G418 (GE公司)的DMEM+10%FBS培養基進行抗生素篩選。可看到有耐藥性克隆出現，以胰酶消化製備細胞懸液，計數並稀釋至1個/IOul。向96孔板的每個孔中加入50ul含有400ug/ml G418的 DMEM+10%FBS，然後加入IOul細胞懸液。在顯微鏡下尋找只有一個細胞的孔，向其中加入前述收取的培養液上清50ul。待單克隆成片後轉入48孔板中培養，以同樣方法繼續篩選兩輪。將得到的細胞系western檢測Pl蛋白表達量，取表達量較高的細胞擴大培養後凍存。 已凍存的細胞復甦適用時，前兩代需以含有400ug/ml G418的培養基培養。(5) EV71多聚蛋白Pl穩定表達細胞系鑑定 1)PCR鑑定
取500ul細胞懸液，5000rpm離心IOmin沉澱細胞，加入ImlTRIZOL (invitrogen公司)， 混勻後室溫靜置5min。加入200ul氯仿，震蕩15s，靜置anin。4°C 8000g離心15min。吸取上層水相，轉移至一個新的EP管中，加入500ul異丙醇，混勻靜置10min，4°C 8000g離心 15min。沉澱以75%乙醇洗一次，4°C 7500g離心5min。吸去乙醇，室溫靜置至無可見液體， 加入60ulDEPC水。取15ul，加入lulEV71特異性引物EV71-R 5』- AGAGGGAGRTCTATCTCYCC -3』 ，
70 V水浴5min後立即置於冰上，加入IulMLV逆轉錄酶(promega公司生產)， 2ul 10Xbuffer, IulRNasin (promega 公司生產)，IuldNTPs (Roche 公司生產)，37°C 水浴 30min。得到的 cDNA 以針對EV71VP1 的特異性引物(EV71-F 5' -GARAGYTCTATAGGRGAYAG-3'； EV71-R 5' -AGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3，)進行 PCR 檢測，得到大小為的片段(圖 2)。2) Western blot 檢測鑑定
收集細胞溶於50ul PBS，按比例加入6X蛋白膠上樣緩衝液混勻後，95°C加熱10 min, 10% SDS-PAGE分離樣品。電泳結束後，用半乾轉移法將蛋白膠上的蛋白轉移至NC膜。 將NC膜置於含5% BSA的TBS中4°C封閉過夜。TBS-T洗滌3次(每次10 min)後，加入 1 1000稀釋的兔抗VPl血清(抗體稀釋液為TBS+0. 5% BSA) 37°C孵育2 h，洗膜3次後，加入AP標記羊抗兔IgG (1:2 500稀釋)於37°C孵育1 h後，洗滌4次，用BCIP/NBT顯色液室溫避光顯色10 min，可看到大小約97KD的條帶(圖3)。
2轉染Pl穩定表達細胞系獲取複製缺陷型病毒 (1) EV71全長cDNA克隆的構建
以QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒^jIAGEN公司生產)提取EV71基因組RNA，具體操作步驟參見產品說明書。提取的病毒RNA溶於60ulDEPC水中，取14ul，加入lulEV71 特異性引物EV71-RT
GCTATTCTGGTTATAACAAATTTACC
70 V水浴5min後立即置於冰上，加入IulMLV逆轉錄酶(promega公司生產)， 2ul 10Xbuffer, IulRNasin (promega 公司生產)，IuldNTPs (Roche 公司生產)，37°C 水浴 30min。得到EV71病毒的cDNA。以EV71cDNA為模板，用LA taq聚合酶進行全長PCR。具體操作如下取 3ulEV71cDNA,加入 IuldNTPs (Roche 公司生產)，IulLA taq 聚合酶(Takara 公司生產)， 5ullOXLA taq buffer,以及上下遊引物各Iul
RT-PCR FCTGTCGACGTCTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCAC ； RT-PCR RACCGCTATGCATGCTATTCTGGTTATAACAAATTTACC ； 補加超純水至50ul。為方便克隆，引物兩端分別引入了 Aat II和Nsi酶切位點。PCR獲得大小為7408bp 的片段(圖4)。PCR產物以PCR產物純化試劑盒(omega公司生產)純化。將純化後的PCR產物和 pGEM-T easy載體分別以Aat II (NEB公司生產)和Nsi I (NEB公司生產)酶切過夜，以PCR 產物純化試劑盒(omega公司生產)純化後加入T4連接酶(promega公司生產)連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，即得到EV71病毒的全長克隆，命名為pEV71。
(2)重組柯薩奇病毒CA16VP1基因質粒構建
根據CA16病毒VPl區基因多序列比對設計overlap-PCR引物，以overlap-PCR的方法用末端加有EV712A蛋白酶切割位點(AITTL)的CA16VP1基因替換pEV71上的Pl基因， 引物序列如下
primer-1 ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC ；
primer-2: TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT ； primer-3: ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA ； primer-4: TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTCTA ； primer-5: TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA ； primer-6 GTTCCGATACCACGGTGTC。Primer-I 和 primer-2、primer-5 和 primer-6 分別以 EV71-HB0803 株 cDNA 為模板進行PCR。用plasmid mini kit 試劑盒(omega 公司生產)從大腸桿菌 DH5 α /pT_CA16VPl 中提取質粒PT-CA16VP1，質粒上含有CA16病毒的VPl基因，以primer-3和primer-4進行 PCR。PCR產物以膠回收試劑盒純化後按1:1:1比例混合，以primerl和primer-6為上下遊引物進行overlap-PCR。overlap-PCR產物兩端帶有的SnaBI和Mil單酶切位點， 將產物片段和EV71-HB0803株全長cDNA克隆分別酶切後加入T4DNA連接酶(promega)連
9接。連接產物轉換DH5ci感受態細胞，挑單克隆接菌培養，並以質粒提取試劑盒提取質粒， 經invitrogen公司測序檢測無誤，即獲得重組CA16病毒VPl的重組質粒pEV_CA16VPl。所述大腸桿菌DH5a/pT-CA16VPl已由中國典型培養物保藏中心保藏(地址中國，武漢大學生命科學學院，武漢市武昌區八一路四9號，430072)，保藏日期是2010年12 月 31 日，保藏號是 CCTCC NO :M2010376o(3)重組質粒轉染Pl穩定表達細胞系
15ugpEV-CA16VPl以Nsi I (NEB公司生產)酶切過夜後，以氯仿異戊醇04:1)抽提兩次，用無水乙醇沉澱，並以70%乙醇洗一次，獲得的線性化DNA溶於無核酶水中。並以 RiboMAX Large Scale RNA Production Systems — T7 體外轉錄試劑盒(promega 公司生產)進行體外轉錄，具體操作步驟見產品說明書。體外轉錄後，加入DNA酶(promega公司生產)消化15min，除去其中的DNA模板，並以氯仿異戊醇04:1)抽提兩次後以無水乙醇沉澱，方法同上，即得到RNA。轉染前一天，將Pl穩定表達細胞以每皿5 X IO6個細胞的密度接種於IOcm細胞培養皿中。待細胞培養至70%-80%時，將培養基更換為新鮮的DMEM+10%FBS培養基。池後，以 6ug上述體外轉錄出的RNA轉染Pl穩定表達細胞，轉染試劑為TransMessengeKQIAGEN公司生產)，轉染後6-8 h將培養基更換為DMEM+2%FBS。96h將細胞培養物凍融三次，離心除去細胞碎片即得到EV71複製缺陷型病毒。(4)複製缺陷型病毒擴大培養將Pl穩定表達細胞以每皿5X IO6個細胞的密度接種於IOcm細胞培養皿中，加入收取的複製缺陷型病毒，吸附一個半小時後將培養基更換為新鮮的DMEM+2%FBS。72 h後收取上清中的病毒，方法同上。離心除去細胞碎片後將沈mL 含有缺陷型病毒的上清裝入SW^離心管(Beckman公司生產)中，30 000 Xg超速離心1 h (4°C)，每管沉澱用大約100 uL PBS重懸，測定濃度，分裝，用於檢測或者凍存於-80°C。(5)複製缺陷型病毒滴度測定
以複製缺陷性病毒感染Pl穩定表達細胞系。通過測定TCID50來測定病毒滴度。病毒感染Pl穩定表達細胞系後，隔2、4、6、9、12、20、28、36、48、72小時收病毒，病毒液從KT1到 10_1(1作連續10倍的稀釋。在每孔加入細胞懸液100μ1，使細胞量達到2 3X105個/ml。設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排，將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μ1。對每一稀釋度中的每一空逐日觀察細胞病變效應，並記錄結果，得到每一時間點的病毒滴度，以此繪製病毒的生長曲線(圖5)。圖中複製缺陷病毒在Pl穩定表達細胞系中的可達到IO6到108，比ΗΒ0803株稍低。3.複製缺陷型病毒的電鏡觀察
於乾淨的一次性手套上滴加10 μ L濃縮的缺陷型病毒，用專用鑷子(北京新興百瑞公司生產)將銅網(北京新興百瑞公司生產)插入假型病毒的液滴中，吸附aiiin。滴加10 UL 1% PTA負染液於乾淨的一次性手套另一處，將銅網從假型病毒的液滴中取下，濾紙條輕輕吸去多餘的液體後，將銅網插入負染液的液滴中，染色anin。將銅網從負染液中取出，吸去多餘液體，於乾燥處放置過夜，在透射電鏡(中科院武漢病毒所分析測試中心)下進行觀察， 拍照，在電鏡下可以看到大量的病毒顆粒結構(圖6)。儘管本發明的內容是結合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發明範圍的限制，本發明的範圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的範圍內對本發明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種複製缺陷型抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的製備方法，其特徵在於該方法的步驟包括構建EV71P1多聚蛋白穩定表達細胞系、構建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的 EV71病毒全長cDNA克隆、轉染Pl穩定表達細胞系獲取複製缺陷型病毒作為疫苗，具體是(1)構建EV71P1多聚蛋白穩定表達細胞系1)重組慢病毒載體質粒構建以引物Pl-SalI-Kozak-F和 Pl-NotI-R對保藏號為 CCTCC NO :V201020 的 EV71-HB0803 株全長cDNA克隆為模板進行PCR，酶切後連接到MLV逆轉錄病毒載體pFB-neo上，得到插入 Pl 的載體 pFB-neo-Pl，Pl-SalI-Kozak-F CTCCCGTCGACCCACCATGGGCTCCCAGGTCTCCACACA,Pl-NotI-R :CTCCCGCGGCCGC TTAGAGCGTAGTGATTGCCGTTC,2)假病毒包裝以pFB-neo-Pl和編碼VSVG蛋白的pLP/VSVG質粒共轉染用於包裝MLV假病毒的 GP2-293細胞，獲得假病毒，3)vero細胞G418最適篩選濃度的確定以梯度稀釋法確定vero細胞對G418最低敏感濃度，最低敏感濃度+100ug/ml即為抑制濃度，4)假病毒感染vero細胞及G418篩選陽性細胞單克隆假病毒感染24h後加入含有篩選濃度G418的培養基，獲得抗性細胞後繼續以G418篩選單克隆；篩選3輪後在G418培養基中生長較快、長勢良好的克隆，鑑定其Pl多聚蛋白表達情況，5)EV71Pl多聚蛋白穩定表達細胞系的PCR及Wfestern blot檢測鑑定提取細胞核酸和蛋白，分別用RT-PCR和Western Blot方法檢測核酸水平和蛋白水平 Pl多聚蛋白的表達，(2)獲取重組CA16VP1基因的複製缺陷型病毒1)EV71全長cDNA克隆的構建逆轉錄PCR獲取全長cDNA後克隆到pGEM_T easy載體上的T7啟動子下遊，得到EV71全長cDNA克隆pEV71，2)重組柯薩奇病毒CA16VP1基因質粒構建提取保藏號為CCTCC NO :M2010376的大腸桿菌DH5 α /pT_CA16VPl中的質粒 pT-CA16VPl，PCR獲得CA16VP1基因，並用CA16的VPl基因替換EV71全長cDNA克隆pEV71 上的Pl區，3)獲得複製缺陷型病毒帶有CA16 VPl的EV71重組子質粒體外轉錄後轉染Pl穩定表達細胞系，收取上清中的缺陷型病毒，4)複製缺陷型病毒擴大培養以獲得的缺陷型病毒感染Pl穩定表達細胞系，獲得大量的子代複製缺陷型病毒，經過上述步驟，得到的複製缺陷型病毒即為抗EV71和CA16病毒雙價疫苗。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是在假病毒包裝過程中，將GP2-293細胞於37°C、體積濃度為5%ω2細胞培養箱中，以DMEM+10%FBS培養基進行培養。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵是採用以下方法對GP2-293細胞進行培養轉染前一天，將每皿5X IO6個細胞的密度接種於IOcm細胞培養皿中；待細胞培養至70%-80%時，將培養基更換為新鮮的DMEM+10%FBS培養基；Ih後，將5ugpFB-neo_Pl和 2. 5ugpLP/VSVG共轉染用於包裝MLV假病毒的GP2-293細胞，轉染6-8 h後將培養基更換為 DMEM+2%FBS ；24h後觀察收取上清，加入新鮮培養基，4 後再次收取細胞上清；兩次上清合併後離心，除去細胞碎片，以0. 45 μ m孔徑濾器過濾，獲得整合有Pl基因的MLV假病毒。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵是在共轉染GP2-293細胞過程中，所採用的轉染試劑為磷酸鈣轉染試劑。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵是通過RT-PCR獲得EV71病毒全長cDNA， 並克隆到pGEM-T easy載體上的T7啟動子下遊，得到EV71-ΗΒ0803株全長cDNA克隆 pEV710
6.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於CA16VP1基因是通過提取大腸桿菌 DH5 α /pT-CA16VPl中的質粒pT_CA16VPl，然後進行PCR獲得。
7.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於以overlap-PCR的方法用CA16的VPl 基因替換EV71-HB0803株全長cDNA克隆pEV71上的Pl區，引物為primer-Ι ATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC，primer-2 TCATATCTGCAATGGGATCCCCCATCGCTTCGTGTTCAGCAGTAT, primer-3 :ATACTGCTGAACACGAAGCGATGGGGGATCCCATTGCAGATATGA， primer-4 :TTCCCGAGCGTAGTGATTGCCAACGTTGTTATCTTGTCTC ΤΑ, primer-5 TAGAGACAAGATAACAACGTTGGCAATCACTACGCTCGGGAA, primer-6 :GTTCCGATACCACGGTGTC。
8.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於I^rimer-I和primer-2、primer-5和 primer-6分別以EV71全長cDNA克隆pEV71為模板進行PCR，Primer-3和primer-4以 PT-CA16VP1質粒為模板PCR ；片段以膠回收試劑盒純化後按1:1:1比例混合，以I^rimer-I 和primer-6為上下遊引物進行overlap-PCR，得到overIap-PCR產物。
9.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於overlap-PCR產物兩端帶有的SnaBI 和Mil單酶切位點，將產物片段和EV71全長cDNA克隆pEV71分別酶切後加入T4DNA連接酶連接；連接產物轉換DH5 α感受態細胞，挑單克隆接菌培養，並以質粒提取試劑盒提取質粒，經invitrogen公司測序檢測無誤。
10.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所製備的複製缺陷型病毒，採用以下方法進行檢測(1)複製缺陷型病毒滴度測定以複製缺陷型感染Pi穩定表達細胞系，取時間點收病毒，有限連續稀釋測定滴度；(2)複製缺陷型病毒的檢測將濃縮的的複製缺陷型病毒製備樣品，電鏡觀察。
全文摘要
本發明是複製缺陷型抗EV71和CA16病毒雙價疫苗的製備方法，該方法包括構建EV71P1多聚蛋白穩定表達細胞系、構建以CA16VP1基因替代EV71P1基因的EV71病毒全長cDNA克隆、轉染P1穩定表達細胞系獲取複製缺陷型病毒的步驟。本發明的優點是(1)操作簡便，所需時間短，以少量複製缺陷型病毒感染穩定表達P1細胞繫到產生下一代複製缺陷型病毒只需24h；(2)複製缺陷性疫苗不能複製，安全性高；(3)產量大，產生的複製缺陷病毒滴度高達106到108；(4)直接從細胞上清收取複製缺陷病毒作為疫苗，雜質少，便於純化。
文檔編號C12N15/85GK102284058SQ20111000847
公開日2011年12月21日 申請日期2011年1月17日 優先權日2011年1月17日
發明者張萬坡, 張振峰, 李紅霞, 柯賢良, 王漢中, 鄭振華 申請人:中國科學院武漢病毒研究所