一種三聯滅活疫苗製備方法

2023-10-04 00:59:29

一種三聯滅活疫苗製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種三聯滅活疫苗製備方法，本發明製備的副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病、豬支原體肺炎三聯滅活疫苗能夠達到較好的免疫效果，同時可以達到一針多防、降低成本、減少豬只應激的目的。
【專利說明】一種三聯滅活疫苗製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及疫苗【技術領域】，具體涉及一種三聯滅活疫苗製備方法。

【背景技術】
[0002] 副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌和豬肺炎支原體是當今危害養豬業的重要病原，常作為 豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合症、豬圓環病毒病及豬流感的並發或繼發感染病原，嚴重危害我國 乃至世界養豬業的發展。
[0003] 副豬嗜血桿菌（Haemophilus Parasuis of Swine, HPS)是副豬嗜血桿菌病的病 原體，是豬上呼吸道的一種共棲菌，它可在特定條件侵入機體而引起以纖維素性多發性槳 膜炎、關節炎、腦膜炎和高熱為主要特徵的全身性疾病。副豬嗜血桿菌病又稱豬革拉澤氏 病（Glsser's Disease)，可以侵害2周齡至4月齡豬，主要在斷奶前後和保育舍階段發病， 多發於5-8周齡，發病率達40%，嚴重時高達50%。副豬嗜血桿菌血清型較複雜，按熱穩 定可溶抗原和瓊脂擴散試驗（AGPT)血清分型方法將副豬嗜血桿菌分為15個血清型，但仍 有20%分離株型特異性抗原表達量不足而不能分型。我國主要流行血清型為4、5、12、13 型（Vet Microbiol. 2005, 1:231-236)，其中血清型4、5型最為流行。由於抗生素等藥物的 濫用導致該菌的耐藥性越來越強，採用疫苗免疫成為預防副豬嗜血桿菌病經濟而有效的途 徑。在研製和開發副豬嗜血桿菌滅活苗時，顯著增強體液免疫作用的佐劑對提高疫苗的效 力十分重要。
[0004] 豬鏈球菌（Str印tococcus Suis，SS)是豬鏈球菌病的病原，屬革蘭氏陽性兼性厭 氧菌，豬鏈球菌病是一種人獸共患病。其臨床表現不同症狀：敗血症、腦膜炎、心內膜炎、肺 炎、淋巴結膿腫及多發性關節炎等。可侵害不同品種、年齡、性別豬只，大多數在3-12周齡 仔豬暴發流行，斷奶及混群時易出現發病高峰，集約化豬場尤為嚴重。豬鏈球菌根據菌體莢 膜抗原特性的不同，可以分為35個血清型（1?34型及1/2型），其中2型流行最廣，對豬 的致病性最強，其次是1型。豬鏈球菌所致的豬鏈球菌病在豬群的流行情況、發病率及死亡 率均有很大差別。發病率可以小於1 %直至大於50%，但一般不超過5%，衛生條件差及存 在並發感染時發病率升高，流行一般超過數周。近年，豬鏈球菌2型發病率有上升趨勢，弓丨 起人們的高度重視。
[0005] 豬支原體肺炎（Mycoplasmal Pneumonia of Swine, MPS)是一種慢性接觸性呼 吸道傳染病，也稱地方流行性肺炎或喘氣病。主要臨床特徵表現為咳嗽和喘氣。不同季 節不同日齡豬只均易感，多發於生長育肥階段豬只，發病豬生長緩慢、飼料報酬低下，從 而使飼養期延長。該病發病率高，死亡率低，且難以根除。豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mph)是引起豬支原體肺炎的原發性病原，當豬肺炎支原體與多殺性巴 士桿菌（Pasteurella Multocida)、豬鏈球菌（Streptococcus Suis，SS)、副豬嗜血杆 菌（Haemophilus Parasuis of Swine, HPS)或豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus Pleuropneumonia of Porcine，APP)等病原混合感染時，會引起豬地方流行性肺炎；當 豬肺炎支原體與豬繁殖與呼吸症候群病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRSV)、豬圓環病毒 2 型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2)等病原混合感染 時，又會引起豬呼吸道疾病症候群（PRDC)的發生，PRDC不僅可以引起豬的呼吸系統疾病， 同時也會導致豬的繁殖能力下降。豬肺炎支原體營養條件要求十分苛刻，一般培養基中難 以生長，其鑑定方法也非常繁瑣，且不易成功。目前，廣泛使用的疫苗株為豬肺炎支原體J 株，疫苗免疫是目前避免感染及有效防控的最有效辦法。
[0006] 細胞免疫和體液免疫是機體抵抗感染的兩大保護機制，淋巴細胞對豬肺炎支原體 抗原的特異性應答及相應細胞因子的釋放與抗豬肺炎支原體感染能力之間呈明顯正相關， 因此，豬支原體肺炎的預防中，細胞免疫應答起非常重要作用。在免疫豬支原體肺炎滅活疫 苗後，能明顯的從免疫動物血液中檢測到特異性血清IgG抗體，但研究者一致認為全身體 液免疫在豬支原體肺炎免疫過程中僅能提供有限的保護。而副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌滅活 疫苗中，促進體液免疫作用的佐劑對提高疫苗的效力十分重要，因此製備副豬嗜血桿菌病、 豬鏈球菌病、豬支原體肺炎三聯滅活疫苗，篩選佐劑時應同時兼顧其對細胞免疫和體液免 疫的刺激能力。
[0007] 目前，市場上使用的疫苗只有單一的或二聯的預防副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病 或豬支原體肺炎的滅活苗或活疫苗，而這三種病中的一種或幾種通常與豬瘟、豬藍耳病、豬 圓環病等並發或繼發感染，或者這三種病的混合感染，市售商品疫苗需多次免疫，成本高， 對豬的應激較大。另外，同時預防副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎的滅活疫 苗，國內外還未見有報導。因此，需要發明一種新的能同時預防副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌 病和豬支原體肺炎的三聯滅活疫苗及其製備方法以解決當前面臨的問題。


【發明內容】

[0008] 本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種三聯滅活疫苗製備方法，以實現 通過該方法製備的產品對副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌和豬肺炎支原體均產生免疫作用，從而 起到更加可靠的預防作用。
[0009] 為實現以上技術目的，本發明採用以下技術方案：
[0010] 一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於包括以下步驟：
[0011] 1)分別培養副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型及豬肺炎支原 體，製備得到活菌液；
[0012] 2)利用甲醛分別對步驟1)製備得到的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬 鏈球菌2型及豬肺炎支原體進行滅活；
[0013] 3)利用超濾方法對步驟2)滅活後的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬 鏈球菌2型及豬肺炎支原體進行濃縮，後經生理鹽水重懸浮菌體，再分別調整菌體濃度至 10 7 ?1012CFU/mL ;
[0014] 4)取步驟3)調整濃度後的副豬嗜血桿菌4型菌液、副豬嗜血桿菌5型菌液、豬鏈 球菌2型菌液、豬肺炎支原體菌液以（1?2) : (1?2) : (1?2) : (1?2) (v/v)的比例混勻 得到混合抗原溶液；
[0015] 5)取步驟4)得到的混合抗原溶液與疫苗佐劑混合製得三聯滅活疫苗。
[0016] 優選的，步驟1)培養豬肺炎支原體的培養基為以下配方：牛心浸出液300份；雙 蒸水360份；Hank's溶液40份；0. 25 (w/v)酚紅10份；馬血清200份；5% (w/v)水解乳蛋 白100份；25% (w/v)酵母浸出液20份；10萬單位青黴素10份。
[0017] 優選的，步驟1)培養豬肺炎支原體的培養基製備方法如下：取配方量的牛心浸出 液、雙蒸水混勻，將其pH值調至7. 2?7. 6,滅菌，再加入無菌的配方量的Hank' S溶液、酚 紅、馬血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青黴素混勻。
[0018] 優選的，步驟5)具體包括以下流程：取權利要求1步驟4)所述的混合抗原溶液， 向其中加入吐溫80、左旋咪唑、黃芩多糖、殼多糖的其中一種完全溶解即為水相；取白油佐 劑與上述水相以（55%?45% ) : (45%?55% ) (v/v)的比例混合乳化，乳化過程中或乳化 前加入硫柳汞，即得到三聯滅活疫苗。在此基礎上可以進行一下優選：優選的，所述白油佐 劑製備方法為：取司本80與白油按（3?6) : (94?97) (v/v)的比例混合，再向該混合物中 加入1.5?2.5% (v/v)的硬脂酸鋁，加熱熔化混勻，高壓滅菌。優選的，所述水相的製備具 體包括以下流程：向混合抗原溶液中加入2?8% (v/v)的吐溫80混勻至完全溶解即為水 相。優選的，所述水相的製備具體包括以下流程：向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋 咪唑終濃度200mg/mL，即為水相。優選的，所述水相的製備具體包括以下流程：向混合抗原 溶液中加入黃芩多糖，至黃岑多糖終濃度為335mg/mL，即為水相。優選的，所述水相的製備 具體包括以下流程：向混合抗原溶液中加入殼多糖，至終濃度為10mg/mL，即為水相。
[0019] 優選的，步驟5)具體包括以下流程：取權利要求1步驟4)所述的混合抗原溶液， 以4?16% (v/v)的比例向其中加入GEL 01 ST佐劑混勻，即得到三聯滅活疫苗；
[0020] 副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病、豬支原體肺炎三聯滅活疫苗與市售的副豬嗜血杆 菌滅活疫苗、豬鏈球菌病滅活疫苗及豬支原體肺炎滅活疫苗相比，相應病原的免疫保護力 基本相當，但可以達到一針多防、降低成本、減少豬只應激的目的。

【具體實施方式】
[0021] 實施例1 一種三聯滅活疫苗製備方法
[0022] -種副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病、豬支原體肺炎三聯滅活疫苗的製備方法，其步 驟如下：
[0023] i生產菌種製備
[0024] 1. 1 一級種子繁殖
[0025] 將副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型凍幹菌種，分別劃線接種 於TSA/NAD平板上，37 °C培養18?24小時，挑取單菌落接種於TSB/NAD液體培養基中，37 °C 培養12?16小時，為一級種子；豬肺炎支原體凍幹菌種劃線接種於固體培養基上，37°C培 養7日，挑取單菌落接種斜面固體培養基上，37°C培養7日，為一級種子。
[0026] 1. 2二級種子繁殖
[0027] 將製備的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型一級種子按1 %的 體積比接入TSB/NAD培養基中，37°C培養12?16小時，按現行《中國獸藥典》附錄進行純 粹檢驗，合格後作為二級種子；將製備的豬肺炎支原體一級種子按體積比1 %接入到液體 培養基中，37°C培養7日，按現行《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗，合格後作為二級種子。
[0028] 2抗原製備
[0029] 2. 1菌液製備
[0030] 將鑑定合格的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型二級種子按 1 %體積比接種到TSB/NAD培養基中，37°C培養18小時；將鑑定合格的豬肺炎支原體二級種 子按1%體積比接入到液體基礎培養基中，37°C培養24小時。
[0031] 上述製得菌液分別進行純粹檢驗及活菌計數，按現行《中國獸藥典》附錄進行檢 驗，應純粹。
[0032] 2. 2抗原滅活
[0033] 將檢驗合格的菌液，按菌液總量的0. 3%加入甲醛溶液，37°C滅活24?48小時，期 間每隔2?3小時攪拌一次，每次3?5分鐘，滅活後取樣，按現行《中國獸藥典》附錄進行 滅活檢驗，應無細菌生長。
[0034] 2. 3抗原濃縮
[0035] 將檢驗合格的滅活抗原經中空纖維素超濾濃縮，根據滅活前活菌計數結果用生理 鹽水將滅活抗原濃度調整為1. 〇*l〇lclCFU/mL或1. (^KTCXU/mL。取樣做無菌檢驗，應無細 菌生長。
[0036] 3 配苗
[0037] 3. 1副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎三聯白油佐劑滅活疫苗配置
[0038] 將滅活的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型、豬肺炎支原體抗 原濃縮-重懸稀釋液按1 : 1 : 1 : 1體積比混勻作為水相，與白油佐劑按體積比1 : 1 混合乳化，混合乳化前按體積比加入〇. 01 %的硫柳汞，製得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和 豬支原體肺炎水包油白油佐劑疫苗。
[0039] 3. 2副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎三聯左旋咪唑白油佐劑滅活疫 苗配置
[0040] 將滅活的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型、豬肺炎支原體抗 原濃縮-重懸稀釋液按1 : 1 : 1 : 1體積比混勻作為水相，將左旋咪唑母液加入到抗原 混合液中，使其最終免疫劑量l〇〇mg/頭份，與白油佐劑按體積比1 : 1混合乳化，混合乳化 前按體積比加入〇. 01 %的硫柳汞，製得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎水包 油型左旋咪唑白油佐劑疫苗。
[0041] 3. 3副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎三聯黃芩多糖白油佐劑滅活疫 苗配置
[0042] 將滅活的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型、豬肺炎支原體抗 原濃縮-重懸稀釋液按1 : 1 : 1 : 1體積比混勻作為水相，將黃芩多糖母液加入到抗原 混合液中，使其最終免疫劑量lg/頭份，與白油佐劑按體積比1 : 1混合乳化，混合乳化前 按體積比加入0. 01 %的硫柳汞，製得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎水包油 型黃芩多糖白油佐劑疫苗。
[0043] 3. 4副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎三聯殼多糖白油佐劑滅活疫苗 配置
[0044] 將滅活的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型、豬肺炎支原體抗 原濃縮-重懸稀釋液按1 : 1 : 1 : 1體積比混勻作為水相，將殼多糖母液加入到抗原混 合液中，使其最終免疫劑量l〇〇mg/頭份，與白油佐劑按體積比1 : 1混合乳化，混合乳化前 按體積比加入0. 01 %的硫柳汞，製得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎水包油 型殼多糖白油佐劑疫苗。
[0045] 3. 5副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎三聯GEL佐劑滅活疫苗配置
[0046] 將滅活的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型、豬肺炎支原體抗 原濃縮-重懸稀釋液按1 : 1 : 1 : 1體積比混勻作為抗原混合液，按10 %體積比加入GEL 01 ST佐劑，大槍吹勻，製成水佐劑的副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病和豬支原體肺炎三聯GEL 佐劑滅活疫苗。
[0047] 3. 6無菌檢驗
[0048] 取上述配製疫苗按現行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗，應無細菌生長。
[0049] 4 分裝
[0050] 定量分裝，加塞，密封，2?8°C保存。
[0051] 實施例2 :實施例1製備的疫苗安全性研究
[0052] 取實施例1中製備的疫苗各肌肉注射4?5周齡健康易感斷奶仔豬，每頭2mL (含 1頭份），每種疫苗注射5頭，對照組5頭，2周後，以相同方法及相同劑量進行二免，觀察2 周，應無局部或全身不良反應且全部健活。結果見表1。
[0053] 表1安全性研究結果
[0054]

【權利要求】
1. 一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於包括以下步驟： 1) 分別培養副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球菌2型及豬肺炎支原體，制 備得到活菌液； 2) 利用甲醛分別對步驟1)製備得到的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球 菌2型及豬肺炎支原體進行滅活； 3) 利用超濾方法對步驟2)滅活後的副豬嗜血桿菌4型、副豬嗜血桿菌5型、豬鏈球 菌2型及豬肺炎支原體進行濃縮，後經生理鹽水重懸浮菌體，再分別調整菌體濃度至10 7? 1012CFU/mL ； 4) 取步驟3)調整濃度後的副豬嗜血桿菌4型菌液、副豬嗜血桿菌5型菌液、豬鏈球菌 2型菌液、豬肺炎支原體菌液以（1?2) : (1?2) : (1?2) : (1?2) (v/v)的比例混勻得到 混合抗原溶液； 5) 取步驟4)得到的混合抗原溶液與疫苗佐劑混合製得三聯滅活疫苗。
2. 根據權利要求1所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟1)培養豬肺炎 支原體的培養基為以下配方： 牛心浸出液300份； 雙蒸水360份； Hank' s溶液40份； 0. 25 (w/v)酚紅 10 份； 馬血清200份； 5% (w/v)水解乳蛋白100份； 25% (w/v)酵母浸出液20份； 10萬單位青黴素10份。
3. 根據權利要求1所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟1)培養豬肺炎 支原體的培養基製備方法如下：取配方量的牛心浸出液、雙蒸水混勻，將其pH值調至7. 2? 7. 6,滅菌，再加入無菌的配方量的Hank' s溶液、酚紅、馬血清、水解乳蛋白、酵母浸出液、青 黴素混勻。
4. 根據權利要求1所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟5)具體包括以 下流程： 取權利要求1步驟4)所述的混合抗原溶液，向其中加入吐溫80、左旋咪唑、黃芩多糖、 殼多糖的其中一種完全溶解即為水相； 取白油佐劑與上述水相以（55 %?45 % ) : (45 %?55 % ) (v/v)的比例混合乳化，乳化 過程中或乳化前加入硫柳汞，即得到三聯滅活疫苗。
5. 根據權利要求4所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於所述白油佐劑製備 方法為：取司本80與白油按（3?6) : (94?97) (v/v)的比例混合，再向該混合物中加入 1.5?2. 5% (v/v)的硬脂酸鋁，加熱熔化混勻，高壓滅菌。
6. 根據權利要求4所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於所述水相的製備具 體包括以下流程：向混合抗原溶液中加入2?8% (v/v)的吐溫80混勻至完全溶解即為水 相。
7. 根據權利要求4所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於所述水相的製備具 體包括以下流程：向混合抗原溶液中加入左旋咪唑，至左旋咪唑終濃度200mg/mL，即為水 相。
8. 根據權利要求4所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於所述水相的製備具 體包括以下流程：向混合抗原溶液中加入黃芩多糖，至黃岑多糖終濃度為335mg/mL，即為 水相。
9. 根據權利要求4所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於所述水相的製備具 體包括以下流程：向混合抗原溶液中加入殼多糖，至終濃度為10mg/mL，即為水相。
10. 根據權利要求1所述的一種三聯滅活疫苗製備方法，其特徵在於步驟5)具體包括 以下流程： 取權利要求1步驟4)所述的混合抗原溶液，以4?16% (v/v)的比例向其中加入GEL 01 ST佐劑混勻，即得到三聯滅活疫苗；
【文檔編號】A61P31/04GK104208667SQ201410448846
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月4日 優先權日:2014年9月4日
【發明者】厚華豔, 呂茂傑, 楊保收, 盛長忠, 梁武 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司