一種黃牛klf7基因的單核苷酸多態性檢測方法

2023-10-17 02:58:24

專利名稱：一種黃牛klf7基因的單核苷酸多態性檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及 一種檢測黃牛KLF7基因外顯子2及其側翼區的單核苷酸多態性的檢測方法。
背景技術：
單核苷酸多態性(SNP)就是指基因組DNA序列中由於單個核苷酸(A/T/C/G)的替 換而引起的多態性。因此，通常所說的SNPs包括鹼基的替換、插入、缺失以及重複序列拷貝 數的變化。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個鹼基的轉 換或者顛換所引起；具有轉換型變異的SNPs約佔2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫 去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，根據它們在 基因組中分布的位置可分為基因編碼區SNPs (cSNPs)、基因周邊SNPs (pSNPs)和基因間 SNPs(iSNPs)等三類。總的說來，cSNP比較少，因為在外顯子內的變異率僅佔周圍序列的 1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關注。根據對遺傳性狀的影響， cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變並不影響其所翻譯的 蛋白質中胺基酸序列，突變鹼基與未突變鹼基的「含義」相同；另一種是非同義cSNPs，即鹼 基序列的改變將導致編碼胺基酸的改變，從而產生蛋白質序列的改變，可能最終影響到蛋 白質的功能。因此，對編碼區SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要 影響；尤其對於無義密碼子突變來說，更可能會導致所編碼的蛋白發生重大變化，從而影響 它的功能發揮，對個體的表現型產生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作 為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。由於SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs 可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見， 故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要採用幾種不同的路線來發現 SNPs 即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核 苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法， 但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非 常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用於生產實際的理想SNP檢 測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是， PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也並非 理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具 有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時， 檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷 酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數儀、基因晶片、微球陣列技術和質譜儀等檢測 平臺，對於一般的分子實驗室來說可實施性不強。
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RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點後引入限制性內切酶 進行切割，然後進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑑別SNP位點。RFLP-PCR方 法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢 測的序列位點無特殊性要求。脂肪組織在維持能量穩態具有重要的作用，脂肪代謝對於維持正常的生理活動具 有重要的作用。脂肪組織分泌的脂肪激酶，在許多生理過程如採食、葡萄糖代謝、繁殖、胰島 素易感性、和血管發生等方面發揮重要功能；而這些都與動物的生長密切相關。Krupple-Iike factor (KLF)轉錄因子家族在C端具有的三個連續的C2H2鋅指能 特異結合在富含GC的靶基因的啟動子上，從而活化或抑制靶基因的表達，具有廣泛的生物 學作用，包括細胞增殖，分化和發育，並參與脂肪代謝。KLF7屬於KLF家族，廣泛表達於脂肪細胞和各種人類組織包括胰臟、骨骼肌和肝 髒。在脂肪細胞中過表達KLF7會抑制脂肪形成，尤其抑制adiponectin基因在脂肪細胞中 的表達，但綠茶中的多酚-兒茶素能明顯增強adiponectin基因的表達和增加3T3-L1脂肪 細胞的葡萄糖攝取量，並伴隨KLF7的表達下調。嗎啡被發現能在轉錄和轉錄後水平上調 KLF7的表達。人類KLF7基因位於染色體2q32，被報導是一個與糖尿病或代謝相關的位點， 而且KLF7能調節脂肪細胞、胰臟β細胞和骨骼肌細胞的功能，另外它被確定含有一個可以 判定二型糖尿病易感性的等位基因。最近，KLF7基因的A等位基因(rs2302870)在一個日 本人群體中被確定與二型糖尿病相關，它的另一個A等位基因(rs7568369)被確定與肥胖 有關。以上研究提示KLF7在能量代謝的調控中具有重要作用。截至2010年1月，國內外尚無黃牛KLF7基因遺傳變異及其與經濟性狀關係的研 究報導。由於目前中國黃牛KLF7基因遺傳變異領域的研究匱乏，使該基因位點的功能研究 及該基因遺傳變異與生長發育等性狀關聯，以及將其應用於分子遺傳標記和分子育種的研 究還處於空白狀態。

發明內容
本發明解決的問題在於提供一種黃牛KLF7基因的單核苷酸多態性檢測方法，該 方法能夠檢測黃牛KLF7基因外顯子2及其側翼區的單核苷酸多態性，將其多態性分析與性 質關聯後用於中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)。本發明是通過以下技術方案來實現一種快速檢測黃牛KLF7基因單核苷酸多態性的方法，包括以下步驟以包含KLF7基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對PI、P2、P3等摩爾比 的混合物為引物，PCR擴增黃牛KLF7基因；用限制性內切酶TaqI消化PCR擴增產物之後， 再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛KLF7基 因第41401、42025、42075位的單核苷酸多態性；所述的引物對Pl為上遊引物 Fl :tgcttctgat ggctgtttct c ；下遊弓I物 Rl :aggaaacagt ccaagtcctc ate ；所述的引物對P2為上遊弓丨物 F2 :acggcacagt gacgttgaa ；
下遊弓丨物 R2 :gaacagagag aagcccttcc cccctc ；所述的引物對P3為Jni^KlJFS=CtgttCCgag aagtggcatc catgccatc ；下遊弓I物 R3 :actacaccaa ggctggcact。所述的PCR擴增反應程序為95°C預變性5min ；94°C變性30s，57. 0°C退火35s， 72°C延伸35s，30 35個循環；72°C延伸lOmin。所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳。所述的根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛KLF7基因的單核苷酸多態性為第41401位的多態性為=C1C1基因型表現為104和24bp條帶，C1T1基因型表現為 128、104和24bp條帶，T1T1基因型表現為128bp條帶；第42025位的多態性為=T2T2基因型表現為337bp條帶，T2C2基因型表現為337、 310和27bp條帶，C2C2基因型表現為310和27bp條帶；第42075位的多態性為=A3A3基因型表現為182bp條帶，A3G3基因型表現為182、 154和28bp條帶，G3G3基因型表現為154和28bp條帶。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明公開了與黃牛生長性狀相關的功能基因KLF7外顯子2及其側翼區的3個位 點的單核苷酸多態性，這3個單核苷酸多態性能夠作為一個分子遺傳標記，利用標記位點信 息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。針對上述位點的SNP多態性，本發明還公開了其檢測方法，通過設計特定的PCR引 物擴增片段，能夠用RFLP方法簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態性。本發明對KLF7基因的SNP進行了基因分型和基因頻率分析，以及與南陽牛不同生 長階段的生長性狀之間進行了性狀關聯分析；結果表明KLF7基因尤其是P2檢測SNP位點 可用作黃牛生長性狀早期選擇(6月齡和12月齡)的分子標記。本發明提供的檢測方法為KLF7基因的SNP與黃牛的生長性狀關係的建立奠定了 基礎，以便用於中國黃牛用生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。


圖」乾牛KLF7基因第二外顯子及其側翼區擴增電泳圖2 j乾牛KLF7基因Pl檢測SNP位點擴增序列圖3 j乾牛KLF7基因Pl檢測SNP位點酶切結果電泳圖4 j乾牛KLF7基因P2檢測SNP位點擴增序列圖5 j乾牛KLF7基因P2檢測SNP位點酶切結果電泳圖6 j乾牛KLF7基因P3檢測SNP位點擴增序列圖」乾牛KLF7基因P3檢測SNP位點酶切結果電泳圖8 j乾牛KLF7基因PI、P2和P3檢測SNP位點酶切結果電泳圖
圖9 j乾牛KLF7基因PI、P2和P3檢測SNP位點測序圖。
具體實施例方式
以下通過對黃牛樣本採集及基因組DNA提取、檢測、純化與濃度分析、黃牛KLF7基因外顯子2及其側翼區的PCR擴增、黃牛KLF7基因外顯子2及其側翼區DNA片段的TaqI CRS-PCR-RFLP分析實施例來進一步說明本發明技術及其效果。所述是對本發明的解釋而不 是限定。a、黃牛KLF7基因部分DNA序列的克隆及其多態性的檢測1、黃牛血樣的採集及處理取黃牛血樣10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次後放入冰 盒，-80°C保存備用。本發明採用了 4個黃牛品種共計1002個無血緣關係的母牛血樣，具體為(1)南陽牛血樣分別從251頭6 24月齡的純種南陽牛採集，採自河南省南陽 市；(2)秦川牛血樣分別從228頭4月齡的純種秦川牛採集，採自陝西大荔縣；(3)郟縣紅牛血樣分別從439頭成年郟縣紅牛採集，採自河南省郟縣；(4)中國荷斯坦奶牛血樣分別從84頭成年中國荷斯坦奶牛採集，採自陝西草灘 農場奶牛場。2、血樣基因組DNA的提取、純化(1)將冷凍血樣室溫解凍，轉移500 μ L至1. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩 衝液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C )，棄去上清液，重複上述步驟至上清液透明、
沉澱呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩衝液500 μ L，搖動，使血細胞沉澱脫離離心管管 壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提緩衝液的配製0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超純水500mL，滅菌，調pH至8. 0，4°C保存備用。(3)加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)並混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加 ι μ L蛋白酶κ混勻繼續消化至澄清。(4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另一 1. 5mL離心管中，重複一次。(5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另 一 1. 5mL離心管中。(6)加0. 1倍體積的NaAc緩衝液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉動離心管 直至白色的絮狀沉澱析出，_20°C保存30 60min。(7)4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70 %的冰冷乙醇漂洗DNA沉澱2次。(8) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發乾淨。(9)乾燥後的DNA溶於80 100 μ L的TE-緩衝液或超純水，4°C保存直至DNA完 全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-80°C保存。(10) 500μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1%，加入蛋白酶K至終 濃度達到50 μ g/mL。(11) 5°C保溫 IOh 左右。(12)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 1)和氯仿分別抽提一次。(13) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。
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(14)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉澱DNA。(15)倒掉液體，70%乙醇洗滌後晾乾，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待檢測。3、DNA池的構建(1) 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測選部分DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降 解的樣品進行DNA池的構建。(2) OD 值測定用紫外光光度計測定DNA樣品在260歷、280歷處的OD值，並計算DNA含量和OD26tl/ OD280的比值。如0D26(i/0D28(i比值小於1. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質或酚，則應進行純 化；若比值大於1.8，則應該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(μ g/mL) = 50 X OD260 值 X 稀釋倍數(3)品種DNA池的構建DNA檢測完畢後，取出一定的量稀釋至50ng/μ L，然後從秦川牛品種100個個體、 濃度為50ng/ μ L DNA的樣品中取10 μ L混合構建成品種DNA池；按照同樣的方法也構建南陽牛、郟縣紅牛和中國荷斯坦奶牛DNA池。4、PCR擴增引物設計根據GenBank公開的牛基因組序列為參考，具體根據No. NC_007300序列設計引物 擴增KLF7基因的外顯子2及其側翼區的序列，其引物對序列P如下上遊引物 Fl :tgcttctgat ggctgtttct c 21;下遊弓丨物 R3 :actacaccaa ggctggcact20;該對引物能夠擴增KLF7基因第41297bp到第42227bp的931bp的基因片段。5、PCR克隆黃牛KLF7基因分別以4個黃牛品種的DNA池為模版，以引物對P為引物進行PCR擴增，PCR總反 應體系為25 μ L，見表1 ；PCR總反應程序，見表2。表IPCR反應體系
體系成分體積(UL)10 X PCR 緩衝液(MBI)2. 50MgCl2 (25mmol/L)1. 50dNTPs(2. 5mmol/L)2. 50上遊引物(lOpmol/L)0. 25下遊引物(lOpmol/L)0. 25Taq DNA 聚合酶(0. 5U/ μ L)2. 00
7DNA 模板(50ng/ μ L)1. 00滅菌超純水(H2O)15. 00總體積25. 00表2 PCR反應程序
克隆測序PCR程序RFLP-PCR 程序循環次數95 °C預變性5 min95 °C預變性5 min94 變性30 s94 °C變性30 sJ> 35個循環57 退火30 s56.5 °C退火35 s72 延伸30 s72 °C延伸35 s72 °C延伸10 min72 °C延伸10 min6、PCR產物純化和測序PCR擴增完成之後進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示，可以清楚看到 931bp的條帶，說明目的基因克隆成功；然後進行PCR產物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片 段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然後用PCR產物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純 化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下 (1)首先向吸附柱中加入500 μ L平衡液BL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入乾淨的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60°C水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上 下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中 的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入70(^1^票洗液，1200017/1^11離心11^11，倒掉廢液，將吸附柱重 新放入收集管中。(6)向吸附柱中加入50(^1^票洗液，1200017/1^11離心11^11，倒掉廢液，將離心吸附 柱放入收集管中，12000r/min離心2min，儘量除去漂洗液。將吸附柱置於室溫或50°C溫箱 數分鐘，徹底晾乾。(7)將吸附柱放到一個乾淨的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫 緩衝液，室溫放置2min。12000r/min離心lmin收集DNA溶液。(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重複步 馬聚7 ο
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把以上四個黃牛品種DNA池為模板的PCR純化產物送上海生物工程有限公司進行 雙向測序；黃牛KLF7基因的外顯子2及其側翼區931bp長度的片段的測序結果如SEQ ID NO. 1所示，序列當中第1位的鹼基相當於KLF7基因第41297位。對測序峰圖進行分析，其中在同一位點有兩個不同峰是發生了單核苷酸突變；位 於黃牛的KLF7基因第41401、42025、42075位(分別相當於SEQ IDN0. 1第105、729、779位) 出現單核苷酸突變，其多態性分別為C/T、T/C、A/G ；即篩查到黃牛KLF7基因的3個SNP多 態性。b、黃牛KLF7基因的外顯子2及其側翼區單核苷酸多態性的PCR-RFLP檢測(1)上述的3個SNP多態性的序列變化為當第41401位點發生C > T突變時，即C突變為T，使原來的序列TCGG也相應的突 變成TTGG ；當第42025位點發生T > C突變時，即T突變為C，使原來的序列TTGT也相應的突 變成TCGT ；當第42075位點發生A > G突變時，即A突變為G，使原來的序列ACAA也相應的突 變成ACGA ；(2)本發明對於上述3處SNP的檢測，通過PCR-RFLP檢測方法實現SNP的檢測，通 過定點錯配使得在3處SNP位點周圍的序列形成特定的序列TCGA，這樣就能夠通過限制性 內切酶TaqI進行識別，具體為利用PCR克隆定點錯配技術，在PCR擴增KLF7基因序列時，使得第41403位由G 定點錯配為A，使原來的序列TCGG克隆為TCGA，成為限制性內切酶TaqI能夠識別的序列， 當第41401位點發生C > T突變時，克隆序列為TTGA，此時限制性內切酶TaqI不能識別該 序列；如圖2所示，左向箭頭、右向箭頭分別表示上遊引物、下遊引物，通過下遊引物的錯配 實現包含SNP位點的特定序列的克隆，方框顯示的tCgA為TaqI識別序列；本發明通過設計的引物對Pl來實現41403位的定點錯配，引物對Pl為上遊引物 Fl :tgcttctgat ggctgtttct c 21;下遊弓丨物 Rl :aggaaacagt ccaagtcctc ate 23;以引物對Pl為引物，以黃牛基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物擴增體系 和反應條件分別如同表1和表2所述；將PCR擴增的目的片段用TaqI消化，將酶切後的擴 增片段進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100V，時間為0. 5 Ih ；電泳完成後EB染 色，待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Gel Doc XR+凝膠成像系統成像，結果如圖3 所示泳道C1C1表示未突變的純合子，錯配克隆後的兩條染色體都能夠能被酶切識別，而切 除的24bp片段太小，電泳沒有顯示，所以表現為104bp的條帶；泳道C1T1表示發生突變的 雜合子，即錯配克隆後的其中的一條染色體發生了突變，不能夠被酶切識別，同樣由於24bp 片段太小，所以表現為128bp、104bp的條帶；泳道T1T1表示發生突變的純合子，錯配克隆後 的兩條染色體都不能夠能被酶切識別，所以表現為128bp的條帶。(3)利用PCR克隆定點錯配技術，在PCR擴增KLF7基因序列時，使得第42027位由 T定點錯配為A，使原來的序列TTGT克隆為TTGA，此時限制性內切酶TaqI不能識別該序列， 而當42025位點發生T > C突變時，克隆序列為TCGA，限制性內切酶TaqI就能識別發生突 變的序列；如圖4所示，左向箭頭、右向箭頭分別表示上遊引物、下遊引物，通過下遊引物的錯配實現包含SNP位點的特定序列的克隆，方框顯示的tTgA存在tCgA的多態性，當發生突 變時，成為TaqI識別的序列；本發明通過設計的引物對P2來實現42027位的定點錯配，引物對P2為上遊弓丨物 F2 :acggcacagt gacgttgaa19;下遊弓丨物 R2 :gaacagagag aagcccttcc cccctc 26;以引物對P2為引物，以黃牛基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物擴增體系 和反應條件分別如同表1和表2所述；將PCR擴增的目的片段用TaqI消化，將酶切後的擴 增片段進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100V，時間為0. 5 Ih ；電泳完成後EB染 色，待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Gel Doc XR+凝膠成像系統成像，結果如圖5 所示泳道C2C2表示突變的純合子，錯配克隆後的兩條染色體都不能夠能被酶切識別， 而切除的27bp片段太小，電泳沒有顯示，所以表現為310bp的條帶；泳道C2T2表示發生突 變的雜合子，即錯配克隆後的其中的一條染色體發生了突變，不能夠被酶切識別，同樣由於 27bp片段太小，所以表現為337bp、310bp的條帶；泳道T2T2表示未發生突變的純合子，錯配 克隆後的兩條染色體都不能夠能被酶切識別，所以表現為337bp的條帶。(4)利用PCR克隆定點錯配技術，在PCR擴增KLF7基因序列時，使得第42073位由 A定點錯配為T，使原來的序列ACAA克隆為TCAA，此時限制性內切酶TaqI不能識別該序列， 當第42075位點發生A > G突變時，克隆序列為TCGA，限制性內切酶TaqI就能識別發生突 變的序列；如圖6所示，左向箭頭、右向箭頭分別表示上遊引物、下遊引物，通過上遊引物的 錯配實現包含SNP位點的特定序列的克隆，方框顯示的TcAa為錯配的序列，存在TcGa的多 態性，當發生突變時，成為TaqI識別的序列；本發明通過設計的引物對P3來實現42027位的定點錯配，引物對P3為上遊弓丨物 F3 :ctgttccgag aagtggcatc catgccatc 29;下遊弓I物 R3 :actacaccaa ggctggcact20。以引物對P3為引物，以黃牛基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物擴增體系 和反應條件分別如同表1和表2所述；將PCR擴增的目的片段用TaqI消化，將酶切後的擴 增片段進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100V，時間為0. 5 Ih ；電泳完成後EB染 色，待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Gel Doc XR+凝膠成像系統成像，結果如圖7 所示泳道G3G3表示突變的純合子，錯配克隆後的兩條染色體都不能夠能被酶切識別， 而切除的28bp片段太小，電泳沒有顯示，所以表現為154bp的條帶。泳道A3G3表示發生突 變的雜合子，即錯配克隆後的其中的一條染色體發生了突變，不能夠被酶切識別，同樣由於 28bp片段太小，所以表現為182bp、154bp的條帶；泳道A3A3表示未發生突變的純合子，錯配 克隆後的兩條染色體都不能夠能被酶切識別，所以表現為182bp的條帶。(5)雖然931bp的克隆片段當中在SEQ ID NO. 1的第151_154bp還存在一個TaqI 識別序列(TCGA)，但經過對照試驗(同時檢測3個SNPs與分別檢測每個SNP之間對比分 析)，發現對照組與試驗組在SNP位點酶切後的電泳檢測片段大小結果完全一致。這樣就能 夠通過限制性內切酶TaqI同時對3個SNPs進行識別，提高檢測效率；具體為以引物對P1、P2、P3等比例的混合物為引物，以黃牛基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物擴增體系和反應條件分別如同表1和表2所述；將PCR擴增的目的片段用TaqI 消化，將酶切後的擴增片段進行3. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100V，時間為0. 5 Ih ； 電泳完成後EB染色，待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在Gel Doc XR+凝膠成像系統 成像，顯示結果如圖8所示，根據電泳條帶的分布判定其基因型如表3所示表3根據電泳結果判定基因型
Pl檢測位點P2檢測位點P3檢測位點泳道^mml 電泳片段人小 基I大丨剛 ,、 (bp)基_電泳，段人小 (bp)電泳片段人小 (bp)泳道1C1C1 104/24T2T2337A3A3182泳道IIC1T1 128/104/24T2C2337/310/27A3G3182/154/28泳道IIIT1T1 128C2C2310/27G3G3154/28其中切除的24、27和28bp片段太小，電泳沒有顯示，所以泳道I表現為Pl檢測SNP 位點154bp (C1C1)的條帶，P2檢測SNP位點337bp (T2T2)的條帶，P3檢測SNP位點337bp (A3A3) 的條帶；泳道II表現為Pl檢測SNP位點128和ICMbp(C1T1)的條帶，P2檢測SNP位點337 和3IObp (T2C2)的條帶，P3檢測SNP位點182和154bp (A3G3)的條帶；泳道III表現為Pl 檢測SNP位點128bp (T1T1)的條帶，P2檢測SNP位點310bp (C2C2)的條帶，P3檢測SNP位點 154bp (G3G3)的條帶；根據條帶的數目和條帶的大小，圖8所示的凝膠電泳檢測結果能夠很清楚的判定 是否發生了點突變，將3個SNP位點的三種基因型區分開，從而檢測其SNP多態性。(6)不同基因型個體PCR產物的測序驗證利用ABI 377和ABI 3730測序儀對不同基因型個體PCR產物分別進行正反雙向 測序，進行SNP位置分析；結果如圖9所示，在SNP位點處存在多態性，尤其是發生突變的雜 合子更為明顯，C1T1基因型Pl檢測SNP位點處、T2C2基因型P2檢測SNP處、A3G3基因型P3 檢測SNP位點處均為雙峰。c、黃牛KLF7基因的SNP作為分子標記在不同黃牛群體中的應用1、群體多態性中的診斷利用上述的SNP多態性檢測方法對秦川牛228份DNA樣品、南陽牛251份DNA樣 品、郟縣紅牛439份DNA樣品和中國荷斯坦奶牛84份DNA樣品分別進行SNP多態性的鑑定， 統計其SNP位點的基因型分布及其等位基因頻率，並對南陽牛的SNPs與生長性狀的進行關 聯分析。2、SNP位點的頻率統計分析基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數佔總個體數的比率。Paa =NAA/N，其中Paa代表某一位點的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個體數； N為檢測群體的總數量。基因頻率是指一個群體中某一基因數對其等位基因總數的相對比率。計算的公式
可以寫成PA = (2NM+NAal+NAa2+......+NAan)/2N。式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表示群
體中具有AA基因型的個體數量，NAai表示群體中具有Aai基因型個體數量，al-an為等位基
11體不同多態位點的基因型分布、等位基因頻率的統 計分析結果如表4所示。3、群體平衡性檢驗某基因位點的Hardy-Weinberg平衡性檢測採用皮爾遜x 2統計量，其公式為 其中，m為某一遺傳位點基因型應有個數；i為基因型序號A代表第i個基因型 的實際個體數量；η為樣本數量；Pi代表第i個基因型的理論頻率。等位基因在不同黃牛品種KLF7基因SNPs的基因型分布、等位基因頻率和連鎖不 平衡分析如表4所示，其中，除中國荷斯坦牛在Pl檢測SNP位點達到純合外，其它SNP位點 的等位基因頻率均大於1%，滿足SNP的要求。表4 四個牛群體不同多態位點的基因型分布、等位基因頻率利哈代溫伯格平衡
檢驗
位點(參考NCJ)07300)品種秦川牛南Pl I牛郟縣紅牛中國荷斯坦奶牛Pl檢測 SNP位點基閃型CC20315729884C41401TCT24821230TT112180等位基因C0.9430.7890.8191T0.0570.2110.1810平衡/檢驗P=O. 102/ =0.094屍=1.345--P2檢測 SNP位點基WMTTIU1192174T42025CTC1039917235CC14335045等位基閃T0.7130.6710.6900.256C0.2870.3290.3100.744平衡Z2檢驗/'=2.427屍=2.833/ =3.084P=O. 741P3檢測 SNP位點基閃項GG77941722A42075GGA13111520920AA20425862等位基閃G0.6250.6040.6300.143A0.3750.3960.3700.857平衡/檢驗P=\ 1.620P=0.455P=O. 194/ =0.063 由表4可以看出，在Pl檢測SNP位點只有中國荷斯坦奶牛處於哈代溫伯格不平衡 狀態，且只有C等位基因，說明中國荷斯坦奶牛在該位點已經達到純合；在P2和P3位點， 4個牛群體均沒有偏離哈代溫伯格平衡狀態。這些結果表明也許由於長期對產奶性狀的選
12擇，中國荷斯坦奶牛在一些位點(如Pl位點)已經達到純合狀態，而中國地方牛品種(如 秦川牛、南陽牛和郟縣紅牛)由於選育的程度低，雜合程度還比較高，也進一步說明中國地 方牛品種具有巨大的選種潛力。4、南陽牛基因效應的關聯分析生產數據南陽牛在不同生長階段(6、12、18和24月齡)的生長性狀初生重、體 重、日增重、體高、體長、胸圍和坐骨端寬關聯分析樣本有完整生長性狀記錄的南陽牛251個。關聯分析模型利用SPSS(13.0)軟體分析品種、年齡、場和基因位點等因素與經濟性狀的相關 性。先對數據進行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數據校正；根據 數據特徵，利用t分析、ANOVA或多元線性模型分析基因型效應。在數據處理中，根據影響初生重、成年體重等生長發育指標的因素不同，考慮到場 效應(Farm)、品種效應(Breed)、種公畜效應(S)、種公畜內母畜間效應(SD)、年齡(Age)和 性別效應(Sex)、基因型效應(Genotype)及相關的互作效應，採用了以下固定模型進行分 析，同時，根據實際情況進行取捨。完整模型如下yiJklmnpq = μ +Farmi+Breedj+Sp+SD^Age.+SeXi+Genotype^+eij^p,其中yijklmnM 個體表型記錄；μ 總體均值；Farmi 場別效應；Breedj 品種效應； Sp 種公畜效應；SDq 種公畜內母畜間效應；Agek 年齡效應；Sex1 性別效應；Genotypem 標記基因型效應；Χη為各種二級和二級以上互作效應，如FarmXBreed，FarmXAge, FarmX Sex, FarmXGenotype, BreedX Age, BreedX Sex, BreedXGenotype, Age X Sex, AgeXGenotype, SexXGenotype, BreedXAgeXGenogype 等；eiJkln]npq 隨機誤差；運用 SPSS (13. 0)軟體對數據進行分析，並用最小二乘法擬合線性模型，對各基因型間生產性狀 指標進行差異顯著性檢驗。分析結果如表5所示表5 KLF7基因3個位點基因型與南陽牛生長性狀的相關分析 注BW=體重(kg) ；ADG =日增重(kg) ；BL =體長(cm) ；HG =胸圍(cm)；冊=坐 骨端寬(cm)。同一行的肩標代表顯著水平P < 0. 01 (A，B)。統計結果顯示，KLF7基因與南陽牛早期生長性狀(6月齡和12月齡)顯著相關。 特別是在6月齡，攜帶基因型T2T2的牛比基因型T2C2的牛具有更大的日增重(P = 0. 009) 和胸圍(P = 0. 009)。在12月齡，基因型C2C2的牛比基因型T2C2的牛具有更大的體重(P = 0. 008)、體長(P = 0. 001)和胸圍(P = 0. 003)；基因型A3A3的牛比基因型A3G3的牛具有更大的體長(P = 0.006)。其它生長性狀數據與基因型間無顯著相關。這表明所檢測的KLF7 基因SNPs中，雜合子(T2C2和A3G3)的生長性狀較純合子(T2T2、C2C2和A3A3)差，P2和P3尤 其是P2檢測SNP位點可用作黃牛生長性狀早期選擇(6月齡和12月齡)的分子標記。
權利要求
一種快速檢測黃牛KLF7基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，包括以下步驟以包含KLF7基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3等摩爾比的混合物為引物，PCR擴增黃牛KLF7基因；用限制性內切酶TaqI消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛KLF7基因第41401、42025、42075位的單核苷酸多態性；所述的引物對P1為上遊引物F1tgcttctgat ggctgtttct c；下遊引物R1aggaaacagt ccaagtcctc atc；所述的引物對P2為上遊引物F2acggcacagt gacgttgaa；下遊引物R2gaacagagag aagcccttcc cccctc；所述的引物對P3為上遊引物F3ctgttccgag aagtggcatc catgccatc；下遊引物R3actacaccaa ggctggcact。
2.如權利要求1所述的一種黃牛KLF7基因的單核苷酸多態性檢測方法，其特徵在於， 所述的PCR擴增反應程序為95°C預變性5min ；94°C變性30s, 57. 0°C退火35s，72°C延伸 35s, 30 35 個循環；72°C延伸 lOmin。
3.如權利要求1所述的一種黃牛KLF7基因的單核苷酸多態性檢測方法，其特徵在於， 所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權利要求1所述的黃牛KLF7基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特徵在於，根 據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛KLF7基因的單核苷酸多態性為第41401位的多態性為=C1C1基因型表現為104和24bp條帶，C1T1基因型表現為128、 104和24bp條帶，T1T1基因型表現為128bp條帶；第42025位的多態性為=T2T2基因型表現為337bp條帶，T2C2基因型表現為337、310和 27bp條帶，C2C2基因型表現為310和27bp條帶；第42075位的多態性為=A3A3基因型表現為182bp條帶，A3G3基因型表現為182、154和 28bp條帶，G3G3基因型表現為154和28bp條帶。全文摘要
本發明公開了一種快速檢測黃牛KLF7基因單核苷酸多態性的方法，以包含KLF7基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3等摩爾比的混合物為引物，PCR擴增黃牛KLF7基因；用限制性內切酶TaqI消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛KLF7基因第41401、42025、42075位的單核苷酸多態性。本發明對KLF7基因的SNPs進行了基因分型和基因頻率分析，以及與南陽牛不同生長階段的生長性狀之間進行了性狀關聯分析；結果表明KLF7基因尤其是P2檢測SNP位點可用作黃牛生長性狀早期選擇(6月齡和12月齡)的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK101899500SQ201010108118
公開日2010年12月1日 申請日期2010年2月9日 優先權日2010年2月9日
發明者李轉見, 淮永濤, 王景, 胡沈榮, 藍賢勇, 陳宏 , 雷初朝, 馬亮 申請人:西北農林科技大學