一種人腦膠質瘤細胞系及其建立方法和應用的製作方法
2023-12-12 16:15:22 2
一種人腦膠質瘤細胞系及其建立方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種人腦膠質瘤細胞系及其建立方法和應用。該人腦膠質瘤細胞系保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:C201115。該人腦膠質瘤細胞系通過來自臨床標本中的腦膠質瘤細胞經原代培養和傳代培養建立，可直接用於體外藥物篩選，或在哺乳動物中產生人腦膠質瘤，建立人腦膠質瘤動物模型，用於篩選治療人腦膠質瘤的候選藥物。該人腦膠質瘤細胞系性狀穩定，可穩定多次傳代，體外傳代至第50代性狀保持穩定；可在體外、體內分析人腦膠質細胞瘤的發病機制，藥物敏感性及轉移性等相關特性，進而建立體外、體內兩個相互關聯的抗腦膠質瘤藥物篩選平臺，為人腦膠質瘤研究提供新的更接近於臨床腫瘤生物學特性的實驗材料。
【專利說明】一種人腦膠質瘤細胞系及其建立方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於細胞系領域，特別涉及一種人腦膠質瘤細胞系及其建立方法和應用。【背景技術】
[0002]生長於顱內的腫瘤通稱為腦瘤，包括由腦實質發生的原發性腦瘤和由身體其他部位轉移至顱內的繼發性腦瘤。原發性腦瘤依其生物特性又分良性和惡性。良性腦瘤生長緩慢，包膜較完整，不浸潤周圍組織及分化良好；惡性腦瘤生長較快，無包膜，界限不明顯，呈浸潤性生長，分化不良。
[0003]腦腫瘤中膠質細胞瘤發病率最高，約佔40.49%，綜合發病年齡高峰在30~40歲，或10~20歲。大腦半球發生的膠質瘤約佔全部膠質瘤的51.4%，以星形細胞瘤為最多，其次是膠質細胞瘤和少枝膠質細胞瘤,腦室系統也是膠質瘤較多的發生部位，佔膠質瘤總數的23.9%，主要為管膜瘤，髓母細胞瘤，星形細胞瘤，小腦膠質瘤佔膠質瘤總數的13%，主要為星形細胞瘤。腦膠質瘤具有發病率、復發率、死亡率高和治癒率低等「三高一低」的特點。近幾十年來，原發性惡性腦腫瘤發生率逐年遞增，中老年人群尤為明顯。據文獻報導，中國腦膠質瘤年發病率為3~6人/10萬人。在目前的技術條件下，膠質瘤特別是惡性度高的膠質瘤預後還很不樂觀。美國最新資料顯示，在所有膠質細胞瘤中佔半數的膠質母細胞瘤患者I年生存率約為30%，5年生存率不足5%。
[0004]目前,在腦腫瘤臨床治療常用手段主要有手術治療、放射治療和化療,另外還有一些比較新的治療方法，如免疫治療、以EGFR、IGFR、I3DGFR等為靶點的靶向治療和抗血管生成的治療方法。這些方 法通常根據病人的實際情況進行聯合應用，但對於腦腫瘤的治療效果卻不盡人意。因此臨床上不僅需要新型的治療方法，同時也需要開發有效的治療藥物。
[0005]然而目前在全世界範圍，用於藥物開發和基礎研究的腦瘤細胞系屈指可數，具有亞洲人種遺傳背景的腦瘤細胞系更是鳳毛麟角。同臨床上種類繁多的腦瘤病人相比，腦瘤細胞系稀少的問題嚴重地制約了相關的臨床前研究。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題就是針對現今尚不存在建立好或可直接購買的人腦膠質瘤細胞系這一難題，提供一種人腦膠質瘤細胞系及其製備方法和應用。
[0007]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之一是:一種人腦膠質瘤細胞，其保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:C201115。
[0008]本發明還提供如上所述的人腦膠質瘤細胞的子代細胞。
[0009]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之二是:一種本發明所述的人腦膠質瘤細胞及其子代細胞的用途，即用於在哺乳動物中產生腦膠質瘤。
[0010]其中所述用途較佳地包括製備腦膠質瘤動物模型。其中所述製備動物模型的方法為本領域常規使用的製備方法。所述動物模型的製備方法較佳地包括以下步驟:體外大量培養和收集本發明所述的人腦膠質瘤細胞，將一定量的細胞懸液皮下接種哺乳動物，接種一段時間後，腫瘤開始形成並生長，並能夠在小鼠皮下進行傳代。其中所述的哺乳動物較佳地包括各種哺乳動物，更佳地是免疫缺陷小鼠，本發明所述哺乳動物優選地為嚴重聯合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)。所述的接種的方式為本領域常規使用的接種方式。所述接種方式較佳地包括皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內接種。本發明所述腦膠質瘤細胞接種方式優選地為皮下穿刺接種。
[0011]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之三是:一種篩選治療腦膠質瘤的候選藥物的方法，其中較佳地包括以下步驟:將測試化合物施用於細胞模型中，施用後抑制細胞增殖或導致細胞凋亡的測試化合物為治療人腦膠質瘤的候選化合物，其中所述的細胞模型是本發明所述的人腦膠質瘤細胞系。
[0012]其中所述篩選方法為本領域常規使用的篩選方法，所述篩選方法較佳地包括以下步驟:
[0013](I)將一定數量的人腦膠質瘤細胞或其子代細胞接種於96孔細胞培養板孔中，培養24小時；
[0014](2)將測試化合物稀釋成不同濃度施用於細胞，化合物作用72小時後通過測定細胞的活力，計算不同濃度的化合物對細胞的增殖抑制能力，計算化合物半數抑制濃度，用以判斷測試化合物的抗腫瘤能力。
[0015]其中步驟(1)所述人腦膠質細胞瘤或其子代細胞的接種量較佳地為:5000/孔。步驟(2)所述檢測不同化合物半數抑制濃度，用以判斷測試化合物的抗腫瘤能力的方法為本領域常規檢測和計算方法。其中所述半數抑制濃度檢測方法較佳地包括ATP生物發光法或MTT法，本發明所述檢測方法優選地為ATP生物發光法。所述的ATP生物發光法是通過對細胞中的ATP進行定量測 定來檢測培養物中活細胞數目的一種均質檢測方法，其中所述的ATP是活細胞新陳代謝的一個重要指標。
[0016]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之四是:一種篩選治療腦膠質瘤的候選藥物的方法，其中較佳地包括以下步驟:將測試化合物施用於動物模型，施用後導致腦膠質瘤症狀改善或治癒的測試化合物就是治療人腦膠質瘤的候選化合物，其中所述的動物模型具有本發明所述的人腦膠質瘤細胞所導致的腦膠質瘤。
[0017]其中所述藥物篩選方法為本領域常規的藥物篩選方法。所述藥物篩選方法較佳地包括以下步驟:
[0018](I)將所述的人腦膠質瘤細胞或其子代細胞製備成細胞懸液，接種於哺乳動物皮下進行飼養，獲得人腦膠質瘤動物模型；
[0019](2)將測試化合物施用於動物模型，施用後導致腦膠質瘤症狀改善或治癒的測試化合物就是治療人腦膠質瘤的候選化合物。
[0020]其中步驟(1)所述的哺乳動物較佳地包括免疫缺陷小鼠，本發明所述的哺乳動物優選地是嚴重聯合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)。所述的接種方式為本領域常規的接種方式。所述接種方式較佳地包括皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內接種。本發明所述人腦膠質瘤細胞接種方式優選地為皮下穿刺接種，所述接種的細胞量較佳地為1.0~2X IO7個細胞，細胞接種量優選地為1.0X107個細胞。
[0021]其中步驟(2)所述的施用方式為本領域常規的施用方式，其中所述施用方式較佳地包括:將測試化合物通過尾靜脈注射、口服、腹腔注射和腫瘤局部用藥中的一種或幾種方式施用於人腦膠質瘤荷瘤動物。所述實驗中的對照例較佳地為:同時使用不含測試化合物的溶劑施用於人腦膠質瘤荷瘤動物作為對照。
[0022]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之五是:一種本發明所述人腦膠質瘤細胞系的建立方法，其中包括以下步驟，
[0023]( I)獲得新鮮的臨床人腦膠質瘤手術切除標本，剪切成小塊，使用膠原酶消化腫瘤塊；
[0024](2)將步驟(1)所得的分離細胞進行癌細胞的原代培養和傳代培養。
[0025]其中步驟(2)所述的原代培養為本領域常規的原代培養技術。本發明所述原代培養方法較佳地包括以下步驟:將步驟(1)所得的人腦膠質瘤細胞重懸於DMEM/F12培養液，所述DMEM/F12培養液較佳地包括:lXB27、20ng/ml人表皮生長因子、20ng/ml人成纖維細胞生長因子、100U/ml青黴素G和100 u g/ml硫酸鏈黴素，置入細胞培養瓶中培養，培養溫度較佳地為37°C，培養時間較佳地為4~5天，培養時間優選地為4天，CO2含量較佳地為5%(V/V)進行培養。
[0026]其中步驟(2)所述的傳代培養方法為本領域常規的細胞傳代培養方法。其中所述傳代方法較佳地包括以下步驟:收集舊培養基，離心去上清，所述離心條件優選地為:300g離心3分鐘,細胞沉澱使用Accutase重懸消化,所述Accutase購自sigma貨號為A6964,待細胞分散後加入HBSS終止消化；離心收集的細胞重懸於DMEM/F12培養液中，於新的細胞培
養瓶中繼續培養。
[0027]細胞培養四代後 ，更換為新鮮RPMI 1640培養液，所述RPMI 1640培養液成分優選地包括:10%胎牛血清、100U/ml青黴素G和IOOii g/ml硫酸鏈黴素培養。細胞由懸浮生長轉變成貼壁生長，進行傳代培養。其中所述傳代培養方法為本領域常規使用的細胞傳代培養方法。本發明所述傳代培養方法較佳地包括以下步驟:吸棄舊培養液，向瓶中加入新鮮的
0.05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後，加入新鮮的RPMI 1640培養液，仔細吹打分散細胞，少量在瓶壁上變圓但沒有脫落的細胞，用無菌細胞刮刀輕輕刮擦培養瓶表面，收集全部細胞，離心，計數，接種於新的培養瓶繼續培養。
[0028]本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
[0029]相比於現有技術，本發明的有益效果如下:本發明提供的人腦膠質瘤細胞性狀穩定，可穩定多次傳代，為腦癌研究提供了新的更接近於臨床腫瘤生物學特性的實驗材料。本發明所得的細胞系既可以直接作為體外抗腦膠質瘤藥物篩選模型，也可以通過在哺乳動物如免疫缺陷小鼠體內多次傳代，獲得高成瘤性人腦膠質瘤動物模型，進而建立體外、體內兩個相關聯的抗腦膠質瘤藥物篩選平臺。可利用所得的平臺進行腦膠質瘤的發病機理、耐藥性以及轉移機理的研究，進而尋找腦膠質瘤發病機制、耐藥性和轉移的特徵生物標誌物，是人腦癌基礎研究和臨床前期應用的理想細胞系。本發明建立的腦膠質瘤細胞系不僅豐富了世界腦瘤細胞庫，也為基於中國人群遺傳背景開展的研究提供了有力的科研資料。
[0030]牛物材料的保藏
[0031]本發明的人腦膠質瘤細胞，於2011年4月26日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)(地址:中國.武漢.武漢大學)，培養物名稱為人源腦膠質瘤細胞GLC-001，保藏編號為 CCTCC NO:C201115o【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]以下結合【專利附圖】
【附圖說明】本發明的特徵和有益效果。
[0033]圖1是GLC-001細胞的形態學觀察圖(100X )。
[0034]圖2是GLC-001細胞的染色體分析圖。A.GLC-001細胞；B.小鼠細胞染色體(對照)。
[0035]圖3是GLC-001細胞的短片段重複序列(STR)分析結果圖。A~D是GLC-001細胞不同短片段的STR分析結果圖。
[0036]圖4是GLC-001細胞免疫組化染色(DAB法)圖譜。A:陰性對照(100X )，B:膠質瘤細胞生物標誌物神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP 100X )
[0037]圖5是GLC-001細胞倍增時間曲線圖。
[0038]圖6是GLC-001細胞周期分析圖。
[0039]圖7是體外測試多個抗癌藥物對GLC-001細胞增殖的抑制作用示意圖。A鹽酸伊立替康對GLC-001細胞增殖的抑制作用，B鹽酸伊立替康對U-87MG細胞增殖的抑制作用，C洛莫司汀對GLC-001細胞增殖的抑制作用，D洛莫司汀對U-87MG細胞增殖的抑制作用，E尼莫司汀對GLC-001細胞增殖的抑制作用，F尼莫司汀對U-87MG細胞增殖的抑制作用。
[0040]圖8是GLC-001細 胞的成瘤性示意圖。
[0041]圖9是GLC-001細胞在裸小鼠體內成瘤的病理組織切片(100X )圖譜。
【具體實施方式】
[0042]下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件，室溫為25°C。
[0043]實施例1GLC-001細胞的製備
[0044]從南通市腫瘤醫院獲得新鮮的臨床腦膠質瘤切除標本(男，52歲，多形性膠母細胞瘤)，立即浸入預冷的無菌HBSS緩衝液中(含500U/ml青黴素G、500 u g/ml硫酸鏈黴素和
1.25 u g/ml兩性黴素B)。原代培養:在生物安全櫃中，用新鮮的無菌HBSS緩衝液衝洗標本，剪切成20~30立方毫米小塊，使用20ml含0.2%11型膠原酶的磷酸緩衝液消化腫瘤塊，將分散的細胞重懸於5ml DMEM/F12完全培養液，所述DMEM/F12完全培養液的成分包括:I XB27 營養因子(StemCell Technology, 07153)、20ng/ml 人表皮生長因子、20ng/ml 人成纖維細胞生長因子、100U/ml青黴素G和100 u g/ml硫酸鏈黴素，置入細胞培養瓶中，於37°C溫箱5%C02條件下培養4天。
[0045]傳代培養方法:收集舊培養基，300g離心3分鐘去上清，細胞沉澱使用ImlIXAccutase重懸消化，待細胞分散後加入HBSS終止消化；離心收集的細胞重懸於5mlDMEM/F12完全培養液中，於新的細胞培養瓶中繼續培養。
[0046]細胞培養四代後，更換為RPMI 1640培養液(含10%胎牛血清、100U/ml青黴素G和IOOy g/ml硫酸鏈黴素)進行培養，細胞將由懸浮生長轉變成貼壁生長，傳代培養方法如下:吸棄舊培養液，向瓶中加入2ml新鮮的0.05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後，加入15ml新鮮的RPMI 1640培養液，仔細吹打分散細胞，少量在瓶壁上變圓但沒有脫落的細胞，用無菌細胞刮刀輕輕刮擦培養瓶表面，收集全部細胞按1:3比例(細胞數量比)接種於新的培養瓶繼續培養，培養基總體積為15ml。該細胞生長良好，形態較為均一，傳代至50代以上。[0047]本發明的人腦膠質瘤細胞系，於2011年4月26日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)(地址:中國.武漢.武漢大學),培養物名稱為人源腦膠質瘤細胞GLC-001，保藏編號為 CCTCC N0:C201115。
[0048]實施例2GLC-001細胞的生物學特性及應用
[0049]本發明採用DMEM/F12完全培養液培養純化GLC-001細胞，然後使用含有胎牛血清的RPMI 1640培養液培養，使其能體外長期生長和穩定傳代。當細胞傳至20代以上，細胞性狀逐漸穩定，進行相關的生物學、遺傳學和組織來源鑑定，直至第50代都具有相同的穩定的性狀。經實驗觀察與驗證，體外生長的GLC-001主體呈梭型，存在不規則分支或分叉，細胞密度較大時失去接觸生長抑制，呈交叉堆積生長狀態，且由聚集處向外輻射生長。遺傳學研究證實該細胞為異倍體，染色體數目和結構畸變嚴重，符合惡性腫瘤的遺傳學特徵。該細胞能在裸小鼠體內可形成腫瘤，具有致瘤性。
[0050]a.形態學觀察
[0051]將培養GLC-001細胞的培養瓶置於倒置顯微鏡下(Olympus)，在明視野下進行觀察，結果見圖1 (100X)，可見GLC-001細胞主體呈梭型，存在不規則分支或分叉，細胞密度較大時失去接觸生長抑制，呈交叉堆積生長狀態，且由聚集處向外輻射生長。
[0052]b.染色體的鑑定
[0053]將培養的GLC-001細胞置於4°C孵育12小時後，加入秋水仙素，使其終濃度為0.g/ml，再於37°C孵箱中繼續培養10小時。採集分裂中期的細胞，用固定液進行固定，然後將細胞懸液滴於預冷的載物片上，用Giemas染色液染色，於顯微鏡下計數染色體數。結果見圖2，可見GLC-001細胞連續傳代後，染色體仍保持人源性腫瘤細胞染色體的特徵，染色體眾數(M)集中在35~37之間，佔70%，比正常人染色體數少，存在多數中央及亞中央著絲粒染色體(圖2A，1000X );而小鼠正常體細胞的染色體數2n=40，且均為頂端著絲粒(圖2B，1000 X )，據此可與人類染色體相區別。可見該GLC-001細胞為異倍體，染色體數目和結構畸變嚴重，符合惡性腫瘤的遺傳學特徵。
[0054]c.短片段重複序列(STR)鑑定
[0055]短串聯重複序列(short tandem repeat, STR)又稱為微衛星DNA,是指染色體上，由數個鹼基對作為核心單位(2~6個鹼基對)，串聯重複形成的一類DNA序列(重複次數為10^60多次，基因片段在400鹼基對以下)；每個核心單位重複的次數會出現個體差異，從而形成片段長度不同的等位基因。因此，一組STR序列的重複次數在不同個體中幾乎是唯一的，是個體的基因身份特徵，也是細胞生物學對細胞身份和來源進行鑑定的主要方法。
[0056]收集新鮮培養的GLC-001細胞,用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒(購自Axygen公司的 AxyPrep? Multisource Genomic DNA Miniprep Kit,貨號為 AP-MN-MS-GDNA)提取細胞基因組DNA，用5』端螢光標記的引物進行PCR擴增，對所得產物進行測序，計算各個短片段重複序列的重複數(表1)。在美 國典型培養物保藏中心(ATCC)資料庫中，進行STR序列檢索，未發現相同STR檢測結果，結果見圖3A~D。
[0057]表1.GLC-001細胞STR檢測結果
[0058]
【權利要求】
1.一種人腦膠質瘤細胞系，其特徵在於，其保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC N0:C201115。
2.如權利要求1所述的人腦膠質瘤細胞系的子代細胞系。
3.如權利要求1或2任一項所述的人腦膠質瘤細胞系的用途，其特徵在於，用於在哺乳動物中產生腦瘤。
4.如權利要求3所述的人腦膠質瘤細胞系的用途，其特徵在於，所述的哺乳動物是免疫缺陷小鼠。
5.一種篩選治療腦膠質瘤的候選藥物的方法，其特徵在於，包括以下步驟:將測試化合物施用於細胞模型中，施用後抑制細胞增殖或導致細胞凋亡的測試化合物為治療腦膠質瘤的候選化合物，其中所述的細胞模型是權利要求r2任一項所述的人腦膠質瘤細胞系。
6.一種篩選治療腦膠質瘤的候選藥物的方法，其特徵在於，包括以下步驟:將測試化合物施用於動物模型，施用後導致腦膠質瘤症狀改善或治癒的測試化合物就是治療人腦膠質瘤的候選化合物，其中所述的動物模型具有權利要求r2任一項所述的人腦膠質瘤細胞系所導致的腦膠質瘤。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的動物模型是免疫缺陷小鼠。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，測試化合物的施用方式選自:局部施用於腦膠質瘤病灶處、口服給藥 和注射給藥中的一種或幾種。
9.一種如權利要求1或2任一項所述人腦膠質瘤細胞系的建立方法，其特徵在於，包括以下步驟， (1)獲得新鮮的臨床人腦膠質瘤手術切除標本，剪切成小塊，使用膠原酶消化腫瘤塊； (2)將步驟(1)所得的分離細胞進行癌細胞的原代培養和傳代培養。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的原代培養方法包括以下步驟:將分散的人腦膠質瘤細胞重懸於含有lXB27、20ng/ml人表皮生長因子、20ng/ml人成纖維細胞生長因子、100U/ml青黴素G和100 u g/ml硫酸鏈黴素的DMEM/F12培養液中，置入細胞培養瓶中，於37°C溫箱，5% (V/V) CO2條件下培養3~5天； 步驟(2)所述的傳代培養方法包括以下步驟:收集舊培養基，離心去上清，細胞沉澱後使用Accutase重懸消化，待細胞分散後加入含有500U/ml青黴素G、500 u g/ml硫酸鏈黴素和1.25 u g/ml兩性黴素的BHBSS培養液中，終止消化；離心收集的細胞重懸於DMEM/F12培養液中，於新的細胞培養瓶中繼續培養；當細胞傳代培養四代後，細胞由懸浮生長轉變為貼壁生長，吸棄舊培養液，向瓶中加入新鮮的0.05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後，加入含有10%胎牛血清、100U/ml青黴素G和100 u g/ml硫酸鏈黴素的新鮮RPMI 1640培養液，仔細吹打分散細胞使之脫離瓶壁形成細胞懸液；少量在瓶壁上變圓但沒有脫落的細胞，用無菌細胞刮刀輕輕刮擦培養瓶表面，收集全部細胞，離心，取適量細胞懸液接種於新的培養瓶繼續培養。
【文檔編號】A01K67/027GK103627673SQ201210299549
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月21日 優先權日:2012年8月21日
【發明者】秦宵然, 王科, 張一心, 謝付波, 王建紅, 聞丹憶, 季從飛, 趙奇紅 申請人:上海睿智化學研究有限公司, 南通市腫瘤醫院