用於蘋果枝幹輪紋病抗性基因檢測的scar分子標記方法

2023-09-15 02:20:20 1

專利名稱：用於蘋果枝幹輪紋病抗性基因檢測的scar分子標記方法
技術領域：
本發明涉及一種基因分子標記方法，特別是涉及一種用於蘋果枝幹輪紋病抗性基 因的分子標記方法、脫氧核糖核酸(DNA)片段的序列以及作為檢測蘋果枝幹輪紋病抗性基 因的PCR探針(寡聚核苷酸引物序列)，屬於植物基因工程領域。
背景技術：
蘋果為世界性重要的水果，且在我國栽培面積和產量均處於首位。蘋果枝幹輪紋 病是目前我國蘋果生產上危害嚴重、發生普遍的病害之一，是由輪紋病菌(Botryosphaeria berengerianaf. sp. piricola)侵染蘋果枝幹而引起的。其主要症狀是在枝幹表面形成許 多瘤狀突起，突起邊緣產生裂縫，似馬鞍狀，造成樹皮粗糙。輪紋病主要危害主幹、主枝，嚴 重時也可危害側枝及小枝。輪紋病斑一般較淺，多造成樹勢衰弱。在弱樹及弱枝上，有時病 斑也可深達木質部，導致枝幹枯死。近年來，隨著主栽品種的更迭，質優但感病的品種栽培 面積不斷擴大，該病的發生與危害日趨嚴重，成為蘋果生產上的突出問題。目前該病還沒 有有效的防治辦法，另外，化學防治還會影響到使用者的身體健康，並導致一系列的環境問 題。因此，利用蘋果資源自身的抗性基因，通過雜交育種來培育抗病新品種是解決該問題的 根本途徑。但通過雜交育種的方法，選育出抗輪紋病新品種的周期較長，因為雜種樹的田間 發病症狀一般要等到盛果期才能觀察到明顯的症狀。這就造成人力、物力、時間上的大量耗 費而育種效率低的結果。然而，DNA分子標記技術不僅可以作為性狀早期選擇的手段，而且 也可以作為種質鑑定的輔助手段，大大提高育種效率。我們通過田間雜交群體對蘋果枝幹 輪紋病的抗性分離情況分析表明，該抗病性是受兩對隱性基因控制的質量性狀。隨機擴增多態性DNA(RAPD)是一項分子標記技術，具有快速、簡便、成本低、多態 性檢測豐富、不需同位素示蹤和安全可靠的特點，在分子生物學研究領域及植物育種方面 得到廣泛的應用，並取得明顯成效。將RAPD標記轉換成SCAR標記，是解決其穩定性，並適 應大規模樣品分析的理想途徑。

發明內容
本發明目的是提供一種用於蘋果枝幹輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方 法，它能解決傳統雜交育種中周期長、效率低的問題。採用隨機擴增多態性DNA(RAPD)技 術，對蘋果品種間雜交&代雜種樹進行研究，尋找與蘋果枝幹輪紋病抗性基因連鎖的DNA 分子標記，研究它的DNA序列組成，合成寡聚核苷酸引物，發展應用成檢測蘋果枝幹輪紋病 抗性基因的探針，用於抗枝幹輪紋病育種的早期篩選與鑑定。為了解決背景技術所存在的問題，本發明是採用以下技術方案a.以蘋果品種舞 姿、短枝富士及其&代雜種88株，其中抗病11株，感病77株為試材，分離提取並純化基因 組DNA ；b.採用RAPD技術，用多個隨機引物在F1代雜種及親本DNA上進行擴增，篩選與抗 病/感病性狀相關的多態性標記，分析標記的分離特點及其與性狀遺傳規律相吻合情況。 c.用玻璃珠DNA膠回收試劑盒，從瓊脂糖凝膠中回收目標DNA片段；d.用美國Promega公司的pGEM-T載體連接回收的DNA片段；e.轉化大腸桿菌DH5 a，提取質粒，用酶切鑑定法判 斷克隆片段是否正確；f.將陽性克隆的菌液送測序公司測序；g.獲得目標DNA片段即RAPD 標記片段實際長度及其序列；h.根據序列的鹼基組成，人工設計併合成一對該序列的特異 寡核苷酸引物；i.對原雜交組合雙親及F1代雜種的基因組DNA進行PCR特異擴增；j.獲得 特異擴增的多態性DNA片段，即SCAR標記，可用於檢測與蘋果枝幹輪紋病抗性基因相關的 基因型。


圖1是本發明獲得的目標DNA片段即RAPD標記序列示意圖；圖2是本發明依據的親本與後代之間的遺傳模式示意圖；圖3是本發明的實驗結果圖。
具體實施例方式本具體實施方式
採用以下技術方案a.以蘋果品種舞姿、短枝富士及其&代雜種 (88株，其中抗病11株，感病77株)為試材，分離提取並純化基因組DNA;b.採用RAPD技 術，用上海Sangon公司的隨機引物180個，進行F1代雜種及親本DNA的擴增。其中，引物 S389(5』 TGCGAGAGTC 3』 )擴增出的大小約為1700鹼基對的片段在11株抗病個體中均表 現為缺失，而在77株感病個體中有34株也表現為缺失(即缺失個體約佔感病個體總數的 3/7)，這與受兩對獨立分配基因控制的性狀遺傳規律相吻合。即這是一個與其中一對基因 位點相關的基因標記。由於該片段也在親本品種短枝富士上出現，而在舞姿上表現缺失， 因此，可推測出親本及其後代的基因型；c.用玻璃珠DNA膠回收試劑盒(上海Sangon公 司)，按照試劑盒說明書的指導，從瓊脂糖凝膠中回收目標DNA片段；d.用美國Promega公 司的pGEM-T載體連接回收的DNA片段，具體操作根據說明書的指示進行；e.轉化大腸桿菌 DH5 a (採用熱擊法)，提取質粒DNA(鹼裂解法)，於37°C電熱恆溫箱中保溫3小時，進行 酶切，然後將酶切產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測；f.對鑑定為陽性克隆的菌液 送測序公司測序；g.獲得目標DNA片段實際長度為1679鹼基對的全部鹼基組成及其序列； h.根據序列的鹼基組成，人工設計併合成一對該序列的特異寡核苷酸引物5』TGC GAG AGT CAA TGT ACA ATA G 3，禾口 5，TGC GAG AGT CGA TGA AGT TGA A 3，；i.對原雜交組合雙親 及F1代雜種的基因組DNA進行PCR特異擴增；j.獲得特異擴增的多態性DNA片段，即SCAR 標記在感病基因型Rlrl的個體中出現，而在抗病基因型rlrl的個體中缺失，可用於檢測與 與蘋果枝幹輪紋病抗性基因之一 rl相關的基因型Rlrl (感病)與rlrl (抗病)，從而達到 鑑別隱性純合基因型rlrl個體的目的。1.本發明中所用的RAPD-PCR擴增及產物鑑定方法a.PCR反應體系總反應體積為25 ii L，其中DNA模板50ng ；10鹼基隨機引物0. 4 i mol/L ；Taq酶 1. 0U ； dNTPs 0. 2mmol/L ；MgCl22. 5mmol/L。反應混合物用 15u L 礦物油覆蓋。b. PCR擴增程序PCR儀為PTC-200型。先在94°C預變性4min，然後按照94°C變性30s — 37°C退火 35s — 72°C延伸90s的程序進行40個循環，最後在72°C延伸5min。
5
c.產物檢測擴增產物經1. 3%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0. 5微克/毫升)電泳檢測，電泳緩衝 液為1XTAE，電壓為4-5V/cm，電泳時間為1. 5小時，於凝膠成像系統中觀察照相。2.本發明中所用的SCAR-PCR擴增及產物鑑定方法a.PCR反應體系總反應體積為25 ii L，其中DNA模板50ng ；引物各0. 2 ii mol/L ；Taq酶1. 0U ； dNTPs 0. 2讓。1/L ;MgCl2 2. 5mmol/L。反應混合物用15 y L礦物油覆蓋。b. PCR擴增程序PCR儀為PTC-200型。先在94°C預變性4min，然後按照94°C變性30s — 64°C退火 30s — 72°C延伸lmin的程序進行25個循環，最後在72°C延伸5min。c.產物檢測擴增產物經1. 3%瓊脂糖凝膠(加入溴化乙錠0. 5微克/毫升)電泳檢測，電泳緩 衝液為1XTAE，電壓為4-5V/cm，電泳時間為50min，於凝膠成像系統中觀察照相。本具體實施方式
不僅可以用來對蘋果親本材料的抗輪紋病遺傳基礎進行鑑別，也 可以對雜交後代進行早期的選擇，從而加速蘋果抗輪紋病育種的進程。例如，對本研究的雜 交組合來說，可淘汰1/2非rlrl基因型的個體，這也極大地降低了人力物力的消耗。另外， 該標記還可為進一步克隆抗輪紋病基因和基因轉移提供方法和物質基礎，也可為蘋果抗輪 紋病的遺傳規律研究和分子標記遺傳連鎖圖的構建提供科學依據。
權利要求
用於蘋果枝幹輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法，其特徵在於a.以蘋果品種舞姿、短枝富士及其F1代雜種(88株，其中抗病11株，感病77株)為試材，分離提取並純化基因組DNA；b.採用RAPD技術，用上海Sangon公司的隨機引物180個，進行F1代雜種及親本DNA的擴增。其中，引物S389(5』TGCGAGAGTC 3』)擴增出的大小約為1700鹼基對的片段在11株抗病個體中均表現為缺失，而在77株感病個體中有34株也表現為缺失(即缺失個體約佔感病個體總數的3/7)，這與受兩對獨立分配基因控制的性狀遺傳規律相吻合。即這是一個與其中一對基因位點相關的基因標記。由於該片段也在親本品種短枝富士上出現，而在舞姿上表現缺失，因此，可推測出親本及其後代的基因型；c.用玻璃珠DNA膠回收試劑盒(上海Sangon公司)從瓊脂糖凝膠中回收目標DNA片段；d.用美國Promega公司的pGEM-T載體連接回收的DNA片段；e.轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒DNA，並於37℃電熱恆溫箱中保溫3小時，進行酶切；f.對鑑定為陽性克隆的菌液送測序公司測序；g.獲得目標DNA片段即RAPD標記片段實際長度為1679鹼基對的全部鹼基組成及其序列；h.根據序列的鹼基組成，人工設計併合成一對該序列的特異寡核苷酸引物；i.對原雜交組合雙親及F1代雜種的基因組DNA進行SCAR-PCR特異擴增；j.獲得特異擴增的多態性DNA片段，即SCAR標記，可用於檢測與與蘋果枝幹輪紋病抗性基因之一r1相關的基因型R1r1(感病)與r1r1(抗病)，從而達到鑑別隱性純合基因型r1r1個體的目的。
2.根據權利要求1所述的用於蘋果枝幹輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法，其 特徵在於獲得RAPD標記片段實際長度為1679鹼基對的DNA序列TGCGAGAGTCAATGTACAATAGGGATTGATGTATGCTAACTTGAGTCAATGTCCCTAGAATAGAGA.TTCAATGTTCTCATAAACAGTAAAGGGACATTGTGTTGCAGTGCCTGAATCCAAATGCAAAAATCATGAGTTGCACGAGGTGTGAAGCATAGGAGGCGTGTGAGTGATAAAAAAATTGAACCAGAAAACAAATACTGCAACAAAGCGTCTAAATCCGATAAAACCAAATCAGAAAGAGGCATTGCAATGCAATGTCTGAATCTATATTAACCTATTCCAAAATATATAAAAAATATGAGAAGGGAGTGTCATTTAAAGTGGGTGTCAGCTATAATGATAGATTTTGTAATTTTTGTTTATTTTAAATGCATTTAAGTATCCCGATACATAATTGACCTATTTACAATTAATATAAATATTATTAATATTGTAACTTTTTATTGATTCTGTTTGTACCATACTTAGGGCATCCATATTTAGATCTCGTATAAATACTCGGATGACTCAAATGTAATTATGTAATAAATGAAGGGGCAAATATGTAAAAATGGGAGGAGCCCTTAGTCTATAAAAGGGCCTCCTCACCCTCACAATCCTCAAGCTCTGAGATTCAGAGCAAAGCCTCACTCTCACATTACAAAGCTCTCATCCTCACAATCCTCTCACAAACAGAAAAATACAATATCAGTGTGGACGTAGCCCAAACATTGGGGTGAACCACAATACATCTTGTGTTCTTTACTTTCTTGCAGATTCACGATCGGATTTACGTTGTTCCAAGACCCCTCCAGTTTTGTGCATCAACAGATTCTTTACCAAATCACCCTTTAAATCTACATAAAATATTTTTTTTCTTTCTAAACAAATAGTATTATTTACAAGTGAGAGAGTGGCTAAGTCTCACAATGTGCTAACAATAATGTGGAATCGAACTTAAGATCTCTCATTTATTAAATGACACATAAAATAACTATTAATTTATTCAATTTGACAGTACTTGGAAATTCAGAAATTACTTTACACTATGTTTGGATGAAGAAATTTAAGATTACCAAATAATTTTAAAAATGAAAGTAATTGAAATAACGAGATTTTATTTTCTAGAATTTATGAATTTTCTTGTTTGGTTAACCTAAAAGAACAATAGAATTAAATATGAAATTTGTTATTTTTAAATTGTCAATCATAGAAATTGGGAAATGACATCTATTTACATAGAATTTAAACTTGGGAATTGGAGATCCCAAATTCCAAGTTTTTTTCTATGCAAAAATTCTAAATTTCTATGTTTATGAAGCCAAATAAAGGAATTAGTGAATTTCAATTTGTAAATTCCGACTTTTATCCAAATTCCAAGTTTATTTCCTTCGTCTAAACATAATGTTAAATCACTTTTCTTTTGATAATTATTAACTTTTTGGTAAATAATTGAAGCTAGAACTATTACACGATGTAGTCTTTGTCCTGTTTAAACAGAAATTCCGTTGTTTGGGAAGAGGTTAGGTCTCTCGGTATCCTGCGCCGCAGA CATGGCGGCAAAGTTCGCTTTAGGGTCGGAACCGGTGGTGGGTTCGCTCGCACCCTCAAAGAAGAAA GAGTACAGAGTCACCAACAGGCTCCAAGAGGGCAAGCGGCCCCTATACGCCATCGTTTTCAACTTCAT CGACTCTCGCA
3.根據權利要求1所述的用於蘋果枝幹輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法，其 特徵在於根據RAPD標記片段DNA序列的鹼基組成，人工設計併合成的特異寡核苷酸引物 5' TGC GAG AGT CAA TGTACA ATA G 3'禾口 5' TGC GAG AGT CGA TGA AGT TGA A 3，。
4.根據權利要求1所述的用於蘋果枝幹輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法， 其特徵在於SCAR-PCR擴增的反應體系、擴增程序及產物檢測a. PCR反應體系總反應體 積為 25 μ L，其中=DNA 模板 50ng ；引物各 0. 2 μ mol/L ；Taq 酶 1. OU ；dNTPs 0. 2mmol/L ； MgCl22. 5mmol/L。b. PCR擴增程序先在94°C預變性4min，然後按照94°C變性30s — 64°C 退火30s — 72°C延伸Imin的程序進行25個循環，最後在72°C延伸5min。c.產物檢測 擴增產物經1. 3%瓊脂糖凝膠(加入溴化乙錠0. 5微克/毫升)電泳檢測，電泳緩衝液為 IXTAE,電壓為4-5V/cm，電泳時間為50min，於凝膠成像系統中觀察照相。
全文摘要
用於蘋果枝幹輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法，它涉及一種基因分子標記方法。不僅可以用來對親本材料的抗輪紋病遺傳基礎進行鑑別，也可以對雜交後代進行早期的選擇，從而加速蘋果抗輪紋病育種的進程。例如，對本研究的雜交組合來說，可淘汰1/2非r1r1基因型的個體，這也極大地降低了人力物力的消耗。另外，該標記還可為進一步克隆抗輪紋病基因和基因轉移提供方法和物質基礎，也可為蘋果抗輪紋病的遺傳規律研究和分子標記遺傳連鎖圖的構建提供科學依據。
文檔編號C12Q1/68GK101864481SQ20091017729
公開日2010年10月20日 申請日期2009年9月29日 優先權日2009年9月29日
發明者殷豪, 王彩虹, 田義軻 申請人:青島農業大學