新型B肝疫苗的製備方法及用途的製作方法

2023-09-15 11:44:55

專利名稱：新型B肝疫苗的製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人用B肝疫苗及其製備方法，特別涉及含有納米鋁佐劑的B肝疫苗及其製備方法。
背景技術：
B肝疫苗的主要成分是HBsAg，等電點為4.5，HBsAg含有大量的磷酸基團。由於HBsAg和氫氧化鋁佐劑的等電點(iep)分別為4.5和11.4。因此，在機體pH＝7.4的中性環境中，前者顯示出負電荷，後者為正電荷，二者由於靜電力，可以很好的產生吸附作用。
鋁佐劑吸附抗原的主要機制包括靜電力、疏水作用以及基團交換[Vogel FR，Hem SL.InPlotkin SA，Orenstein MD，editors.Vaccines.4th ed.New YorkSanders]。由疏水作用產生的吸附，會受到因蛋白質摺疊而減少暴露在水環境中疏水區域的限制。鋁佐劑的氫氧根與抗原的磷酸根發生配體互換，產生了吸附作用[Bleam WF，Pfeffer PE，Goldberg S，et al.31P solid-state nuclear magneticresonance study of phosphate adsorption at the boehmite/aqueous solution interface.Langmuir.1991，71702-1712.]。磷酸根與鋁在共價鍵的無機等價交換作用下，形成了內球表面。磷酸根對鋁原子的連接比氫氧根更強，從而代替了氫氧根離子[Hingston FJ，Atkinson RJ，Quirk JP.Specific adsorption of anions.Nature(London).1967，2151459-1461.和Liu J，Feldkamp JL，White JL，et al.Adsorption of phosphateby aluminum hydroxycarbonate.J Pharm Sci.1984，731355-1358.]。Seema等[SeemaIyer，Robin Robinett RS，Harm HogenEsch，et al.Mechanism of adsorption ofhepatitis B surface antigen by aluminum hydroxide adjuvant.Vaccine.2004，241475-1479]發現二者的吸附性表現為高親和吸附等溫線。經蘭米爾方程計算所得的吸附量為1.7微克每微克鋁，這是指單層範圍內的HBsAg數量，而吸附力強度指標，吸附係數為6.0毫升每微克。高吸附強度表明吸附是由於強吸附力，而HBsAg抗原的磷酸根與氫氧化鋁佐劑的氫氧根，這兩個配基之間的交換，提供了最強的吸附機制。通過增加離子強度不能影響吸附度，提示電荷吸引不是最主要的吸附力。通過增加乙二醇也不能影響吸附度，提示疏水作用同樣不佔主導作用。當氫氧化鋁吸附HBsAg後，37℃條件下，在體外暴露於間質液中12小時，約5％的抗原解吸附。商業B肝疫苗在48小時後，僅僅只有1％的抗原解吸附。所以，HBsAg與氫氧化鋁的吸附在體內與體外的變化不大，所受到的解吸附作用極其微小。
正是由於HBsAg與氫氧化鋁的吸附不是由疏水作用、電荷吸引，而主要是HBsAg的磷酸根與氫氧化鋁佐劑的氫氧根，這兩個配基之間的交換，提供了最強的吸附機制。並且體內與體外的吸附度變化不大，所受到的解吸附作用極其微小。所以，當氫氧化鋁佐劑成為納米級顆粒時，由於比表面積急劇增加，納米鋁佐劑具有表面反應活性增高、表面活性中心增多、吸附能力增強等優異性質，可吸附更多的HBsAg抗原。所形成的新型B肝疫苗表現出許多優點。
此時鋁佐劑的粒徑成為了影響吸附度的主要因素。
本發明發現，用本發明的納米鋁佐劑吸附的B肝疫苗約為常規鋁佐劑吸附的10-20倍。
我們將本發明所指的新型B肝疫苗免疫動物，並以市場銷售的普通B肝疫苗作為對照，觀察動物體液免疫應答情況，納米鋁佐劑在初次免疫豚鼠後的第1周、第2周就可以產生抗-HBsAg抗體，其GMT分別為22.974±1.3612和26.389±1.4214，而市場銷售的普通B肝疫苗(添加常規鋁佐劑)所對應的數值分別為2.0和13.195±1.1204。
由於納米顆粒的粒徑小，不僅可以吸附更多的抗原蛋白，而且也易於被動物體內的抗原呈遞細胞(APC)攝取，即新型B肝疫苗表現出使動物接受初次免疫後的爆釋效應(burst-released)。Raghuvanshi等人[Raghuvanshi RS，Katare YK，Komal Lalwani，et al.Improved immune response from biodegradable polymerparticles entraiepepng tetanus toxoid by use of different immunization protocol andadjuvants.International Journal of Pharmaceutics.2002，245109-121]也觀察到該爆釋效應。爆釋效應是「抗原儲存庫」效應的快速釋放。納米佐劑更能快速有效的將病毒抗原呈遞給APC細胞[Guy B，Pascal N，Francon A，et al.Design，characterization and preclinical efficacy of a cationic liiepd adjuvant for influenzasplit vaccine.Vaccine.2001；19(13-14)1794-1805]。
目前商業用的鋁佐劑主要為氫氧化鋁和磷酸鋁，但通常所指的鋁佐劑主要是氫氧化鋁，它實際上是A1(OH)3(aluminum hydroxide)分子內脫水的纖維狀結晶態產物偏氫氧化鋁(aluminum oxyhydroxide)，分子式為AlOOH。
目前公認丹麥產的Alhydrogel為標準，其膠粒大小為3.07微米。鋁佐劑的等電點pI(isoelectric point)＝11.4，在機體pH＝7.4的間質液中帶正電荷，能很好的吸附酸性蛋白抗原的特點①使用時間長從1926年開始使用；②安全有效；③價廉；④廣泛應用；⑤對某些疫苗輔佐效果弱或無佐劑活性；⑥易誘導IgE的表達；⑦注射部位偶有出現紅斑、皮下結節、接觸性過敏反應和肉芽腫性炎症等，甚至有的還出現比較嚴重的局部反應。

發明內容
本發明提供一種新型人用B肝疫苗，其特徵是，使用納米鋁佐劑材料，使市售的人用B肝疫苗更多地被納米鋁佐劑所吸附，效果優於常規鋁佐劑所吸附的傳統的人用B肝疫苗。
本發明的新型人用B肝疫苗可以在第一次免疫接種之後快速地產生應答，適合於緊急預防接種。新型人用B肝疫苗還大大降低了副作用，注射疫苗部位的炎症性結節明顯減少甚至根本沒有。
本發明是通過以下技術方案實現的，將氫氧化鋁原料製成顆粒直徑為1-999納米的納米級微粒、將此氫氧化鋁微粒作為疫苗配方中鋁佐劑的原料，優選的氫氧化鋁顆粒粒度為1-400納米，更優選的為1-100納米，最優選的為72納米。
本發明通過電子顯微鏡方法測定氫氧化鋁粒度，以得到合格的質量穩定的納米級氫氧化鋁顆粒。
測定方法見本發明實施例。
本發明的疫苗含有經過純化的可作為疫苗應用的B肝病毒滅活疫苗原料，以及經本發明方法製備的納米鋁佐劑，以及疫苗保護劑人血白蛋白。
本發明的疫苗原料可以採用已知技術製備，也可以在市場上買到。
本發明的疫苗，各成分所佔比例為B肝病毒重組疫苗原料佔20-80％；納米鋁佐劑佔20-80％優選的為B肝病毒滅活疫苗原料50％；納米鋁佐劑50％。
本發明的B肝疫苗，所述納米鋁佐劑用量為0.1-5.0摩爾每升，所述B肝疫苗的劑量為5.0-60微克每支。優選的為納米鋁佐劑用量為1.0摩爾每升。
本發明的疫苗其製備方法為，將以上成分按照製備疫苗製劑的常規技術，經過混合，製成可供注射的醫藥用疫苗製劑。
本發明的納米鋁佐劑，可以採用化學法和機械法兩種方法。化學法能夠製得納米級的粉體。機械粉碎法成本低、產量大，是製備超微粉體的主要手段，現已大規模應用於工業生產。超微粉碎可分為幹法粉碎和溼法粉碎根據粉碎過程中產生粉碎力的原理不同，幹法粉碎有氣流式、高頻振動式、旋轉球(棒)磨式、錘擊式和自磨式等幾種形式；溼法粉碎主要是膠體磨和均質機。本發明可以通過以上任意的方法得到粒徑在1-999納米的鋁佐劑產品，優選使用化學法。
如以下方法取一定量的AlCl3、環己烷和蒸餾水於燒杯中，再加入中性離子保護劑、助表面活性劑，然後用高速分散均質機攪拌，使其乳化成為微乳液。倒入有蓋的反應瓶加熱攪拌，緩慢逐滴加入過量氨水，蓋上蓋子，反應3小時，即為Al(OH)3溶膠，採用冷凍乾燥法或真空乾燥法，得到乾粉。
其中助表面活性劑為混合表面活性劑，由苯扎溴銨與正辛醇混合，質量比以1∶4；1∶3；1∶2；8∶5；1∶1；2∶1；3∶1；4∶1的配比，最佳配比為1∶1。其中混合表面活性劑與環己烷按照質量比為1∶9、1∶4、1∶3、4∶1、9∶1、3∶1、5∶0。氨水的使用劑量為1-50毫升，推薦劑量為10毫升，添加氨水的滴速約10-50滴每分鐘，推薦滴速約30滴每分鐘，保持體系的pH值在8以上，推薦pH值為10，反應時間為0.5-5小時，最佳時間為2小時；使用的水為實驗室用途的純淨水，推薦使用去離子水；乙醇濃度為75-100％，推薦濃度為95％；反應體系中加入丙酮的目的是破乳，使用濃度為1.0摩爾每升，推薦使用分析純。
本發明優選的方法列在本發明實施例中。
本發明採用本發明的納米鋁佐劑材料吸附大量的人用B肝疫苗，從而形成了新型的人用B肝疫苗。新型的人用B肝疫苗在具備了常規B肝疫苗優點的基礎上，還能夠快速激活機體的免疫應答，造成注射部位的炎性反應明顯減小，甚至根本沒有炎性反應。
本發明的有益效果列在本發明的實施例中。
具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發明。
實施例1，本發明所涉及的納米鋁佐劑的製備方法取一定量的AlCl3、環己烷和蒸餾水於燒杯中，再加入再加入苯扎溴銨-正辛醇-環己烷-AlCl3溶液體系，然後用高速分散均質機攪拌，使其乳化成為微乳液。倒入有蓋的反應瓶加熱攪拌，緩慢逐滴加入過量氨水，蓋上蓋子，反應3小時，即為Al(OH)3溶膠，採用冷凍乾燥法或真空乾燥法。然後溶解在水中，並用超聲波分散，在水溶液中呈分散狀態。電子顯微鏡觀察測量的方法測定納米粒經。
實施例2，新型人用B肝疫苗的製備方法將製備的納米鋁佐劑配成0.1毫克每毫升(以水為溶劑)，超聲波分散納米鋁佐劑溶液20分鐘，加入市售無佐劑人用B肝疫苗劑量為5.0微克每支，將人用狂犬疫苗與納米鋁佐劑按3∶1的體積混合，4℃吸附一周，以15000轉每分鐘離心30分鐘，採用ELISA雙抗體夾心法檢測上清中狂犬疫苗抗原濃度。按照以上介紹的方法，新型人用B肝疫苗被吸附在單位質量的納米鋁佐劑上的數量較常規鋁佐劑的提高了10-20倍。
實施例3，本發明的新型B肝疫苗免疫小鼠的結果主要試劑及其配製包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液，pH9.6)組成Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，Na2N3 0.2g，加雙蒸水至1000ml，調至pH9.6。
封閉液(5％小牛血清/PBS溶液)組成小牛血清50ml，加入PBS(pH7.4)950ml。
磷酸鹽緩衝液(PB)A液(0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液)組成NaH2PO4·H2O 27.6g溶於超純水1000ml。
B液(0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液)組成Na2HPO4·7H2O 53.6g(或Na2HPO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O 35.6g)溶於超純水1000ml。
樣本稀釋液(PBS，0.01mol/L磷酸鹽緩衝生理鹽水)成分PB A液19ml；PB B液81ml；NaCl 18.5g；超純水1000ml。
洗滌液(PBST，pH7.4)組成PBS液1000ml加Tween 20 0.5ml，硫柳汞0.1g，調至pH7.4。
底物液(OPD-H2O2)組成及其來源OPD(鄰苯二胺鹽酸鹽)。
A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)組成檸檬酸19.2g，加蒸餾水至1000ml；B液(0.2mol/L Na2HPO4溶液)組成Na2HPO4·12H2O 71.7g，加蒸餾水至1000ml。
終止液(2mol/L H2SO4溶液)組成雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加並不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。
辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG。
主要儀器酶標儀、電子天平、pH測定儀、96孔聚苯乙烯酶聯板、電熱恆溫水熱箱、微量多頭細胞收集器。
實驗方法健康Balb/c小鼠20隻，雌性，6～8周齡，體重10～16克，隨機分為實驗組、對照組各10隻，按相同的方法和劑量免疫小鼠。ELISA測定抗體滴度。
間接酶聯免疫(ELISA)方法檢測抗體，結果以雙復孔平均OD值表示，待測標本OD值/陰性對照OD值＞2.1判定為陽性。
實施例4，本發明的納米鋁佐劑輔佐HBsAg疫苗免疫豚鼠的實驗結果實驗動物分組健康豚鼠10隻，雌性，2月齡，100～150g，隨機分為實驗組、對照組各50隻，兩組的免疫方法和劑量相同。
測定方法和鑑定的方法同實驗例3。
實施例5，安全實驗參照文獻報導的方法[趙晶，王立新.明膠微球B肝疫苗動物免疫效果研究.中華微生物學和免疫學雜誌.2000，20(3)236-239]對以上實驗豚鼠和小鼠，於免疫後的第3天、第7天和第14天各觀察1次，並觀察小鼠脾臟變化。本發明的新型B肝疫苗免疫的小鼠和豚鼠都健存，體重增加，無全身異常反應，皮下硬結明顯小於對照組。
實施例6，新型人用B肝疫苗的製備方法將製備的納米鋁佐劑配成5.0毫克每毫升(以水為溶劑)，超聲波分散納米鋁佐劑溶液20分鐘，加入市售無佐劑人用B肝疫苗 劑量為60微克每支，將人用狂犬疫苗與納米鋁佐劑按3∶1的體積混合，4℃吸附一周，以15000轉每分鐘離心30分鐘，採用ELISA雙抗體夾心法檢測上清中狂犬疫苗抗原濃度。按照以上介紹的方法，新型人用B肝疫苗被吸附在單位質量的納米鋁佐劑上的數量較常規鋁佐劑的提高了10-20倍。
實施例7，新型人用B肝疫苗的製備方法將製備的納米鋁佐劑配成1.0毫克每毫升(以水為溶劑)，超聲波分散納米鋁佐劑溶液20分鐘，加入市售無佐劑人用B肝疫苗劑量為10微克每支，將人用狂犬疫苗與納米鋁佐劑按3∶1的體積混合，4℃吸附一周，以15000轉每分鐘離心30分鐘，採用ELISA雙抗體夾心法檢測上清中狂犬疫苗抗原濃度。按照以上介紹的方法，新型人用B肝疫苗被吸附在單位質量的納米鋁佐劑上的數量較常規鋁佐劑的提高了10-20倍。
實施例8，新型人用B肝疫苗的製備方法將製備的納米鋁佐劑配成2.0毫克每毫升(以水為溶劑)，超聲波分散納米鋁佐劑溶液20分鐘，加入市售無佐劑人用B肝疫苗劑量為10微克每支，將人用狂犬疫苗與納米鋁佐劑按3∶1的體積混合，4℃吸附一周，以15000轉每分鐘離心30分鐘，採用ELISA雙抗體夾心法檢測上清中狂犬疫苗抗原濃度。按照以上介紹的方法，新型人用B肝疫苗被吸附在單位質量的納米鋁佐劑上的數量較常規鋁佐劑的提高了10-20倍。
權利要求
1.一種新型的人用B肝疫苗，其特徵在於，含有人用B肝疫苗，和納米鋁佐劑，其配方比例為B肝病毒重組疫苗原料佔20-80％；納米鋁佐劑佔20-80％。
2.如權利要求1所述的B肝疫苗，其特徵在於，其配方比例為B肝病毒重組疫苗原料佔50％；納米鋁佐劑佔50％。
3.如權利要求1所述的B肝疫苗，其特徵在於，所述納米鋁佐劑的顆粒直徑為1-999納米。
4.如權利要求1所述的B肝疫苗，其特徵在於，所述納米鋁佐劑的顆粒直徑為1-400納米。
5.如權利要求1所述的B肝疫苗，其特徵在於，所述納米鋁佐劑的顆粒直徑為1-100納米。
6.如權利要求1所述的B肝疫苗，其特徵在於，所述納米鋁佐劑的顆粒直徑為平均粒經72納米。
7.如權利要求1所述的B肝疫苗的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟將B肝病毒滅活疫苗原料和納米鋁佐劑按照製備疫苗製劑的常規技術，經過混合，製成可供注射的醫藥用疫苗製劑。
8.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，其中所述納米鋁佐劑的製備包括以下步驟取AlCl3、環己烷和蒸餾水於燒杯中，再加入中性離子保護劑、助表面活性劑，然後用高速分散均質機攪拌，使其乳化成為微乳液；倒入有蓋的反應瓶加熱攪拌，緩慢逐滴加入過量氨水，蓋上蓋子，反應3小時，即為Al(OH)3溶膠，採用冷凍乾燥法或真空乾燥法。
9.如權利要求1所述的B肝疫苗，其特徵在於，所述納米鋁佐劑用量為0.1-5.0摩爾每升，所述B肝疫苗的劑量為5.0-60微克每支。
10.如權利要求1所述的B肝疫苗，其特徵在於，所述納米鋁佐劑用量為1.0摩爾每升。
全文摘要
新型B肝疫苗的製備方法及用途，其基本特徵在於將市售的無佐劑的B肝疫苗吸附於納米鋁佐劑上，所生成的新型B肝疫苗，新型B肝疫苗所採用的納米鋁佐劑的顆粒直徑為1－999納米，成分為氫氧化鋁化合物，顆粒直徑為1－999納米的氫氧化鋁化合物具有分散性好、不含雜質等優點，所用設備、工藝簡單，是一種具有良好發展前途的製備方法，納米鋁佐劑增加10－20倍地吸附B肝疫苗，形成了本發明所指的新型B肝疫苗，本發明所指的新型B肝疫苗具有明顯的「瀑釋」效應，在免疫後的前3周會產生明顯的抗體應答。使用安全，注射部位基本無、甚至根本無炎癥結節。
文檔編號A61K9/14GK1824304SQ20051013519
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月29日 優先權日2005年12月29日
發明者呂鳳林, 何萍, 胡承香 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院