兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸的方法
2023-09-15 03:30:25 1
專利名稱：兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測病毒核糖核酸的方法。
背景技術：
現有技術中對C型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的檢測，有匹基法、華美法等，均存在靈敏度低、特異性不理想等缺陷。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能有效提高檢測靈敏性、特異性的兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸的方法。
本發明的技術解決方案是一種兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的方法，其特徵是包括下列步驟(1)引物和探針的製備根據HCV全系列，在HCV(C型肝炎病毒)基因組5』非編碼區(5』-UTR)，設計併合成如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2引物HCV-S5』-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3』(nt52～nt75)引物HCV-AS5』-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3』(nt312～nt292)探針HCV-P15』-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3』(nt106～nt124)
探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt127～nt149)(2)製備反應液反應液每份為18μl，每份反應液中含下列組分1×PCR Buffer(緩衝液)，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/LBSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)螢光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，並將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品各2μl，各加入步驟(2)製得的反應液18μl，分別放入各個反應管中進行處理，同時設空白管和陰性對照；各反應管進行擴增，將含待測樣品血清反應管的擴增結果與其他反應管擴增結果比較，得出待測樣品血清中C型肝炎病毒核糖核酸的含量。
步驟(3)中擴增是於Roche螢光定量檢測儀中進行擴增擴增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構成一個循環，共進行45個循環。
步驟(2)中製備標準品的製備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA的質量和濃度，並進行逆轉錄反應，反應體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/L dNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應液23μl，PCR反應液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，於PE9600擴增儀進行如下循環94℃預變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，循規30次，最後72℃延伸10min，PCR產物經1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統觀察結果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應中有PCR膠回收產物3μl、連接緩衝液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α(E.Coli，DH5α)，塗布於含X-gal和IPTG並具氨苄青黴素抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養12h～16h至平皿上長出藍白斑，滅菌牙籤挑取白斑，置含50mg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，37℃搖床200轉震搖過夜；取1.6ml過夜培養物抽提質粒，EcoR I酶切初步鑑定，陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株進一步擴增，抽提質粒，Sac I酶切使質粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應，純化後用核酸蛋白紫外分析儀準確定量(連續測定5次，每次重複4管，取均值)，並進行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品，-20℃保存，有效期一年。
在用EcoR I酶切初步鑑定時，20μl體系含2μl緩衝液，6μl質粒DNA，2μlEcoR I和10μldd(double-distilled)H2O。
利用本發明方法對105例HCV抗體陽性和220例陰性樣本進行檢測，陽性率分別為89.52％(94例)和2.72％(6例)，而同樣的樣本用匹基法和華美法檢測，匹基法的陽性率分別為71.42(75例)和0.9(2例)，華美法為69.52(73例)和2.27(5例)，由此可以看出，本發明大大提高了HCVRNA檢測的靈敏度低、特異性。
抗HCV陽性樣本105例，抗HCV陰性220例，兩探針法、匹基法和華美法檢測結果見表1。表1結果經統計學處理，抗HCV陰性與多探針法、華美法顯著性差異(P＜0.05)，抗HCV陽性與匹基法、華美法顯著性差異(P＜0.05)。
表1 105例抗HCV陽性220例抗HCV陰性三種方法結果的比較
下面結合實施例對本發明作進一步說明。
具體實施例方式一種兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸(HCVRNA)的方法，包括下列步驟(1)引物和探針的製備根據HCV(C型肝炎病毒)全系列(GenBank註冊號為AB114136)，在HCV(C型肝炎病毒)基因組5』非編碼區(5』-UTR)，應用Beacon Designer2.1軟體，設計如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2，併合成引物HCV-S5』-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3』(nt52～nt75)引物HCV-AS5』-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3』(nt312～nt292)探針HCV-P15』-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3』(nt106～nt124)
探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt127～nt149)(2)製備反應液反應液每份為18μl，每份反應液中含下列組分1×PCR Buffer(緩衝液)，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/LBSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)螢光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，並將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品各2μl，各加入步驟(2)製得的反應液18μl，分別放入各個Roche反應管中進行處理，同時設空白管和陰性對照；各反應管進行擴增，將含待測樣品血清反應管的擴增結果與其他反應管擴增結果比較，得出待測樣品血清中C型肝炎病毒核糖核酸的含量(可根據HCVRNA標準品建立的標準曲線，計算出待測樣品中HCVRNA的準確含量，同時還可分析標準品建立的標準曲線的線性範圍、標準品實測值與換算值之間的差異以及實驗重複性)。
步驟(3)中擴增是於Roche螢光定量檢測儀(lightcycle)中進行擴增擴增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構成一個循環，共進行45個循環。
步驟(2)中製備標準品的製備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經核酸蛋白紫外分析儀(Eppendorf公司)檢測RNA的質量和濃度，並進行逆轉錄反應，反應體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/L dNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應液23μl，PCR反應液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，於PE9600擴增儀進行如下循環94℃預變性5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循規30次，最後72℃延伸10min，PCR產物經1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統觀察結果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應中有PCR膠回收產物3μl、連接緩衝液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α(E.Coli，DH5α)，塗布於含X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)並具氨苄青黴素(Amp)抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養12h～16h至平皿上長出藍白斑，滅菌牙籤挑取白斑，置含50mg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，37℃搖床200轉震搖過夜；取1.6ml過夜培養物抽提質粒，EcoR I酶切初步鑑定，陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株進一步擴增，抽提質粒，Sac I酶切使質粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應，純化後用核酸蛋白紫外分析儀準確定量(連續測定5次，每次重複4管，取均值)，並進行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品，-20℃保存，有效期一年。
在用EcoR I酶切初步鑑定時，20μl體系含2μl緩衝液，6μl質粒DNA，2μlEcoR I和10μlddH2O。
上述試劑中，Trizo購自Invitrogen公司，AMV、dNTPs、DNA聚合酶購自Promega公司。
權利要求
1.一種兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特徵是包括下列步驟(1)引物和探針的製備根據HCV全系列，在HCV基因組5』非編碼區(5』-UTR)，設計併合成如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探針HCV-P1、HCV-P2引物HCV-S5』-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3』(nt52～nt75)引物HCV-AS5』-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3』(nt312～nt292)探針HCV-P15』-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3』(nt106～nt124)探針HCV-P15′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt 127～nt149)(2)製備反應液反應液每份為18μl，每份反應液中含下列組分1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探針0.1μmol/L，0.5g/L BSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)螢光定量檢測取待測血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，並將提取的HCVRNA、濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品各2μl，各加入步驟(2)製得的反應液18μl，分別放入各個反應管中進行處理，同時設空白管和陰性對照；各反應管進行擴增，將含待測樣品血清反應管的擴增結果與其他反應管擴增結果比較，得出待測樣品血清中C型肝炎病毒核糖核酸的含量。
2.根據權利要求1所述的兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特徵是步驟(3)中擴增是於Roche螢光定量檢測儀中進行擴增擴增時的時間溫度條件依次為42℃下25分鐘、93℃預變性2分鐘、93℃下5秒、60℃下10秒、72℃下10秒構成一個循環，共進行45個循環。
3.根據權利要求1或2所述的兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特徵是步驟(2)中製備標準品的製備方法是Trizol法提取血清HCV RNA，經核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA的質量和濃度，並進行逆轉錄反應，反應體系中含1×RT Buffer、0.5mmol/LdNTPs、1μmol/L oligo-dT引物，RNase抑制劑10U、RT酶AMV4U，37℃下反應1小時，再在65℃下15分鐘滅活逆轉錄酶，得到cDNA模板；取上述cDNA模板2μl，加入PCR反應液23μl，PCR反應液中含1×PCR Buffer、2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、TaqDNA聚合酶4U及HCV-S、HCV-AS引物各0.5μmol/L，於PE9600擴增儀進行如下循環94℃預變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，循規30次，最後72℃延伸10min，PCR產物經1.5％瓊脂糖電泳，凝膠成像系統觀察結果，刀片割下陽性條帶，用膠回收試劑盒回收PCR電泳產物，與pGEM-T載體4℃下連接12h～16h，連接反應中有PCR膠回收產物3μl、連接緩衝液5μl、T載體1μl和T4連接酶1μl，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，塗布於含X-gal和IPTG並具氨苄青黴素抗性的1.5％瓊脂平皿上，37℃倒置培養12h～16h至平皿上長出藍白斑，滅菌牙籤挑取白斑，置含50mg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，37℃搖床200轉震搖過夜；取1.6ml過夜培養物抽提質粒，EcoR I酶切初步鑑定，陽性克隆進行測序分析，將篩選出的陽性菌株進一步擴增，抽提質粒，SacI酶切使質粒線性化，用T7RNA聚合酶在37℃下體外轉錄cRNA2h，再用DNase I消化15min，用0.2mol/L EDTA終止反應，純化後用核酸蛋白紫外分析儀準確定量，並進行10倍系列稀釋，得到濃度分別為108、107、106、105、104copies/ml的5個標準品。
4.根據權利要求3所述的兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特徵是在用EcoR I酶切初步鑑定時，20μl體系含2μl緩衝液，6μl質粒DNA，2μlEcoR I和10μlddH2O。
全文摘要
本發明公開了一種兩探針實時螢光檢測C型肝炎病毒核糖核酸的方法，包括引物和探針的製備、製備反應液、製備RNA標準品、螢光定量檢測等步驟。本發明大大提高了HCVRNA檢測的靈敏度低、特異性。
文檔編號C12Q1/68GK1908627SQ20061004097
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月16日 優先權日2006年8月16日
發明者崔之礎, 張冬雷, 施健, 黃竺筠 申請人:南通大學附屬醫院