蛋白質表達的製作方法

2023-09-14 23:07:40

專利名稱：蛋白質表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及肽和核酸分子，及其用於生產異源蛋白質、益生生物和功能性食品成分以及產品的用途。
背景技術：
乳酸菌，如乳桿菌(Lactobacillus)和乳球菌(Lactococcus)，和其它革蘭氏陽性細菌如雙歧桿菌(Bifidobacterium)、明串珠菌(Leuconostoc)和鏈球菌(Streptococcus)，廣泛用於製造食品，用於初級農產品發酵。
因為這些細菌趨向於無毒性並趨向於在腸環境中保持活力，有興趣用這些細菌生產異源蛋白質(即不是由這些細菌天然產生的蛋白質)，尤其是用於製造提供有益健康作用的功能性食品，也用於製造新的生物藥品。
由於乳酸菌的這些潛在應用，需要能在革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌的細胞表面表達、或例如在來源於這些細菌的培養上清中表達的分子。還需要能在乳酸菌中與異源蛋白質一起以融合蛋白形式表達的分子。

發明內容
本發明旨在解決上述需求，因而在一個方面中，本發明提供一種肽，在所述肽的N端包括LysM結構域，在所述肽的C端包括apf樣結構域，在LysM和apf樣結構域之間包括富含穀氨醯胺區域。
如本文所述，發明人已經分離和表徵了在發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)細胞表面表達的新細菌肽。所述肽也從細胞表面分泌，在培養上清中具有高相對豐度，這提示當分泌到溶液中時它是穩定的。這種蛋白質也被稱為「小輸出蛋白」(「SmallExported Protein」)或「Sep」。
由於Sep在細胞表面和培養上清中穩定表達，發明人意識到Sep對於異源蛋白質靶向表達到細菌的細胞表面特別有用，所述細菌優選用於製備功能性食品成分，尤其是由革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌產生的成分。
LysM結構域，也稱為「溶素基序結構域」，它們已經在能結合蛋白聚糖的酶如大腸桿菌來源的糖基轉移酶中觀察到。LysM結構域的實例已經在大腸桿菌的裂解性胞壁質糖基轉移酶(MltD)中發現(Bateman，A.，and M.Bycroft.2000.The structure ofa LysM domain from E.coli membrane-bound lytic murein transglycosylase D(MItD).J.Mol.Biol.2991113-1119)。
本發明肽的LysM結構域典型是約40-50個胺基酸長，儘管也可以有更少或更多殘基。典型地，LysM結構域具有SEQ ID NO1所示的序列。
apf樣結構域，也稱為「聚集促進因子結構域」，已知在蛋白質向細菌細胞壁的附著中起作用。apf結構域的實例包括在約氏乳桿菌(L.Johnsonni)和加氏乳桿菌(L.gasseri)的apf1和apf2蛋白中發現的那些(Ventura，M.，I.Jankovic，D.C.Walker，R.D.Pridmore，and R.Zink.2002.Identification and characterization of novel surface proteinsin Lactobacillus johnsonni and Lactobacillus gasseri.Appl.Environ.Microbiol.686172-6181)。
本發明肽的apf結構域典型約80個胺基酸長，儘管也可以有更少或更多殘基。典型地，apf結構域具有SEQ ID NO2所示的序列。
本發明肽的富含穀氨醯胺區域典型地在約44個殘基的序列中具有約13個穀氨醯胺殘基。這個區域典型是親水的。典型地，富含穀氨醯胺區域具有如SEQ ID NO3所示的序列。
本發明的肽還可以包括分泌信號序列，也稱為「前導序列」。所述分泌信號序列在肽通過細胞膜分泌的過程中起作用，從而使肽可以附著到細胞表面和/或從細胞表面分泌，例如進入液體培養物中。通常，所述分泌信號序列約30個胺基酸長，儘管也可以有更少或更多殘基。典型地，分泌信號序列具有如SEQ ID NO4所示的序列。
典型地，本發明的肽具有如SEQ ID NO5所示的序列。當所述肽還包括分泌信號序列時，肽典型具有如SEQ ID NO6所示的序列。
發明人意識到分泌信號序列、LysM結構域、富含穀氨醯胺區域和apf結構域分別用作獨立的功能單位，例如，用於表達異源蛋白質。這些用處的實例將在下面進一步描述。
例如，分泌信號序列對於將異源蛋白質靶向表達到革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌的細胞表面特別有用。因此，分泌信號序列對於生產例如功能性食品成分特別有用，其中所述功能性食品成分含有感興趣的異源蛋白質，尤其是不是由這些細菌天然表達的蛋白質。
因此在一個方面中，本發明提供包括如SEQ ID NO6所示序列的肽。
因為已經表明LysM結構域結合蛋白聚糖，意識到LysM結構域可以特別有用於結合包括碳水化合物的生物活性化合物，例如，用於將生物活性化合物集中到感興趣位點如腸黏膜上皮的目的。作為替代方案，LysM結構域可以特別有用於從感興趣位點如腸黏膜上皮去除包括碳水化合物的生物活性物質，如病原菌。
因此在一個方面中，本發明提供包括如SEQ ID NO1所示序列的肽。
因為已知apf結構域在一些S層蛋白質附著到細菌細胞壁上有作用，apf結構域可以特別有用於將異源蛋白質附著到革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌的細胞表面上。因此，apf結構域可以有用於生產例如含有感興趣蛋白質的功能性食品成分。
因此在一個方面中，本發明提供包括如SEQ ID NO2所示序列的肽。
因為發明人已經發現肽的富含穀氨醯胺區域特別親水，他們意識到該區域可以非常有用於嵌合蛋白或融合蛋白(本文進一步描述)，用來分隔融合蛋白的疏水結構域，從而提高各個疏水結構域的功能。因此，發明人設想富含穀氨醯胺區域將特別有用於革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌表達異源蛋白質。
因此在一個方面中，本發明提供包括如SEQ ID NO3所示序列的肽。
將會明白本發明的肽可以包括如SEQ ID NO1、2、3和4所示序列的一種或多種。
本發明的肽典型地長約175個胺基酸殘基，儘管也可以包括更多胺基酸殘基。當所述肽與分泌信號序列連接時，典型地長約205個胺基酸殘基。
發明人意識到包括一種序列的肽將預期具有在革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌的表面或在來源於它們的培養上清中表達的能力，除了一個或多個胺基酸殘基以外，所述序列與SEQ ID NO5所示的序列基本相同。這些肽能根據本文進一步描述的方法製備。這些肽在細胞表面表達或從細胞表面分泌例如到培養上清中的能力可以通過本文進一步描述的測試來確定。
基於以上內容，將會明白本發明包括具有與SEQ ID NO1、2、3、4、5和6之一所示序列同源的胺基酸序列的肽。這些肽稱為「變體」。除了與SEQ ID NO1、2、3、4、5和6的序列之一具有胺基酸序列同源性以外，所述變體的特徵還在於能夠在革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌的表面或在來源於它們的培養上清中表達，這通過本文所述測試來確定。
胺基酸序列的「同源性」定義為經序列比對和引入必要間隙以達到最大一致性之後，候選序列中與SEQ ID NO1、2、3、4、5和6的序列之一的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。候選序列中N或C端延長或缺失將不被認為降低同源性。序列比對的算法的一個實例是CLUSTAL W。
典型地，變體是例如與SEQ ID NO1、2、3、4、5和6的序列之一具有至少約75％胺基酸同源性的肽。所述變體可以與SEQ ID NO1、2、3、4、5和6的序列之一具有至少80％、更典型地大於85％的序列同源性，例如具有90％的胺基酸同源性。然而，變體可以表現與SEQ ID NO1、2、3、4、5和6的序列具有小於50％的序列同源性而仍保留本文所述變體的特徵。
如本文所述，本發明的肽，包括變體，可以用化學合成方法或重組DNA技術製備。例如，本發明的肽可以用基於依次添加胺基酸殘基的化學合成方法從單體製備，例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149(1963)所述。這些單體可以是天然存在的殘基或非天然存在的殘基，具實例如下所述。作為替代方案，本發明的肽，尤其是變體可以通過處理包括SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示序列的肽經酶學或化學製備。當用重組DNA技術合成所述肽時，它們可以這樣製備隨機或預定突變(如定點PCR突變)編碼SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示胺基酸序列或與SEQID NO1、2、3、4、5和6序列之一具有同源性的序列的核酸分子，在宿主細胞中表達所述序列從而獲得所述肽。這是製備變體特別有用的方法。替代方法是從頭化學合成編碼SEQ ID NO1、2、3、4、5和6序列之一或與SEQ ID NO1、2、3、4、5和6序列之一具有同源性的序列的核酸分子，並在宿主細胞中表達所述序列從而獲得所述肽。
作為SEQ ID NO1、2、3、4、5和6序列之一的變體的本發明肽，典型區別在於這些序列的一個或多個保守性胺基酸替換。保守性替換的實例表示於下表1。
表1

如上所示，本發明的肽可以包括非天然存在的胺基酸殘基。常見的非遺傳密碼編碼的胺基酸包括Glu和Asp的2-氨基己二酸(Aad)；Glu和Asp的2-氨基庚二酸(Apm)；Met、Leu和其它脂肪族胺基酸的2-氨基丁酸(Abu)；Met、Leu和其它脂肪族胺基酸的2-氨基庚酸(Ahe)；Gly的2-氨基異丁酸(Aib)；Val和Leu和Ile的環己基丙氨酸(Cha)；Arg和Lys的高精氨酸(Har)；Lys、Arg和His的2，3-二氨基丙酸(Dpr)；Gly、Pro和Ala的N-乙基甘氨酸(EtGLy)；Asn和Gln的N-乙基天冬醯胺(EtAsn)；Lys的羥賴氨酸(Hyl)；Lys的別羥賴氨酸(allohydroxyllysine，AHyl)；Pro、Ser和Thr的3-(和4)羥脯氨酸(3Hyp，4Hyp)；Ile、Leu和Val的別異亮氨酸(AIle，alloisoleucine)；Ala的ρ-脒基苯丙氨酸；Gly、Pro和Ala的N-甲基甘氨酸(MeGly，肌氨酸)。
Ile的N-甲基異亮氨酸(MeIle)；Met和其它脂肪族胺基酸的正纈氨酸(Nva)；Met和其它脂肪族胺基酸的正亮氨酸(Nle)；Lys、Arg和His的鳥氨酸(Orn)；Thr、Asn和Gln的瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亞碸(MSO)；Phe的N-甲基苯丙氨酸(MePhe)、三甲基苯丙氨酸、滷(F、Cl、Br和I)代苯丙氨酸、三氟苯丙氨酸(triflourylphenylalanine)。
鑑定SEQ ID NO1、2、3、4、5或6所示序列之一中用於產生變體的胺基酸替換的殘基的有用方法稱為內氨酸掃描突變，這描述於Cunningham and Wells(1989)Science，2441081-1085。此處，殘基或靶殘基的組得以鑑定(例如帶電荷的殘基如Glu、Asp、Asn、Gln和Lys)，並用中性或帶負電的胺基酸替換以影響胺基酸與周圍環境的相互作用。然後通過在或為替換位點引入進一步或其它變化進而改進對替換表現功能敏感性的那些結構域。因此，儘管引入胺基酸序列變化的位點被預先確定，突變本身的性質不需要預先確定。例如，為了優化給定位點處突變的性能，可以在靶密碼子或區域進行Ala掃描或隨機突變，並對所表達肽篩選期望活性的優化組合。
蛋白質或肽庫的噬菌體展示提供選擇具有更高或變化親和性、特異性或穩定性的肽的另一種方法(Smith，G，P，(1991)Curr Opin Biotechnol(2668-673))。作為與M13基因III衣殼蛋白的融合體而被以單價方式展示的高親和蛋白(Clackson，T，(1994)et al，Trends Biotechnol 12173-183)可以通過克隆和測序包裝在經多輪結合選擇的噬菌粒顆粒中的相應DNA而得以鑑定。
本發明的肽可以製備為游離酸或鹼或轉化成各種無機和有機酸與鹼的鹽。這些鹽在本發明的範圍內。這些鹽的實例包括銨、金屬鹽如鈉、鉀、鈣和鎂；與有機鹼如二環己基胺、N-甲基-D-葡糖胺等的鹽；和與胺基酸如精氨酸或賴氨酸的鹽。同樣可以製備與無機酸和有機酸的鹽，例如用鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、甲磺酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸等。無毒性和生理相容性鹽特別有用，儘管其它不那麼理想的鹽可以用於分離和純化方法。
所述肽可以包括至少一個碳水化合物分子和/或至少一個脂分子。
所述肽可以包括至少一個烷基。
本發明肽的一種具體應用是用於提供允許異源蛋白質在革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌的表面或在來源於它們的培養上清中表達的融合蛋白。
融合蛋白可通過下述化學合成方法製備，也可以通過重組DNA技術製備，例如其中編碼具有SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示序列的肽的核酸分子與編碼異源蛋白質的基因一起被安排在載體中。載體的表達導致本發明的肽被產生為與所述異源蛋白質的融合體。
包括三大類融合蛋白。第一類是包括具有SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示序列的肽和異源蛋白質的融合蛋白，其中異源蛋白質是抗體片段或另一種高親和分子。這些融合蛋白可以有以下應用結合併滅活微生物毒素；結合併阻斷病原微生物定居決定因子(colonisation determinants)如纖毛、非纖毛粘附素(adhesin)或參與毒力過程的其它細胞表面分子；結合併阻斷作為病原微生物受體的宿主分子；直接殺死微生物；結合到癌細胞以錨定化療化合物；作為體外診斷試劑用於例如ELISA測試；作為體內診斷試劑即顯示活體內的診斷靶；和作為免疫組化試劑。此類異源蛋白質的實例包括以下描述的那些Kruger C，Hu Y，Pan Q，Marcotte H，Hultberg A，Delwar D，van Dalen PJ，Pouwels PH，Leer RJ，Kelly CG，van Dollenweerd C，Ma JK，Hammarstrom L In situ delivery of passive immunity by lactobacilli producingsingle-chain antibodies.Nat Biotechnol.2002 Jul；20(7)702-6；Oggioni MR，Beninati C，Boccanera M，Medaglini D，Spinosa MR，Maggi T，Conti S，Magliani W，De Bernardis F，Teti G，Cassone A，Pozzi G，Polonelli L.Recombinant Streptococcus gordonii for mucosaldelivery of a scFv microbicidal antibody.Int Rev Immunol.2001；20(2)275-87；Souriau C，Hudson PJ.Recombinant antibodies for cancer diagnosis and therapy.2003 Expert OpinBiol Ther Apr；3(2)305-18；Ross JS，Gray K，Gray GS，Worland PJ，Rolfe M.Anticancerantibodies.Am J Clin Pathol.2003 Apr；119(4)472-85；Kreitman RJ.Recombinant toxinsfor the treatment of cancer.Curr Opin Mol Ther.2003 Feb；5(1)44-51。
第二類是包括具有SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示序列的肽和異源蛋白質的融合蛋白，其中異源蛋白質是溶素，如噬菌體溶素。這些特別有用於通過破壞細胞壁而特異性殺死細菌細胞。此類中溶素的實例包括以下描述的那些Fischetti VA.Novel method to control pathogenic bacteria on human mucousmembranes Ann N Y Acad Sci.2003 Apr；987207-14；Schuch R，Nelson D，Fischetti VA.A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis.Nature.2002 Aug 22；418(6900)884-9；Loeffler JM，Fischetti VA.Synergistic lethal effect of a combination ofphage lyric enzymes with different activities on penicillin-sensitive and-resistantStreptococcus pneumoniae strains.Antimicrob Agents Chemother.2003 Jan；47(1)375-7；Gaeng S，Scherer S，Neve H，Loessner MJ.2000.Gene cloning and expression andsecretion of Listeria monocytogenes bacteriophage-lytic enzymes in Lactococcus lactis.Appl Environ Microbiol 662951-8。
第三類是包括具有SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示序列的肽和異源蛋白質的融合蛋白，其中異源蛋白質能誘發抗傳染和疾病的保護性免疫應答。此類中異源蛋白質的實例包括以下描述的那些B.Smith DJ，King WF，Barnes LA，Peacock Z，Taubman MA Immunogenicity and protective immunity induced by synthetic peptidesassociated with putative immunodominant regions of Streptococcus rnutans glucan-bindingprotein.Infect Immun.2003 Mar；71(3)1179-84；Olive C，Clair T，Yarwood P，Good MF.Protection of mice from group A streptococcal infection by intranasal immunisation with apeptide vaccine that contains a conserved M protein B cell epitope and lacks a T cellautoepitope.Vaccine.2002 Jun 21；20(21-22)2816-25；Souza Femandes RC，Sousa deMacedo Z，Medina-Acosta E Expression and purification of the recombinantenteropathogenic Escherichia coli vaccine candidates BfpA and EspB.Protein Expr Purif.2002 Jun；25(1)16-22；Pal S，Davis HL，Peterson EM，de la Maza LM Immunization withthe Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis major outer membrane protein by use ofCpG as an adjuvant induces a protective immune response against an intranasal chlamydialchallenge.Infect Immun.2002 Sep；70(9)4812-7。
將會明白本發明涉及與任意異源蛋白質一起的具有SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示序列的肽的用途，而與異源蛋白質的功能無關。特別有用的是參與誘導免疫耐受和免疫系統功能的其它修飾以及利用非免疫球蛋白蛋白質直接抑制病原體結合的異源蛋白質。具體實例包括具有SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示序列和以下異源蛋白質的融合蛋白(i)屋塵蟎的der p1抗原；或(ii)白細胞介素1受體拮抗劑；或(iii)cyanovirin N；和白細胞介素2或γ幹擾素以及待用作疫苗的異源蛋白質。
融合蛋白可用化學試劑切割，如在甲硫氨酸處切割的溴化氰或在Asn和Gly之間切割的羥胺。用標準重組DNA方法，編碼這些胺基酸的核苷酸鹼基對可以剛好插入編碼期望肽的基因的5』端。
作為替代方案，可以使用蛋白裂解法切割融合蛋白，例如見Carter in ProteinPurificationFrom Molecular mechanisms to Large-Scale Processes，Ladisch et al.，eds.(American Chemical Society Symposium Series No.427，1990)，Ch13，Pages 181-193。
蛋白酶如因子Xa、凝血酶和枯草桿菌蛋白酶或其突變體，和多種其它蛋白酶已經成功用於切割融合蛋白。典型地，將可被所用蛋白酶切割的連接肽插入其他蛋白質(如蛋白A的Z結構域)和本發明的肽之間。用重組DNA方法，編碼連接肽的核苷酸鹼基對被插入編碼其他蛋白質的基因或基因片段之間。然後能在天然的融合蛋白或降低的或變性的融合蛋白上進行含有適當連接的部分純化融合蛋白的蛋白裂解切割。
當作為融合蛋白表達時，本發明的肽可能被不恰當摺疊。並且，含有切割位點的特異性連接肽可以接近或可以不接近蛋白酶。這些因素決定融合蛋白是否必須變性和重摺疊，如果是的話，是在切割之前或之後使用這些方法。
當需要變性和重摺疊時，典型地用離液劑如鹽酸胍處理肽，然後用氧化還原緩衝液處理，使得所述肽摺疊成天然結構，所述氧化還原緩衝液例如含適當比例、pH和溫度的還原和氧化二硫蘇糖醇或穀胱甘肽。
本發明的其它融合蛋白包括本發明的肽與具有長半壽期的蛋白質如免疫球蛋白恆定區或其它免疫球蛋白區域、白蛋白或鐵蛋白融合的那些。
製備融合蛋白的方式的實施例在本文進一步描述。
上述本發明肽可以用化學合成或用重組DNA技術製備。這些方法在本領域公知。化學合成，尤其是固相合成，優選用於短(如少於50個殘基)肽或含有非天然或不常見胺基酸如D-Tyr、鳥氨酸、氨基己二酸等的肽。重組方法優選用於較長肽。當選擇重組方法時，可以從頭構建合成基因或可以通過例如盒(cassette)突變突變天然基因。這些方法在本文進一步描述。下面是本發明的肽化學合成的示例性一般方法。
典型地用固相合成法製備肽，如由Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149(1963)一般性描述的固相合成法，但也可使用本領域已知的其它等價化學合成法。通過偶聯受保護的α-胺基酸到合適樹脂上而從肽的C端開始固相合成。可以通過連接到氯甲基化樹脂或羥甲基化樹脂的酯鍵或連接到BHA樹脂或MBHA樹脂的醯胺鍵來連接α-氨基受保護的胺基酸，以製備這種起始材料。羥甲基化樹脂的製備描述於Bodansky et al.，Chem.Ind.(London)，381597-1598(1966)。氯甲基化樹脂可以從BioRad Laboratories，Richmond，Calif.和從Lab.Systems，Inc.商業獲得。這種樹脂的製備描述於Stewart et al.，「Solid Phase Peptide Synthesis」(Freeman Co.，San Francisco 1969)，Chapter 1，pp.l-6。BHA和MBHA樹脂載體可商業獲得，一般僅在待合成的期望多肽C端具有未取代醯胺時使用。
用本領域公知的形成肽鍵的技術使胺基酸偶聯到肽鏈上。其它方法涉及將胺基酸轉化為其衍生物，該衍生物提供更易與肽片段的游離N端氨基反應的羧基。例如，通過受保護胺基酸與氯甲酸乙酯、氯甲酸苯酯、氯甲酸仲丁酯、氯甲酸異丁酯、新戊醯氯或類似醯氯反應，胺基酸可以轉化為混合酸酐。作為替代方案，胺基酸可以轉化為活化酯，如2，4，5-三氯苯酯、五氯苯酯、五氟苯酯、對硝基苯酯、N-羥基琥珀醯亞胺酯或與1-羥基苯並三唑形成的酯。
另一種偶聯方法涉及使用合適的偶聯劑如N，N1-二環己基碳二亞胺或N，N1-二異丙基碳二亞胺。本領域技術人員熟知的、其它適當偶聯劑公開於E Gross JMeienhofer，The PeptidesAnalysis，Structure，Biology，Vol.IMajor Methods of PeptideBond Formation(Academic Press，New York，1979)。
應該意識到，在偶聯反應期間，肽合成中使用的每個胺基酸的α-氨基必須被保護，以防止涉及活性α-氨基功能的副反應。也應該意識到，某些胺基酸含有活性側鏈官能團(如巰基、氨基、羧基和羥基)，這些功能基也必須用合適的保護基保護，以防止在起始和後續偶聯步驟中在該位點發生化學反應。本領域已知的合適保護基描述於Gross and Meienhofer，The PeptidesAnalysis，Structure，Biology，Vol.3「Protection ofFunctional Groups in Peptide Synthesis」(Academic Press，New York 1981)。
在選擇用於合成肽的特定側鏈保護基時，遵守以下一般規則。α-氨基保護基必須提供在偶聯反應所用條件下的α-氨基功能惰性，偶聯反應後在不去除側鏈保護基和不改變肽片段結構的條件下必須不易去除，並且必須消除偶聯前立即活化時的消旋可能性。側鏈保護基必須提供在偶聯反應所用條件下的側鏈官能團的惰性，必須在去除α-氨基保護基的條件下是穩定的，並且在完成期望胺基酸肽時在不改變肽鏈結構的反應條件下必須容易去除。
本領域技術人員公知，已知用於肽合成的保護基與用於去除它們的試劑的反應活性不同。例如，某些保護基如三苯甲基和2-(對雙苯基)異丙氧羰基(2-(p-biphenylyl)isopropyloxycarbonyl)非常不穩定，可以在弱酸條件下切除。其它保護基如叔丁氧羰基(BOC)、叔戊氧羰基、金剛烷基氧羰基和對甲氧基苄氧羰基較穩定，去除時要求中強酸如三氟乙酸、鹽酸或三氟化硼乙酸溶液。還有另一些保護基如苄氧羰基(CBZ或Z)、滷代苄氧羰基、對硝基苯甲氧羰基、環烷基氧羰基和異丙氧羰基甚至更穩定，去除時要求更強的酸如氟化氫、溴化氫或三氟乙酸硼的三氟乙酸溶液。在這類有用的胺基酸保護基中包括(1)對於α-氨基，(a)芳香性氨基甲酸酯型保護基，如芴基甲氧羰基(FMOC)CBZ和取代CBZ，如對氯苄氧羰基、對-6-硝基苄氧羰基、對溴苄氧羰基和對甲氧基苄氧羰基、間氯苄氧羰基、2，4-二氯苄氧羰基、2，6-二氯苄氧羰基等；(b)脂肪族氨基甲酸酯型保護基，如BOC、叔戊氧羰基、異丙氧羰基、2-(對雙苯基)-異內氧羰基、烯丙基氧羰基等；(c)環烷基氨基甲酸酯型保護基，如環戊基氧羰基、金剛烷基氧羰基和環己基氧羰基；和(d)烯丙基氧羰基。優選的α-氨基保護基是BOX或FMOC。
(2)對於Lys上的側鏈氨基，可以通過上述(1)中所述任意基團保護，如BOC、對氯苄氧羰基等。
(3)對於Arg的胍基，可以用mitro、甲苯磺醯基、CBZ、金剛烷基氧羰基、2，2，5，7，8-五甲基色烷-6-磺醯基或2，3，6-三甲基-4-甲氧基苯磺醯基或BOC進行保護。
(4)對於Ser、Thr或Tyr的羥基，例如可以用C1-C4烷基如叔丁基；苄基(BAL)；取代BZL如對甲氧苄基、對硝基苄基、對氯苄基、間氯苄基和2，6-二氯苄基進行保護。
(5)對於Asp或Glu的羧基，例如可以通過用基團如BZL、叔丁基、環己基、環戊基等酯化進行保護。
(6)對於His的咪唑基氮，適於使用甲苯磺醯基。
(7)對於Tyr的酚羥基，適於使用保護基如四氫吡喃基、叔丁基、三苯甲基、BZL、氯苄基、4-溴苄基或2，6-二氯苄基。優選保護基是2，6-二氯苄基。
(8)對於Asn或Gln的側鏈氨基，優選使用呫噸基(Xan)。
(9)對於Met，該胺基酸優選不予保護。
(10)對於Cys的巰基，典型使用對甲氧苄基。
C端胺基酸如Lys在N-氨基位置通過適當選擇的保護基保護，對於Lys使用BOC。BOC-Lys-OH可以首先根據Horiki et al，Chemistry Letters，165-168(1978)所列方法或用異丙基碳二亞胺在約25℃攪拌2小時偶聯至二苯甲基胺(benzyhydrylamine)或氯甲基化樹脂。BOC保護的胺基酸偶聯到樹脂載體上以後，通過使用三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液或單獨使用TFA除去α-氨基保護基。在約0℃和室溫之間的溫度進行去保護。其它標準切割試劑如二氧六環中的HCl和去除特異性α-氨基保護基的條件已在文獻中描述。
去除α-氨基保護基以後，剩餘的α-氨基和側鏈保護的胺基酸按期望順序逐步偶聯。作為合成中分別添加每個胺基酸的替代方案，有些可以在加到固相合成儀之前互相偶聯。合適偶聯劑的選擇在本領域技術人員的能力範圍內。特別適合的偶聯劑是N，N1-二環己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺。
將每個受保護胺基酸或胺基酸序列過量引入固相反應器中，在二甲基甲醯胺(DMF)或CH2Cl2或其混合物的介質中合適地進行偶聯。如果發生不完全偶聯，偶聯下一個胺基酸之前在除去N-氨基保護基之前重複偶聯步驟。可以監測每個合成階段偶聯反應的成功性。監測合成的優選方法是通過茚三酮反應，如描述於Kaiser，et al.，Anal Biochem，34595(1970)。用公知方法例如BIOSEARCH 9500TM肽合成儀可以自動進行偶聯反應。
預期肽序列完成以後，受保護的肽必須從樹脂載體上切除，並且必須去除所有保護基。同時或分步實現切除反應和去除保護基是合適的。當樹脂載體是氯甲基化聚苯乙烯樹脂時，將肽錨定到樹脂上的鍵是C端殘基的游離羧基與樹脂基質上很多氯甲基之一形成的酯鍵。可以明白通過已知能斷裂酯鍵並能進入樹脂基質的試劑可以切除錨定鍵。
一種特別方便的方法是用液體無水氟化氫處理。這種試劑不僅從樹脂上切除肽，而且將去除所有保護基。因此，使用這種試劑將直接得到完全去保護的肽。當使用氯甲基化樹脂時，氟化氫處理導致形成游離肽的酸。當使用二苯甲基胺樹脂時，氟化氫處理直接導致游離肽的胺。苯甲醚和二甲基硫化物的存在下於0℃與氟化氫反應1小時將同時去除側鏈保護基並從樹脂上釋放肽。
當期望切除肽而不去除保護基時，受保護的肽-樹脂可經歷甲烷解而產生受保護的肽，其中C端羧基被甲基化。然後在溫和鹼性條件下水解甲酯而產生游離C端羧基。然後用強酸如液體氟化氫處理去除肽鏈上的保護基。特別有用的甲烷解技術是下述這種Moore et al.，Peptides，Proc Fifth Amer Pept Symp，M Goodman and J Meienhofer，Eds，(John Wiley，N.Y.，1977)，p.158-521，其中在冠醚存在下用甲醇和氰化鉀處理受保護的肽-樹脂。
當使用氯甲基化樹脂時另一種從樹脂上切除受保護肽的方法是氨解或用肼處理。如果期望，所得C端醯胺或肼可以被水解成游離C端羧基，保護基可以用常規方法去除。
還可以知道，優先在從載體上切除保護肽之前或之後去除N端α-氨基上的保護基。
如果在所產生的肽中與四個非相同取代基鍵合的碳原子是非對稱的，那麼該化合物可作為立體異構體(disastereoisomers)、對映體或其混合物存在。上述合成可使用消旋物、對映體或立體異構體作為起始材料或中間體。從這些合成所得的立體異構體產物可以分別通過層析或結晶方法分離。相類似的，對映體產物混合物可以用相同技術或本領域已知的其它方法分離。當存在非對稱碳原子時，每個非對稱碳原子可以是兩種構型(R或S)之一，兩種都在本發明範圍內。
肽純化典型使用常規方法如製備HPLC(包括反相HPLC)或其它已知層析技術，如凝膠滲透、離子交換、分配層析、親合層析(包括單克隆抗體柱)或逆流分配。
如上述，本發明的肽可以製備成各種無機和有機酸與鹼的鹽。多種方法可用於製備這些鹽，這些方法是本領域技術人員已知的。實例包括肽的游離酸或鹼形式與一或更多摩爾當量的期望酸或鹼在鹽不溶性溶劑或溶劑混合物中反應；或在溶劑如水中反應，反應後通過蒸發、蒸餾或凍幹除去溶劑。作為替代方案，游離酸或鹼形式的產物可以通過離子交換樹脂形成期望的鹽，或者可以用相同的一般性方法將一種鹽形式的產物轉化成另一種。
上述肽化學合成中要求使用的起始材料在文獻中已知，或可以用已知方法和已知起始材料製備。
本發明還提供編碼根據本發明的肽的核酸分子。
在一個方面，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO1、2、3、4、5或6之一所示序列的肽。
典型地，本發明的核酸分子包括SEQ ID NO7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18、19或20所示序列之一，或與SEQ ID NO7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18、19或20所示序列之一互補的序列。
可在高度嚴謹條件下與具有上述核苷酸序列之一的分子雜交的核酸分子作為這種核酸分子的互補鏈特別有用，這種核酸分子可以良好地編碼稱為變體的本發明肽。如本領域公知，核酸分子的雜交可以由用於雜交的緩衝液類型和緩衝液溫度控制。「高嚴謹條件」是其中緩衝液包括約0.1×SSC、0.1％SDS並且溫度約為60℃的條件。
上述核酸分子可以從基因組DNA獲得，例如通過PCR擴增，從基因組文庫、從來源於mRNA的cDNA、從cDNA文庫，或通過用合成來源的核苷酸合成構建DNA序列；(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nded.)，Cold SpringHarbour Laboratory，N.Y.，1989)。
本發明的核酸分子可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、肽核酸或其組合。
本發明還提供包括本發明核酸分子的載體或構建體。
含有SEQ ID NO19或20所示序列的載體對於表達本發明的肽和包括異源蛋白質的融合蛋白特別有用，因為這些序列在革蘭氏陽性細菌如乳桿菌和乳球菌中調節表達。
所述載體或構建體典型通過將本發明的核酸分子插入適當質粒或載體中獲得，其中所述質粒或載體可用於轉化細胞例如宿主細胞。一般來說，含有與所述宿主細胞相容物種來源的複製和控制序列的質粒載體用於和那些宿主聯合使用。載體通常攜帶複製位點，以及編碼能在轉化細胞中提供表型選擇的蛋白質或肽的序列。
特別優選的是允許將核酸分子導入革蘭氏陽性細菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和鏈球菌的載體。這些載體的實例在本文進一步描述。
可用於製備例如融合蛋白構建體的載體是pBR322及其衍生物。pBR322是來源於大腸桿菌的質粒，例如見Mandel et al.，J.Mol.Biol.53154(1970)。pBR322質粒含有氨苄青黴素和四環素抗性基因，從而提供容易的選擇手段。其它載體包括對於表達經常很重要的不同特性，如不同的啟動子。例如，質粒pKK223-3、pDR720和pPL-λ代表當前可用的具有tac、trp或PL啟動子的表達載體(Pharmacia Biotechnology)。
一種有用的載體是pB0475。該載體含有噬菌體和大腸桿菌的複製起點，使得它在這些宿主中穿梭，從而有助於突變和表達，例如見Cunningham et al.，Science，2431330-1336(1989)；U.S.Pat.No.5,580,723。其它有用的載體是pR1T5和pR1T2T(Pharmacia Biotechnology)。這些載體含有隨後是蛋白A的Z結構域的適當啟動子，使得插入載體的基因表達為融合蛋白。
用標準技術通過組合上述載體的相關特性可以構建其它有用的載體。相關特性包括啟動子、核糖體結合位點、抗栓肽(decorsin)或ornatin基因或融合基因(蛋白A的Z結構域和抗栓肽或ornatin及其連接肽)、抗生素抗性標誌和適當的複製起點。
本發明還提供包括上述載體或構建體的細胞。宿主細胞典型地是原核細胞，並且典型地是革蘭氏陽性細菌，如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、明串珠菌或鏈球菌。表2示出一些實例。
表2

原核生物可用於克隆和表達本發明的核酸分子以產生本發明的肽。例如可以使用大腸桿菌K12株294(ATCC No.31446)，以及E.coli B、E.coli X 1776(ATC No.31537)和E.coli c600與c600hfl、E.coli W3110(F-，γ-，原養型/ATCC No.27325)、桿菌屬如枯草桿菌，和其它腸桿菌科如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或粘質沙雷氏菌(Serratia marcesans)及多種假單孢菌屬物種。當由原核生物表達時，本發明的肽可以含有N端甲硫氨酸或甲醯甲硫氨酸並可以不被糖基化。對於融合蛋白，N端甲硫氨酸或甲醯甲硫氨酸可以位於融合蛋白或融合蛋白信號序列的氨基端。
本發明還提供生產本發明肽的方法。該方法包括在使細胞產生所述肽的條件下維持含有上述核酸分子或上述載體或構建體的細胞。
該方法仟選地可以包括回收和/或純化蛋白質的步驟。肽的純化典型地用常規方法如製備HPLC(包括反相HPLC)或其它已知層析技術如凝膠滲透、離子交換、分配層析、親合層析(包括單克隆抗體柱)或逆流分配。
本發明肽的表達在本文進一步描述。其它實例性表達系統包括下表3所述的那些。
表3

Kleerebezem M，Beerthuyzen MM，Vanghan EE，de Vos WM，Kuipers OP.Controlled gene expression systems for lactic acid bacteriatransferable nisin-inducibleexpression cassettes for Lactococcus，Letconostoc，and Lactobacillus spp.Appl EnvironMicrobiol.1997 Nov；63(11)4581-4；Kruger C，Hu Y，Pan Q，Marcotte H，Hultberg A，Delwar D，van Dalen PJ，Pouwels PH，Leer RJ，Kelly CG，van Dollenweerd C，Ma JK，Hammarstrom L.In situ delivery of passive immunity by lactobacilli producing single-chain antibodies.Nat Biotechnol.2002 Jul；20(7)702-6；Perez-Arellano I.Perez-MartinezG.Optimization of the green fluorescent protein(GFP)expression from a lactose-inducible promoter in Lactobacillus casei.FEMS Microbiol Lett.2003 May16；222(1)123-7；Sayijoki K，Kahala M，Palva A.High level heterologous proteinproduction in Lactococcus and Lactobacillus using a new secretion systern based on theLactobacillus brevis S-layer signals.Gene.1997 Feb 28；186(2)255-62；Wells JM，Wilson PW，Norton PM，Gasson MJ，Le Page RW.Lactococcus lactishigh-levelexpression of tetanus toxin fragrnent C and protection against lethal challenge.MolMicrobiol.1993 Jun；8(6)1155-62.


圖1.分析生長於MRS液體培養基中的發酵乳桿菌BR11的培養上清中發現的蛋白質。通過測量600nm光密度24小時監測發酵乳桿菌生長。在各個時間點(由圓圈中數字表示)取等份，離心並過濾上清，用5％TCA沉澱。相當於225μl培養上清的量用SDS-PAGE分析，隨後用考馬斯亮藍G-250染色。箭頭指示Sep。
圖2.His6-Sep融合蛋白在發酵乳桿菌BR11、鼠李糖乳桿菌GG和乳酸乳桿菌(L.lactis)MG1363中的表達和亞細胞定位。上面示出了構建體的結構，它們或者整合入發酵乳桿菌BR11染色體(Sep-6×His-Sep和BspA-6×His-Sep)，或在pGh9:ISS1質粒上導入鼠李糖乳桿菌GG或乳酸乳桿菌MG1363(僅Sep-6×His-Sep)。下面示出了用抗His5抗體對細胞提取物和培養上清中融合蛋白的Western印跡檢測。圖中標出sep終止子(Tsep)和編碼Sep分泌信號的DNA(ssSep)、BspA分泌信號(ssBspA)和His6(灰色框)。單交換同源重組入發酵乳桿菌BR11的sep或bspA基因座位點的DNA區域用散點表示，並在下面用叉號標記。分子量標記物的大小用kDa在左側標示。標示出包含在2×SDS上樣染料(SDS)中煮沸製備、超聲製備(son)和用5MLiCl(LiCl)製備的細胞提取物以及沉澱的上清組分(SN)的泳道。加到每個泳道的細胞或介質的量相當於500μl(SDS)、50μl(son)、160μl(LiCl)和675μl(SN)培養物。
圖3.人E-鈣粘素融合蛋白在發酵乳桿菌BR11中的表達和分泌。上面示出了導入發酵乳桿菌BR11的構建體的結構(Sep-6×His-Ecad和BspA-6×His-Ecad)。下面示出了用抗His5抗體[A、B和C(左側)]對細胞提取物和上清中融合蛋白的Western印跡檢測，和用抗E-鈣粘素抗體[C(右側)]對上清中融合蛋白的檢測。圖中標出bspA終止子(T bspA)和編碼Sep分泌信號的DNA(ssSep)、BspA分泌信號(ssBspA)和His6(灰色框)。單交換同源重組入發酵乳桿菌BR11的sep或bspA基因座位點的DNA區域用散點表示，並在下面用叉號標記。分子量標記物的大小用kDa在左側標示。標示出包含在2×SDS上樣染料(SDS)中煮沸製備、超聲製備(son)和用5MLiCl(LiCl)製備的細胞提取物以及沉澱的上清組分(SN)的泳道。加到每個泳道的細胞或介質的量相當於500μl(SDS)、50μl(son)、160μl(LiCl)和675μl(SN)培養物。對於C部分的Western印跡，每個泳道加入相當於1.2ml培養上清的量，所述培養物來自發酵乳桿菌BR11親本(BR11)或含有BspA-6×His-Eead的發酵乳桿菌(BspA-6×His-Ecad)。
圖4.用Sep表達和分泌信號表達人玻連蛋白。標示出包含在2×SDS-PAGE上樣緩衝液中煮沸製備的細胞提取物(C)和沉澱的上清組分(S)的泳道。加到每個泳道的細胞或介質的量相當於1ml(C)和900μl(S)培養物。
圖5.用於在乳酸菌中表達和分泌Ply511的pSep511sec質粒的特性。pGh9::ISS1的溫度敏感性複製起始(Ts)的起始被用箭頭標出，紅黴素抗性(EmR)標誌基因的方向也用箭頭標出。示出了克隆入pGh9::ISS1的Sep-6×His-Ply511表達構建體，箭頭指示可能的sep啟動子，陰影框指示Sep分泌信號(ssSep)，灰色框指示編碼His6表位的DNA，形狀象棒棒糖的標記指示bspA操縱子的終止子(TbspA)。圖的底部是編碼Sep分泌信號和Ply511的DNA之間連接區的核苷酸和翻譯的胺基酸序列。垂直箭頭指示信號肽切割位點，水平箭頭指示Ply511起始處。
圖6.由乳桿菌屬和乳酸乳桿菌產生的Ply511的表達、分泌和活性分析。(A)用抗His5-HRP偶聯物對乳酸菌細胞提取物(C)和上清(S)中蛋白質的Western印跡檢測。每個泳道所加細胞提取物或介質的量分別相當於500μl和675μl培養物。(B)用高壓滅菌的單核細胞增生性利斯特氏菌作為底物、用復性SDS-PAGE對乳酸菌上清組分的細菌裂解活性檢測。對於每一株，(-)泳道指示含pGh9::ISS1(乳酸乳桿菌、發酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)或野生型(植物乳桿菌)菌株，(+)泳道指示含pSep511sec的菌株。
圖7.生長於含高壓滅菌的單核細胞增生性利斯特氏菌細胞的緩衝瓊脂介質上的乳酸菌株的細胞壁裂解活性。乳酸乳桿菌生長於緩衝GM17E上，含質粒的乳桿菌株生長於含紅黴素的緩衝MRS上，植物乳桿菌野生型生長於沒有紅黴素的緩衝MRS上。
圖8Sep LysM結構域胺基酸序列。
圖9Sep C端(apf)結構域胺基酸序列。
圖10Sep富含穀氨醯胺區。
圖11Sep分泌信號胺基酸序列。
圖12Sep胺基酸序列。
圖13包括分泌信號序列的Sep胺基酸序列。
圖14Sep分泌信號核苷酸序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝ACK＝GT S＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖15Sep LysM結構域核苷酸序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝ACK＝GT S＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖16Sep富含穀氨醯胺區的核苷酸序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CTM＝AC K＝GT S＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖17Sep C端苷酸序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝AC K＝GT S＝GCW＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖18Sep核苷酸序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝AC K＝GT S＝GCW＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖19包括分泌信號編碼序列的Sep核苷酸序列。IUB混合鹼基代碼R＝AGY＝CT M＝AC K＝GT S＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖20Sep分泌信號回譯(backtranslation)序列。IUB混合鹼基代碼R＝AGY＝CT M＝AC K＝GT S＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖21Sep LysM結構域信號回譯序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝ACK＝GT S＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖22Sep富含穀氨醯胺區信號回譯序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CTM＝AC K＝GT S＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖23Sep C端信號回譯序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝AC K＝GTS＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖24Sep回譯序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝AC K＝GT S＝GCW＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖25包括分泌信號的Sep回譯序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝ACK＝GT S＝GC W＝AT H＝ACT B＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖26含有可能的sep啟動子的sep即上遊的310bp核苷酸序列(假想的-35和-10識別六聯體分別用陰影字母和黑體字母表示[注一個-35共有序列也可以是-10共有序列]；假想-10共有六聯體上遊的TG基序用斜體表示；sep核糖體結合位點用下劃線表示)。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝AC K＝GT S＝GC W＝AT H＝ACTB＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
圖27含有sep轉錄終止子(用序列上相對箭頭指示)的sep即下遊的150bp核苷酸序列。IUB混合鹼基代碼R＝AG Y＝CT M＝AC K＝GT S＝GC W＝AT H＝ACTB＝GCT V＝AGC D＝AGT N＝AGCT。
下面參考某些非限制性實施例描述本發明。本領域技術人員將會知道，在不偏離廣泛描述的本發明實質或範圍下可對所述本發明進行很多變化和/或修改。因此，以下實施例將在所有方面被認為是示例性而非限制性的。
實施例1生產Sep發酵乳桿菌BR11在37℃生長於常規MRS液體培養基中，在5個時間點取組分(圖1)。SDS-PAGE分析顯示生長期間多種蛋白質積累於上清中(圖1)。當多種其它蛋白質的水平已經降低時，最小的可見蛋白(箭頭表示)仍然在晚靜止期豐富存在。這種蛋白質稱為小輸出蛋白Sep。考慮到其小，Sep是發酵乳桿菌BR11上清中發現的最豐富的蛋白之一。為進一步表徵Sep，我們鑑定了其N端序列，發現為DTIYTVQSGDTLSGI。Sep是一種205個胺基酸的蛋白質，具有30個胺基酸的N端分泌信號，產生預計為19kDa的成熟蛋白質，等電點為5.3。
實施例2位於Sep啟動子控制下的Sep-E鈣粘素融合蛋白大腸桿菌JM109用於分子克降試驗。氨苄青黴素對於大腸桿菌的使用濃度為100或200μg/ml，而紅黴素對於大腸桿菌的使用濃度為750μg/ml。質粒pUC18、pBluescriptII(KS)和pGEM3zf用於常規克隆。
從由培養的哺乳動物T47D和LNCap細胞製備的cDNA模板，用寡核苷酸E-cad-PstI和E-cad-XhoI，通過PCR擴增編碼成熟E-鈣粘素蛋白的氨基端1-216位胺基酸的區域。該片段按正確讀碼框克隆到編碼Sep分泌信號的DNA下遊，產生構建體Sep-6×His-Ecad。克隆E-鈣粘素DNA片段的序列在密碼子216之後含有引入的終止密碼子，通過DNA測序驗證。用寡核苷酸Term-Xho和Term-Hind擴增假想的bspA轉錄終止子並克隆到編碼E-鈣粘素的DNA下遊。
pJRS233內的構建體轉化入發酵乳桿菌BR11中，如前所述分別用濃度為1或10μg/ml的青黴素作為細胞壁弱化劑(Rush，C.M.，L.M.Hafner，and P.Timms.1994.Genetic modification of a vaginal strainof Lactobacillus fermentum and its maintenancewithin the reproductive tract after intravaginal administration.J.Med.Microbiol.41272-278；McCracken，A.，M.S.Turner，P.Giffard，L.M.Hafner，and P.Timms.2000.Analysis of promoter sequences from Lactobacillus and Lactococcus and their activity inseveral Lactobacillus species.Arch.Microbiol.173383-389)。通過在存在紅黴素選擇下在40℃孵育轉化體，該構建體整合入發酵乳桿菌染色體中sep啟動子下遊。
發酵乳桿菌BR11在厭氧環境下生長於固體MRS培養基(Oxoid，Basingstoke，United Kingdom)上或生長於常規液體培養管中。紅黴素對於發酵乳桿菌的使用濃度為10μg/ml。
從晚對數期或早靜止期培養物製備細胞提取物，從晚指數期培養物獲得上清。如前述(Turner，M.S.，L.M.Hafner，T.Walsh，and P.M.Giffard.2003.Peptide surfacedisplay and secretion using two LPXTG-containing surface proteins from Lactobacillusfermentum BR11.Appl.Environ.Microbiol.695855-5863)使用兩種不同的全細胞蛋白提取方法，它們涉及在2×SDS-PAGE上樣緩衝液中煮沸細胞(Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis.1989.Molecular cloninga laboratory manual，2nded.Cold Spring HarborLaboratory press，Cold Spring Harbor，N.Y.)或超聲。5M LiCl提取細胞和上清組分也如前獲得(Turner 2003)。SDS-PAGE上樣之前，所有樣品煮沸5分鐘。蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上、封閉並用1∶1000稀釋的抗His5單克隆抗體(Qiagen，Hilden，Germany)檢測。洗滌之後，膜與兔抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)偶聯物(Dako，Glostrop，Denmark)一起孵育。結合抗體用HRP化學發光試劑盒(Roche，Mannheim，Germany)檢測。為估計His6蛋白質在提取物中的水平，不同量的His6標記的蛋白質標誌物(Roche，Mannheim，Germany)在樣品旁側一起被包括。這些標誌物在每條帶中具有已知量的含His6的蛋白質，允許用TotalLab v1.11包(Phoretix，Newcastleupon Tyne，United Kingdom)對膜進行光密度分析。為檢測E-鈣粘素，使用濃度1∶750的小鼠抗人E-鈣粘素抗體(來自克隆HECD-1；Zymed Laboratories Inc.)。
E-鈣粘素融合蛋白在來自生長於30℃的SDS細胞提取物和上清中得以檢測(圖2)。上清中該菌株在30℃的E-鈣粘素融合蛋白水平約為30μg/l培養物，和在SDS細胞提取物中約為370μg/l培養物。E-鈣粘素融合蛋白的預計大小是25kDa，然而在Western印跡上由抗His5抗體識別的蛋白質為約38kDa。為確認該蛋白實際上就是E-鈣粘素，使用小鼠抗人E-鈣粘素抗體作為一抗進行Western印跡。抗E-鈣粘素抗體識別的蛋白與用抗His5抗體識別的蛋白質具有相同大小，並且所識別蛋白質在親本發酵乳桿菌BR11菌株的上清中沒有發現。這些結果提示Sep表達和分泌信號可用於發酵乳桿菌中分泌人氨基端E-鈣粘素肽。因為E-鈣粘素的氨基端是引起食物來源疾病的病原體單核細胞增生性利斯特氏菌的主要的腸細胞受體，該構建體可具有作為腸單核細胞增生性利斯特氏菌附著抑制治療劑的潛能。
實施例3位於Sep啟動子控制下的Sep-6×His融合蛋白大腸桿菌JM109用於分子克隆試驗。氨苄青黴素對於大腸桿菌的使用濃度為100或200μg/ml。質粒pUC18、pBluescriptII(KS)和pGEM3zf用於常規克隆。
構建體(Sep-6×His-Sep)出sep上遊的DNA和編碼分泌信號的sep 5』區和六組氨酸(His6)表位(用Nterm-US-Xba和Nterm-Pst-US擴增和克隆)與編碼成熟Sep蛋白的DNA以及假想的sep轉錄終止子(用SepDS-PstXho和SepDS-ApaSal擴增和克隆)組成。構建體(BspA-6×His-Sep)由如上的編碼成熟Sep蛋白的DNA和假想的sep轉錄終止子組成，但作為替代含有編碼全長BspA蛋白的上遊DNA，隨後是如前述(Turner et al.，同上)的編碼BspA分泌信號和His6表位的DNA。在Sep-6×His-Sep構建體中加在Sep的成熟N端的其他胺基酸是DTIYTDHHHHHHSAAGSR，加在Sep-6×His-Sep構建體中的是ASDDVHHHHHHSAAGSR。
這些表達盒在pBluescriptII中構建，然後克隆到XbaI和SalI消化的pJRS233中。pBluescriptII中的Sep-6×His-Sep構建體也用XbaI和SalI消化並克隆到XhoI消化的pGh9:ISS1中。
如前述(Rush，McCracken，同上)，分別用濃度為1或10μg/ml的青黴素作為細胞壁弱化劑，將pJRS233內的構建體轉化入發酵乳桿菌BR11中。通過在紅黴素選擇下在40℃孵育轉化體將嵌合基因整合到sep或bspA啟動子(圖3A和3B)的下遊，從而實現發酵乳桿菌中的表達。
發酵乳桿菌BR11在厭氧環境下生長於固體MRS培養基(Oxoid，Basingstoke，United Kingdom)上或生長於常規液體培養管中。紅黴素對於發酵乳桿菌的使用濃度為10μg/ml。
對於鼠李糖乳桿菌和乳酸乳桿菌，Sep-6×His-Sep構建體轉化入細胞，克隆到pGh9:ISS1質粒中(Maguin，E.，H.Prevost，S.D.Ehrlich，and A.Gruss.1996.Efficientinsertional mutagenesis in lactococci and other gram-positive bacteria.J.Bacteriol.178931-935)。
鼠李糖乳桿菌GG(ATCC 53103)在厭氧環境下生長於固體MRS培養基(Oxoid，Basingstoke，United Kingdom)上或生長於常規液體培養管中。乳酸乳桿菌MG1363在補充0.5％(重量/體積)葡萄糖的M17培養基(GM17)(Oxoid，Basingstoke，UnitedKingdom)中在30℃下生長。紅黴素使用濃度對於鼠李糖乳桿菌為10μg/ml，對於乳酸乳桿菌為5μg/ml。
如前述(Rush，McCracken，2000，同上)，分別用1或10μg/ml的青黴素作為細胞壁弱化劑轉化鼠李糖乳桿菌。如前述(Holo，H.，and I.F.Nes.1989.High-frequencytransformation，by electroporation，of Lactococcus lactis subsp.cremoris grown withglycine in osmotically stabilized media.Appl.Environ.Microbiol.553119-3123)用1％甘氨酸作為細胞壁弱化劑轉化乳酸乳桿菌，只是直接在含5μg/ml紅黴素的GM17板上選擇轉化體。乳酸乳桿菌轉化體生長於30℃，以允許溫度敏感性pGh9:ISS1衍生質粒複製，而鼠李糖乳桿菌轉化體在30℃生長於板上，在30℃或37℃生長於液體中。
細胞分級、蛋白質提取和Western印跡分析如實施例2進行。全細胞上His6表位的可接近性與前述相同地進行(Turner 2003，同上)。
成熟His6-Sep融合蛋白的預測分子量是21kDa，儘管Western印跡上的帶對應28kDa大小的蛋白(圖3A和3B)。在含有Sep-6×His-Sep和BspA-6×His-Sep構建體的發酵乳桿菌中，兩種情況下Sep融合蛋白都是主要在上清中發現，融合蛋白的水平約2mg/l培養物。對於含有Sep-6×His-Sep和BspA-6×His-Sep構建體的發酵乳桿菌，在SDS細胞提取物中的Sep融合蛋白水平分別是上清中所發現水平的約9％和約13％。在超聲或5M LiCl提取物中沒有檢測到Sep融合蛋白。當SDS細胞和上清提取物跑在相鄰泳道時，在SDS-PAGE上Sep融合蛋白帶遷移相同(數據未示出)，這提示與細胞相關的Sep融合蛋白是成熟形式，因此不含有信號序列並位於細胞膜以外。
在鼠李糖乳桿菌和乳酸乳桿菌中，發現上清中從Sep-6×His-Sep構建體表達的Sep融合蛋白水平分別是約200和約300μg/l培養物(圖3C和3D)。對於鼠李糖乳桿菌和乳酸乳桿菌，SDS細胞提取物中的Sep融合蛋白水平分別是上清中發現的＜1％和約10％。有趣的是，在鼠李糖乳桿菌和乳酸乳桿菌的超聲細胞提取物中和乳酸乳桿菌的SDS細胞提取物中都觀察到了稍大分子量的His6反應性蛋白質。此帶可能對應仍然含有分泌信號的Sep融合蛋白。與發酵乳桿菌相似，在含有Sep-6×His-Sep構建體的鼠李糖乳桿菌或乳酸乳桿菌的5M LiCl提取物中沒有檢測到His6-Sep。
為檢測是否Sep暴露於發酵乳桿菌的細胞表面，與前述相同(Turner et al.，通商)進行His6表位的全細胞酶聯免疫吸附測試。發現對於含有BspA-6×His-Sep構建體的發酵乳桿菌細胞每OD600nm單位細胞所獲得的A405nm信號(0.0302+0.0003)顯著高於(1.8倍)發酵乳桿菌BR11細胞(0.0168+0.0007)。該結果提示至少一些與Sep相關的細胞以暴露形式位於發酵乳桿菌的細胞被膜中。
實施例4用Sep的表達和分泌信號在發酵乳桿菌BR11和鼠李糖乳桿菌GG中表達人玻連蛋白此處所用的表達構建體使用Sep表達和分泌信號，使得人玻連蛋白從宿主乳桿菌輸出到培養上清中。成熟玻連蛋白基因從cDNA擴增並用限制酶PstI和XhoI克隆到Sep-6×His-Ecad表達盒中。插入pGh9:ISS1質粒中以後，雜合體轉化入發酵乳桿菌BR11和鼠李糖乳桿菌GG。32℃生長兩天後，分級細胞並用Western印跡分析以檢測帶His6標籤的玻連蛋白。
標示出了包含在2×SDS-PAGE上樣緩衝液中煮沸製備的細胞提取物(C)和沉澱的上清組分(S)的泳道。加到每個泳道的細胞或介質的量相當於1ml(C)和900μl(S)培養物。
成熟的非糖基化His6-玻連蛋白的預計大小是54kDa。對於發酵乳桿菌BR11的克隆，在上清中有清楚的優勢蛋白約52kDa，它可能對應全長玻連蛋白(圖4)。發酵乳桿菌BR11克隆的細胞提取物顯示多個帶，大多較小，可能是玻連蛋白的降解形式。對於鼠李糖乳桿菌GG的克隆，上清組分中有一個優勢帶約47kDa，它可能對應具有小量C端降解的His6-玻連蛋白。
因此，已經顯示Sep在一般認為安全的乳桿菌中表達並分泌大的、富含半胱氨酸的、具有商業重要性的人蛋白。
實施例5乳桿菌表達並分泌活性單核細胞增生性利斯特氏菌噬菌體A511內溶素Ply511材料和方法菌株、質粒和生長條件發酵乳桿菌BR11、鼠李糖乳桿菌GG(ATCC 53103)和植物乳桿菌ATCC 14917在厭氧環境下生長於固體MRS培養基(Oxoid，Basingstoke，UK)上或常規液體培養管中。乳酸乳桿菌MG1363在30℃下補充0.5％(重量/體積)葡萄糖的M17培養基(GM17)(Oxoid，Basingstoke，United Kingdom)中上，適當時在存在紅黴素(GM17E)的條件下生長。大腸桿菌JM109用於分子克隆試驗。氨苄青黴素對於大腸桿菌的使用濃度為100或200μg/ml，而紅黴素使用濃度對於大腸桿菌為500-750μg/ml，對於乳桿菌為10μg/ml，對於乳酸乳桿菌為5μg/ml。用pGh9:ISS1將表達盒導入乳酸菌。質粒pGEM3Zf用於常規克隆。
轉化乳桿菌和乳酸乳桿菌分別用1.25、10和5μg/ml的青黴素作為細胞壁弱化劑轉化發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌。用1％甘氨酸作為細胞壁弱化劑轉化乳酸乳桿菌，只是直接在含5μg/ml紅黴素的GM17板上選擇轉化體。乳酸乳桿菌轉化體(含pGh9:ISS1衍生質粒)生長於30℃，而乳桿菌轉化體(含pGh9:ISS1衍生質粒)在32-33℃生長於板上和液體培養基中。
將ply511構建入Sep分泌表達盒用克隆的ply511作為模板，擴增編碼單核細胞增生性利斯特氏菌噬菌體A511的內溶素Ply511的1-341位胺基酸的DNA。該片段按正確讀碼框克隆到含有Sep-6×His-Ecad表達構建體的質粒pGEM-3Zf中編碼Sep分泌信號的DNA下遊，使得編碼E-鈣粘素的基因片段被ply511基因替換。新質粒命名為pSep-6×His-Ply511。用寡核苷酸SepUS-Eco和Term-Hind-trunc擴增Sep-6×His-Ply511構建體的功能性部分，該1.9kb片段然後用EcoRI和HindIII消化。該片段與相似消化的pGh9:ISS1(除去了ISS1插入序列)連接，連接混合物直接轉化入乳酸乳桿菌。乳酸乳桿菌鋪板於含5μg/ml紅黴素和足量高壓滅菌的單核細胞增生性利斯特氏菌491細胞的GM17瓊脂上，以獲得可視性混濁。兩天後，分泌活性Ply511的克隆可以由菌落周圍透明區的形成而得以檢測。純化來自陽性克隆的質粒，然後用於轉化乳桿菌。
細胞分級、蛋白質提取和Western印跡分析從晚指數或早靜止期培養物製備細胞提取物和上清。通過在2×SDS-PAGE上樣緩衝液中煮沸製備細胞提取物，並如前述用5％三氟乙酸濃縮上清。蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上、封閉並用1∶4000稀釋的抗His5-辣根過氧化物酶(HRP)偶聯抗體(Qiagen，Hilden，Germany)檢測。結合抗體用Lumi-Light化學發光試劑盒(Roche，Mannheim，Germany)檢測。為估計提取物中His6蛋白質的水平，不同量的His6標記的蛋白質標誌物(Qiagen，Glostrop，Denmark)在樣品旁側一起被包括。這些標誌物在每條帶中具有已知量的含His6的蛋白質，允許用TotalLab v1.11包(Phoretix，Newcastleupon Tyne，U.K.)對膜進行光密度分析。
復性SDS-PAGE用4％濃縮膠和含0.5ml單核細胞增生性利斯特氏菌491細胞的10ml 12％分離膠在SDS-PAGE中分離蛋白質，所述491細胞已被高壓滅菌並在spentBHI液體培養基中濃縮100倍。電泳之後，在蒸餾水中洗滌凝膠10分鐘，然後在復性緩衝液(50mMTris-HCl pH8，100mM NaCl和1％Triton-X 100)中在23℃輕輕搖動20小時，其間更換三到四次復性緩衝液。然後用蒸餾水簡單漂洗凝膠，並用0.1％(重量/體積)亞甲基藍的0.01％(重量/體積)KOH溶液染色2小時，通過更換幾次蒸餾水進行脫色。
光密度檢測單核細胞增生性利斯特氏菌細胞壁裂解活性單核細胞增生性利斯特氏菌在BHI中生長過夜，細胞(i)在SM緩衝液中濃縮100倍並冷凍保存，或(ii)高壓滅菌並在spent BHI中濃縮100倍而冷凍保存。為測試分泌的內溶素活性，通過添加100μl 1M Tris-HCl(pH8)到生長到中晚指數期的乳酸菌來源的上清(900μl)中進行緩衝，放入比色杯中。將單核細胞增生性利斯特氏菌底物細胞加入比色杯中，在23℃監測OD600隨時間的任何變化。
檢測瓊脂板上乳酸菌落的ply511分泌將0.3ml 100倍濃縮的高壓滅菌單核細胞增生性利斯特氏菌491加入MRS或GM17瓊脂中，直至15ml(終體積)。也將紅黴素按前述濃度加入瓊脂中(只是瓊脂用於生長植物乳桿菌野生型)用0.2M磷酸鉀緩衝液pH7(終濃度)緩衝瓊脂，終體積保持在15ml。
乳酸菌分泌Ply511殺死單核細胞增生性利斯特氏菌乳酸菌和單核細胞增生性利斯特氏菌QUT 0085生長到中晚指數期，通過離心收穫細胞。乳酸菌在新鮮BHI液體培養基中洗滌兩次，在SM緩衝液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgSO4；pH7.5)中洗滌一次，而單核細胞增生性利斯特氏菌QUT0085在BHI中洗滌一次，在SM緩衝液中洗滌一次。對於乳酸菌按約1010細胞/ml將細胞重懸，對於單核細胞增生性利斯特氏菌QUT 0085按約109細胞/ml重懸。將200微升乳酸菌加到800μl SM緩衝液中，然後與100μl單核細胞增生性利斯特氏菌QUT0085混合，然後在32℃孵育混合物2.5小時，隨後在SM緩衝液中稀釋並鋪板到Oxford瓊脂(Oxoid，Basingham，U.K.)上，以確定存活的單核細胞增生性利斯特氏菌QUT0085。
結果將內溶素基因ply511克隆入Sep分泌表達盒編碼單核細胞增生性利斯特氏菌噬菌體A511的Ply511內溶素的DNA按正確讀碼框克隆到編碼Sep分泌信號的DNA和sep啟動子下遊(圖5)。為幫助檢測表達的蛋白質，His6表位位於Sep分泌信號和異源蛋白質的起始點之間(圖5)。用PCR擴增Sep-6×His-Ply511構建體並消化、連接到相似消化的pGh9::ISS1中。連接反應物轉化入乳酸乳桿菌，細胞鋪板到包括紅黴素和高壓滅菌的單核細胞增生性利斯特氏菌491細胞的GM17上，以檢測Ply511的細胞壁裂解活性。收穫在菌落周圍有透明區的幾個轉化體，並純化它們的質粒。這些克隆中一個來源的質粒被命名為pSep511sec。在發酵乳桿菌BR11、鼠李糖乳桿菌GG、植物乳桿菌ATCC14 917和乳酸乳桿菌(MG1363)中表達和分泌Ply511通過電穿孔將質粒pSep511sec轉化入發酵乳桿菌BR11、鼠李糖乳桿菌GG和植物乳桿菌ATCC 14917。從這些乳桿菌和乳酸乳桿菌轉化體收集細胞提取物和上清組分，並用抗His5-HRP偶聯物進行Western印跡分析。所有菌株都觀察到帶，每個泳道中最大的帶約40kDa，接近His6-Ply511的計算分子量(38.2kDa)(圖6A)。所有菌株在上清組分以及細胞相關組分中都有His6-Ply511。除了鼠李糖乳桿菌以外，所有菌株具有較低分子量的帶，指示可能的蛋白裂解性降解。經Western印跡分析，植物乳桿菌產生最大量的His6-Ply511，全長His6-Ply511的水平估計為約10μg/l培養物。為確定His6-Ply511是否有活性，來自不含質粒、含pGh9::ISS1或含pSep511sec質粒的菌株的上清用復性SDS-PAGE分析。高壓滅菌的單核細胞增生性利斯特氏菌491細胞被引入分離膠中，活性被鑑定為透明帶(圖6B)。在所有來自含pSep511sec的菌株的上清中觀察到約40kDa的帶，但在野生型或含pGh9::ISS1的菌株中沒有發現。在乳酸乳桿菌(約45kDa)和發酵乳桿菌(約52kDa和約70kDa)的上清組分中觀察到另外的內源性較高分子量的透明帶。
乳酸菌分泌Ply511的活性被用0.2M磷酸鉀(pH7)緩衝作用增強為確定乳桿菌和乳酸乳桿菌產生的乳酸是否影響Ply511活性，我們通過加入0.2M磷酸鉀緩衝液(pH7)緩衝含高壓火菌的單核細胞增生性利斯特氏菌491的瓊脂生長培養基。含pSec511sec的乳酸乳桿菌在正常生長介質上產生小透明區，在緩衝生長介質產生大透明區(表5，圖7)。在正常生長介質上，含pGh9::ISS1或pSep511sec的發酵乳桿菌都產生相同的中等大小透明區，而在緩衝生長介質上僅含pSep511sec的發酵乳桿菌產生中等透明區(表5，圖7)。含pGh9::ISS1或pSep511sec的鼠李糖乳桿菌在正常生長介質上不產生透明區，然而，在緩衝生長介質上含pSep511sec的鼠李糖乳桿菌產生大透明區，但含pGh9::ISS1的鼠李糖乳桿菌則不產生(表5，圖7)。含pSep511sec的植物乳桿菌產生小的透明區，而野生型植物乳桿菌不產生。在緩衝生長介質上，含pSep511sec的植物乳桿菌產生小的透明區，但生長非常差，而野生型植物乳桿菌不產生任何透明區，但生長良好(表5，圖7)。
用光度活性測試比較表達Ply511的這些乳桿菌和乳酸乳桿菌菌株的上清的單核細胞增生性利斯特氏菌細胞壁裂解活性。從中到晚對數生長期收集上清，加入0.1MTris-HCl(pH8)緩衝，與單核細胞增生性利斯特氏菌細胞懸液混合併跟蹤600nm吸光度的任何改變。使用這種測試已經發現，所有含pSep511sec的菌株的上清都有內溶素活性。植物乳桿菌具有最大內溶素活性，乳酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌具有中等內溶素活性，而發酵乳桿菌具有最小、但仍可檢測的內溶素活性(數據未示出)。
分泌Ply511的乳酸菌殺死單核細胞增生性利斯特氏菌洗滌過的乳酸乳桿菌(約109細胞)與洗滌過的活的單核細胞增生性利斯特氏菌QUT0085(約108細胞)在SM緩衝液中混合。2.5小時後，系列稀釋物鋪板到Oxford瓊脂上計數活利斯特氏菌，鋪板到GM17E上計數活乳酸乳桿菌。含pSep511sec的乳酸乳桿菌將利斯特氏菌活力降低1.88log CFU/ml。
表4a下劃線指示限制性內切酶識別位點。
bY＝C或T；H＝A、C或T；N＝A、G、C或T

表5生長於有或沒有0.2M磷酸鉀緩衝液的瓊脂板上的乳酸菌的單核細胞增生性利斯特氏菌細胞壁裂解活性a。

a菌落周圍的透明區如下評分無透明區(-)，小但可見的透明區(+)，中等大小的透明區(++)，大透明區(+++)。
b該菌株在緩衝生長介質上生長非常差，但在正常生長介質上生長良好。
本說明書中提及的所有出版物和專利申請指示本發明所屬領域一般技術人員的水平。所有出版物和專利申請都通過參考併入本文，其程度就象每個單獨出版物或專利申請特意單獨通過參考併入一樣。
序列表110昆士蘭科技大學120蛋白質表達130S8076969115020039058861512003-10-2416020170PatentIn Version 3.2210121150212PRT213發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)4001Asp Thr Tle Tyr Thr Val Gln Ser Gly Asp Thr Leu Ser Gly Ile Ser1 5 10 15Tyr Lys Phe Ala Lys Asp Asn Ser Met Ile Asn Asp Leu Ala Lys Lys20 25 30Asn Asn Ile Gln Asp Ile Asn Lys Ile Phe Val Gly Gln Lys Leu Ile35 40 45Ile Lys50210221181212PRT213發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)4002Ser Tyr Thr Ser Asn Ala Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys Ala Trp1 5 10 15Ile Ala Gly Arg Glu Ser Gly Gly Asn Tyr Asn Ala Thr Asn Gly Gln20 25 30Tyr Ile Gly Lys Tyr Gln Leu Ala Ala Ser Tyr Leu Gly Gly Asp Tyr35 40 45Ser Pro Ala Asn Gln Glu Arg Val Ala Asp Gln Tyr Val Ala Ser Arg50 55 60Tyr Gly Ser Trp Thr Ala Ala Gln Gln Phe Trp Gln Ala Asn Gly Trp65 70 75 80Tyr
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220
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221misc_feature222(489)..(489)223任意核苷酸220
221misc_feature222(492)..(492)223任意核苷酸220
221misc_feature222(495)..(495)223任意核苷酸220
221misc_feature222(498)..(498)223任意核苷酸220
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221misc_feature222(525)..(525)223任意核苷酸220
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222(540)..(540)223任意核苷酸220
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權利要求
1.一種肽，包括-LysM結構域，位於肽的N端；-apf樣結構域，位於肽的C端；和-富含穀氨醯胺區，位於LysM和apf樣結構域之間。
2.具有SEQ ID NO1-6中任意一個所示序列的肽。
3.與根據權利要求2的肽具有至少約75％胺基酸序列同源性的肽。
4.根據權利要求2的肽，其還包括異源蛋白質。
5.根據權利要求4的肽，其中所述的異源蛋白質是溶素。
6.根據權利要求4的肽，其中所述的異源蛋白質是玻連蛋白。
7.根據權利要求4的肽，其中所述的異源蛋白質是e-鈣粘素。
8.編碼根據前述權利要求中任意一項的肽的核酸。
9.具有SEQ ID NO7-20中任意一個所示序列的核酸。
10.包括根據權利要求9的核酸的載體。
11.包括根據前述權利要求中任意一項的肽、核酸或載體的細胞。
全文摘要
本發明涉及肽和核酸分子，及其用於生產異源蛋白質、益生生物和功能性食品成分以及產品的用途。
文檔編號C07K14/195GK1894272SQ200480031137
公開日2007年1月10日 申請日期2004年10月22日 優先權日2003年10月24日
發明者馬克·S·特納, 菲利普·M·吉法德 申請人:昆士蘭科技大學